專利名稱：用于檢測高危型hpv 的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測高危型HPV的試劑盒和方法，尤其是一種用于檢測HPV16亞型和HPV18亞型的試劑盒和方法。
背景技術：
臨床研究表明，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)是目前為止唯一明確的致癌病毒，其持續(xù)性感染將導致宮頸癌變和子宮頸上皮內(nèi)瘤變。經(jīng)過近30年的大量研究表明，宮頸的高危型HPV持續(xù)感染是引起宮頸癌及癌前病變的直接原因。預防高危型HPV感染就可以預防宮頸癌前病變，從而避免晚期癌癥發(fā)生。高危型HPV中，其中，HPV16(53%)、HPV18(15%)等的感染是引起宮頸癌變的重要因素，因此進行該病毒的篩查是預防子宮疾病和宮頸癌的最有效方法。目前，臨床上應用的HPV DNA檢測方法主要有以下幾種:雜交捕獲檢測法、PCR檢測法、PCR結合雜交檢測法和ELISA方法。雜交捕獲檢測法的代表產(chǎn)品為QIAGEN(Gaithersburg，Inc.)公司的高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒(Hybrid Capture2 High-Risk HPV DNA Test)。此種方法檢測價格昂貴，無法在基層醫(yī)院普及應用，且該產(chǎn)品只能對13種高危型HPV的DNA進行定性檢測，檢測覆蓋病毒型別較少，在HPV篩查檢測中應用有一定的局限性。

近年來發(fā)展了實時熒光PCR(Real-time PCR)檢測方法。實時熒光PCR技術使PCR擴增和產(chǎn)物分析的全過程均在單管封閉條件下進行，并通過微機控制，實現(xiàn)了對PCR擴增產(chǎn)物進行實時動態(tài)檢測和自動分析結果，PCR與雜交共享的方法避免了單純使用PCR所造成的假陽性，進一步提高了檢測的特異性。但此種方法檢測HPV的型別一般只包括一部分常見高危型別的HPV，檢測型別覆蓋范圍較小，且配套設備價格昂貴，同樣無法在基層醫(yī)院普及。PCR結合雜交檢測法進行基因診斷靈敏、快捷，結果可靠。核酸雜交法的靈敏度和特異性均顯著高于傳統(tǒng)的檢測方法，并且可應用特異性探針對HPV分型，已有的商業(yè)化檢測試劑盒產(chǎn)品包括人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)和人乳頭狀瘤病毒核酸擴增分型檢測試劑盒。這些試劑盒在檢測的同時還對所檢測到的病毒進行分型，方便臨床診斷，但由于HPV 16和18兩種亞型是最主要的高危病毒亞型，因此對于每份樣品如果都使用能夠區(qū)分出各種亞型的試劑盒或基因芯片來檢測的話，無疑會造成資源的浪費。此外，還有歐洲Innogenetics的INNO-LiPA HPV分型試劑盒、羅氏(Roche)的Line Blot HPV試劑盒，是以條形膜作傳統(tǒng)雜交分型，也相當費時而手段繁復。以ELISA類型分析方法如羅氏(Roche)的AMPLICOR HPV MWP試劑盒因為穩(wěn)定性、靈敏度等問題，未能得到廣泛應用。有鑒于此，需要提供一種更加便利、實用、穩(wěn)定和節(jié)約型的檢測方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種特異性檢測樣品中是否存在HPV 16亞型或18亞型的試劑盒，所述試劑盒包括:(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于擴增HPV16亞型DNA的第一引物對；(ii)如SEQ ID N0:3和4所示的用于擴增HPV18亞型DNA的第二引物對；以及(iii)如SEQ ID N0:5和6所示的用于與擴增產(chǎn)物雜交的一對探針或與SEQ ID N0:5和6所示的序列互補的序列的一對探針。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的試劑盒中還包含(iv)如SEQ ID NO: 7和8所示的用于擴增人類β_球蛋白基因的片段的引物對；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于與人類β-球蛋白擴增產(chǎn)物特異性結合的探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述引物均在5’端標記有生物素。在優(yōu)選的實施方式中，所述探針均在5’端連接有氨基。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的試劑盒中還包含(V)如SEQ ID NO: 10所示的一段3’端經(jīng)生物素修飾的隨機寡核苷酸探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述樣品為宮頸脫落細胞、液基細胞學標本或石蠟組織切片。在優(yōu)選的實施方式中，所述PCR擴增所用的模板DNA為5 ng至100 ng。在優(yōu)選的實施方式中，所述PCR的擴增條件為95°C 9 min ； 95°C 20 s、55°C 30s ,72°C 30 s，共 40 個循環(huán)；72°C 5 min ；4 °C保存。在優(yōu)選的實施方式中，所述PCR擴增的各步變溫速率為1°C /S。本發(fā)明另一方面提供了一種檢測樣品中是否存在HPV 16亞型和18亞型的方法，所述方法包括:(a)提取樣品的DNA ； (b)使用SEQ ID NO:1至4的引物對所提取的DNA進行PCR擴增；(c)利用導流雜交技術使用SEQ ID NO: 5和6的探針與PCR擴增的產(chǎn)物進行雜交；以及(d)通過顯色反應識別是否發(fā)生雜交反應從而確定樣品中是否存在HPV 16亞型和18亞型。在優(yōu)選的實施方式中，步驟(b)還包括使用SEQ ID NO: 7和8所示的用于擴增人類β_球蛋白基因的片段的引物對，并在步驟(c)中使用如SEQ ID NO: 9所示的用于與人類β_球蛋白擴增產(chǎn)物特異性結合的探針。在優(yōu)選的實施方式中，步驟(C)還包括使用SEQ ID NO: 10所示的一段3’端經(jīng)生物素修飾的隨機寡核苷酸探針作為對照。本發(fā)明方法和試劑盒采用PCR結合雜交檢測法，PCR技術擴增HPV DNA,擴增產(chǎn)物通過導流雜交技術與低密度DNA芯片進行反向點雜交，檢測結果轉化成肉眼可識讀信號。此方法和試劑盒用于檢測樣本中是否含有高危型(包括16型和18型)HPV DNA，但對HPV不作具體分型。本發(fā)明在一個實驗點上同時檢測16型和18型HPVDNA，只要檢測樣本里包含HPV16型和/或18型DNA，并達到一定的檢測限，檢測結果即為陽性。試劑盒的反應簡單，靈敏度高，通量高，并且減少實驗操作時間和雜交試劑用量，適用于HPV16、18型感染的臨床篩查。


下面結合附圖和具體實施方式
，對本發(fā)明及其有益技術效果進行進一步說明。
圖1顯示HPV檢測陰性和陽性結果判讀信號位置。圖2是本發(fā)明的一個實施例中HPV16、18的臨床樣本檢測結果。圖3是本發(fā)明的一個實施例中試劑盒的檢測結果。圖4是本發(fā)明的另一個實施例中試劑盒的檢測結果。
具體實施例方式本發(fā)明利用DNA擴增和“導流”反向點雜交技術來實現(xiàn)。首先，利用生物素標記的引物來擴增HPV基因組特異片段；然后，通過“導流”雜交方法，使生物素標記的擴增片段被特異性寡核苷酸探針雜交捕獲，而后進行信號放大，以識別檢測結果。
實施例本發(fā)明提供一種檢測高危型HPV的試劑盒及其檢測方法，所述方法主要包括以下步驟:(a)提取樣品的DNA ； (b)使用SEQ ID NO:1至4的引物對所提取的DNA進行PCR擴增；(c)利用導流雜交技術使用SEQ ID NO: 5和6的探針與PCR擴增的產(chǎn)物進行雜交；以及(d)通過顯色反應識別是否發(fā)生雜交反應從而確定樣品中是否存在HPV 16亞型和18亞型。以下以宮頸脫落細胞為例，具體說明本發(fā)明的方法。但應理解的是，本發(fā)明的試劑盒和方法仍可適用于其他臨床樣品。(I)樣品/標本采集及保存
以無菌棉拭子或?qū)m頸刷刷取患者的宮頸脫落細胞，以及用于活檢的組織標本或疣組織，置于低溫冰箱(_70°C或-20°C )保存。(II) DNA 提取
加入Iml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取全部液體轉至1.5ml離心管中，12000rpm離心5分鐘,去上清,沉淀用QIAampc Blood Mini試劑盒(QIAGEN)按照Blood and bodyFluid Spin操作規(guī)程進行DNA的提取。將提純DNA存放在_20°C _15°C備用。(III)目的DNA的擴增
每個PCR反應的總體積是25 μ I,反應體系如下表I所示。表1.PCR反應體系
權利要求
1.一種特異性檢測樣品中是否存在HPV16亞型或18亞型的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括:(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR擴增HPV16亞型DNA的第一引物對；(ii)如SEQ ID N0:3和4所示的用于PCR擴增HPV18亞型DNA的第二引物對；以及(iii)如SEQ ID NO: 5和6所示的用于與PCR擴增產(chǎn)物雜交的一對探針或與SEQ ID NO: 5和6所示的序列互補的序列的一對探針。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含(iv)如SEQID NO:7和8所示的用于PCR擴增人類β-球蛋白基因的片段的引物對；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于與人類β_球蛋白擴增產(chǎn)物特異性結合的探針。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述引物均在5’端標記有生物素。
4.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包含(V)如SEQIDNO: 10所示的一段3’端經(jīng)生物素修飾的隨機寡核苷酸探針。
5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述探針均在5’端連接有氨基。
6.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述樣品為宮頸脫落細胞、液基細胞學標本或石蠟組織切片。
7.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述樣品為宮頸脫落細胞。
8.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR擴增所用的模板DNA為5ng至 100 ng。
9.根據(jù)權利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述PCR的擴增條件為95°C9 min ；95°C 20 s、55°C 30 s ,72°C 30 s，共 40 個循環(huán)；72°C 5 min ;4°C保存。
10.根據(jù)權利要求8所 述的試劑盒，其特征在于:所述PCR擴增的各步變溫速率為1°C/S。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性檢測樣品中是否存在HPV16亞型和18亞型的試劑盒，所述試劑盒包括(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR擴增HPV16亞型DNA的第一引物對；(ii)如SEQ ID NO:3和4所示的用于PCR擴增HPV18亞型DNA的第二引物對；以及(iii)如SEQ ID NO:5和6所示的用于與PCR擴增產(chǎn)物雜交的一對探針或與SEQ ID NO:5和6所示的序列互補的序列的一對探針。本發(fā)明在一個實驗點上同時檢測16型和18型HPVDNA，只要檢測樣本里包含HPV16型和/或18型DNA并達到一定的檢測限，檢測結果即為陽性。試劑盒的反應簡單，靈敏度高，通量高，并且可減少實驗操作時間和雜交試劑用量，適用于HPV16、18型感染的臨床篩查。
文檔編號C12Q1/68GK103173564SQ201110432629
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權日2011年12月21日
發(fā)明者曾慶, 張中滿, 張穎芬, 羅曉蘭 申請人:廣州好芝生物科技有限公司