專利名稱：具有反硝化性能的反硝化產堿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株具有反硝化性能的反硝化產堿菌，及其在生物處理氮氧化物中的應用。背景技術：
硝酸鹽經各種途徑輸入水系，促使了富營養(yǎng)化的發(fā)展，水域污染越來越嚴重。這些營養(yǎng)鹽類來自工農業(yè)廢水的排放，也來自麥田沖入的化學肥料以及畜牧糞便等方面。硝酸鹽在正常的健康人體中能很快地被腸道吸收，食物和人腸胃中的微生物可使硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，可導致嬰幼兒變性血紅蛋白血癥,此外,硝酸鹽在人體中會轉化成為亞硝胺,這是一種致突變、致畸、致癌物，對人體具有嚴重的潛在威脅，所以現在各國對飲水中硝態(tài)氮含量有比較嚴格的規(guī)定。因此研究硝態(tài)氮的凈化技術就顯得十分迫切和重要。
傳統理論認為只有在缺氧條件下反硝化酶系才具有活性，但后來一些學者研究發(fā)現有些細菌可以在有O2的條件下進行反硝化作用，如Alcaligenes faecalis、Thiosphaera pantotropha、Pseudomonas nautical、Microvirgula aerodenitr if icans 等。國內關于好氧化硝化菌的篩選與研究還處于起步階段，對解決亞硝酸態(tài)氮積累的研究更為少見，經檢索專利和其他相關文獻，尚未發(fā)現利用本發(fā)明中的反硝化產堿菌(Alcaligenes denitrif icans) TB降解硝酸鹽的報道。該降解菌的發(fā)現對工業(yè)廢水中硝酸鹽等污染物的高效凈化具有重要意義。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、耐受能力強的具有硝酸鹽降解能力的反硝化產堿菌及其用途。
本發(fā)明采用的技術方案是
一株具有反硝化性能的反硝化產堿菌(Alcaligenes denitrif icans) TB,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號 CCTCC NO M 2011368，保藏日期 2011 年 10 月 28 日。
該菌株的特征為菌落顏色為白色，菌落呈小型單個菌落，凸起，不透明，表面光滑，邊緣整齊。透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為長桿菌，具有鞭毛，革蘭氏染色陰性，氧化酶陽性，接觸酶陽性。它生長最適pH值為9，最適溫度為30°C。該菌株16S rDNA序列如SEQ ID No. I 所示。
本發(fā)明還涉及所述的反硝化產堿菌TB在生物處理氮氧化物中的應用。氮氧化物指的是只由氮、氧兩種元素組成的化合物。常見的氮氧化物有一氧化氮(NO，無色)、二氧化氮(NO2，紅棕色)、笑氣(N20)、五氧化二氮(N2O5)等，其中除五氧化二氮常態(tài)下呈固體外，其他氮氧化物常態(tài)下都呈氣態(tài)。作為空氣污染物的氮氧化物(NOx)常指NO和NO2，本發(fā)明中亦是指NO和NO2。
具體的，所述菌株用于處理含有氮氧化物的廢水或廢氣，廢水中氮氧化物以酸根形式如NO3-離子形式存在。
優(yōu)選的，所述菌株用于處理含有no3_的廢水。具體的，所述應用為將所述反硝化產堿菌TB經培養(yǎng)獲得的菌懸液投入到含NO3-的廢水中，在20 40°C、pH 4 9，好氧條件下培養(yǎng)。反硝化產堿菌TB接種量以0D600為0. 4的菌液計優(yōu)選為I 2% (v/v)。
本發(fā)明的有益效果主要體現在本發(fā)明提供了一種高效、耐受能力強的具有硝酸鹽降解能力的反硝化產堿菌及其應用，該菌株在4d內能對初始濃度為260mg/L的硝酸根去除率達到93%，該降解菌的發(fā)現對工業(yè)廢水中硝酸鹽的高效凈化具有重要意義。

圖I為Alcaligenes denitrif icans TB的透射電鏡照片和革蘭氏染色照片；
圖2 為 Alcaligenes denitrif icans TB 的系統發(fā)育樹圖3不同pH下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比較；
圖4不同接種量下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比較；
圖5不同碳源下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比較；
圖6不同C/N下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比較；具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
實施例I :Alcaligenes denitrif icans TB的分離、純化及其鑒定
I. Alcaligenes denitrif icans TB 的分離及純化
Alcaligenes denitrif icans TB是從浙江省杭州市七格污水處理廠的活性污泥中篩得的反硝化菌誘變得到的一株革蘭氏陰性菌。具體步驟如下
取浙江省杭州市七格污水處理廠的活性污泥中篩得的反硝化菌。將篩得的菌種制成菌懸液，取3mL菌懸液移入直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿中，放一無菌磁力轉子,置于磁力攪拌器上，30W紫外燈下30cm處照射lmin。在紅外燈下取照射過的菌液0. ImL涂布于平板培養(yǎng)基上，用黑布包好平板，30°C恒溫培養(yǎng)3d。
配制篩選培養(yǎng)基，配制方法如下琥珀酸鈉IOOOOmg L_S KH2PO4IOOOmg L—1， K2HPO4IOOOmg L-1，MgSO4. 7H20 200mg I71，CuSO4Img I71，FeSO4Img L' MnS045mg I71， Na2MoO4Img I71，ZnCl22mg I71，NaNO3IOOOmg L'溶劑為水，pH 7. 2，121°C滅菌 20min。待培養(yǎng)基冷卻后，將突變菌株接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2d，挑取有藍色暈圈的菌株。將篩選出的菌株接種于以硝酸鈉或亞硝酸鈉為唯一氮源的培養(yǎng)基中，30°C，120r miiT1振蕩培養(yǎng)。
配制LB固體培養(yǎng)基,配制方法如下NaCl IOOOOmg I71,酵母膏5000mg I71,蛋白胨 IOOOOmg I71，pH 7. 2，瓊脂 20000mg I71，溶劑為水；121°C滅菌 20min。結合 LB 平板劃線分離，挑取單菌落接入LB固體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，直到獲得在上述培養(yǎng)基中生長快、菌落規(guī)則和性狀穩(wěn)定的反硝化單菌TB (即CCTCC NO M 2011368)。
2. Alcaligenes denitrif icans TB 的鑒定
通過16S rRNA序列分析和生理生化實驗鑒定，確定TB菌為Alcaligenes denitrificanso具體步驟如下
采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(V2. 2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和純化菌的DNA，4°C保存。選用細菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20對純化的 DNA進行PCR擴增，弓I物序列分別為
BSF8/20 :5' -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'
BSR1541/20 :5' -AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'
PCR反應程序設定為先94°C預變性4min ;然后94°C變性lmin，59°C退火lmin， 72°C延伸I. 5min，循環(huán)35個周期；然后72°C延伸IOmin ;最后4°C保持lOmin。將PCR產物進行測序(上海英濰捷基)，測序結果見序列表。
將PBT的16S rDNA序列上傳到Genbank，獲得Genbank的登錄號JQ044686，同時同Genbank中的基因序列進行同源性比較,發(fā)現其屬于Alcaligenes屬，與Alcaligenes denitrif icans (Y14907)同源性最高，達到99 %，圖2為該菌的系統發(fā)育樹圖。為了進一步確定鑒定結果的可靠性，經過生理生化實驗，最終確定TB屬于Alcaligenes denitrificans。因此,將該菌命名為 Alcaligenes denitrif icans TB。
實施例2 Alcaligenes denitrif icans TB 反硝化性能檢測
I.考察不同初始pH條件下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能
在不同初始pH下實施Alcaligenes denitrif icans TB反硝化實驗,發(fā)現其在pH9 具有較高的反硝化能力，從實際應用角度看，PH9為最佳pH，此時降解率最高，具體實施步驟如下
以硝酸根為唯一氮源(NO3-濃度400mg I71)，按I %接種量加入D600為0. 4的菌液于培養(yǎng)基(琥珀酸鈉 3050mg L' KH2PO4IOOOmg I71，K2HPO4IOOOmg I71，MgSO4. 7H20 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg L1, Na2MoO4Img L1, ZnCl22mg L1, NaN03550mg L—1，溶劑為水)，中(pH值從5 9設5個梯度)，30°C，120rpm振蕩培養(yǎng)。
結果如圖3所示，菌株TB對弱酸的環(huán)境適應性相對較差，但當pH達到9時，菌株 TB的反硝化率達到93%。
2.考察不同接種量下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化特性
在不同接種量下實施Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化實驗,結果表明其最佳接種量為1.5% (v/v)，具體實施方案如下
分以硝酸根為唯一氮源(N03_濃度按(0. 5 % 4 % 5個接種量梯度)加入D600為0.4的菌液于培養(yǎng)基(琥珀酸鈉3050mg L-1，KH2PO4IOOOmg L-1， K2HPO4IOOOmg L-1，MgSO4. 7H20 200mg I71，CuSO4Img I71，FeSO4Img L' MnS045mg I71， Na2MoO4Img I71，ZnCl22mg I71，NaN03550mg I71，溶劑為水)中，30°C，120rpm 振蕩培養(yǎng)。
結果如圖4所示，數據表明，當接種量大于1%時，由于剛開始時培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質充足，接種量多少直接影響到底物降解，反硝化率隨著接種量的增加而緩慢上升，當接種量為I. 5%時，反硝化率分別達到68. 5%和69. 7%，而隨著接種量的繼續(xù)增加，在降解菌之間形成了對營養(yǎng)物質的競爭關系，因此反硝化率出現減小的現象。由圖可知，菌株TB的最佳接種量為I. 5%左右。
3.考察不同碳源下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化特性
在不同碳源下實施Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化實驗,結果表明其最佳碳源為葡萄糖，具體實施方案如下
分以硝酸根為唯一氮源(NO3-濃度400mg L—1)，按I %接種量加入D600為0. 4的菌液于培養(yǎng)基A、B、C、D、E (詳見附)中(分別加入5種碳源，C/N為10)，30°C，120rpm振蕩培養(yǎng)。
結果如圖5所示。菌株TB對葡萄糖的降解率相對高一些，對碳酸氫鈉的降解率最低。有報道稱甲醇的反硝化率是很高的，其作為易于生物降解的低級醇類，極易被反硝化細菌所利用。但本實驗中甲醇的利用率相對較低，這可能是在相同碳氮比下甲醇加入培養(yǎng)基的量要高于其它4種碳源，使培養(yǎng)基中甲醇毒性變大，而造成菌株的不適應
4.考察不同 C/N 下菌 Alcaligenes denitrif icans TB 的反硝化特性
在不同C/N下實施Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化實驗,結果表明其最佳C/N為10左右，具體實施方案如下
分以硝酸根為唯一氮源(NCV濃度400mg I71)，按I %接種量加入D600為0. 4的菌液于培養(yǎng)基Ap Bp Cp Dp E1 (詳見附)中(C/N從8 12設5個梯度)，30°C，120rpm振蕩培養(yǎng)。
結果如圖6所示當C/N < 10時，由于碳源對對菌體的生長和反硝化效率起著重要的作用，碳源不足，就沒有足夠的電子流來提供足夠的能源以供菌體生長，所以菌株TB 的反硝化率隨著C/N的增加而緩慢的增加，隨著C/N的繼續(xù)增加，由于提供的碳源遠高于菌體需求，碳源已是非限制性因素，菌體的生長和代謝活性處于穩(wěn)定階段，但相對來說菌體的生長速率大于代謝速率，更多的氮源被用于生長，代謝活動相對受到抑制，所以菌株TB的反硝化率減小。從實驗結果可以看出，最佳C/N為10左右。
附培養(yǎng)基組分
A :琥珀酸鈉 3050mg L' KH2PO4IOOOmg I71，K2HPO4IOOOmg I71，MgSO4. 7H20 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg L1, Na2MoO4Img L1, ZnCl22mg L1, NaN03550mg I71，溶劑為水；
B :甲醇 241Omg .L^KH2PO4IOOOmg .L^K2HPO4IOOOmg T1jMgSO4. 7H20 200mg .I71， CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L \ Na2MoO4Img *L 1, ZnCl22mg *L ^NaNO3SSOmg *L 1, 溶劑為水；
C :乙醇 1731mg ^171, KH2PO4IOOOmg 噸―1, K2HPO4IOOOmg T1jMgSO4. 7H20 200mg .I71， CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L \ Na2MoO4Img *L 1, ZnCl22mg *L ^NaNO3SSOmg *L 1, 溶劑為水；
D :葡萄糖 2485mg L' KH2PO4IOOOmg I71，K2HPO4IOOOmg I71，MgSO4. 7H20 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg L1, Na2MoO4Img L1, ZnCl22mg L1, NaN03550mg I71，溶劑為水；
E :碳酸氫鈉 632Img L' KH2PO4IOOOmg I71，K2HPO4IOOOmg I71，MgSO4. 7H20 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg L1, Na2MoO4Img L1, ZnCl22mg L1, NaN03550mg I71，溶劑為水；
A1 :琥珀酸鈉 2440mg L' KH2PO4IOOOmg I71，K2HPO4IOOOmg I71，MgSO4. 7H20 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg L1, Na2MoO4Img L1, ZnCl22mg L1, NaN03550mg I71，溶劑為水；
B1 :琥珀酸鈉 2745mg L' KH2PO4IOOOmg I71，K2HPO4IOOOmg I71，MgSO4. 7H20200mg L I, CuSO4Img L \ FeSO4Img .L1, MnS045mg NaN03550mg I71，溶劑為水；
C1 :琥珀酸鈉 3050mg L' KH2PO4IOOOmg 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg NaN03550mg I71，溶劑為水；
D1 :琥珀酸鈉 3355mg L' KH2PO4IOOOmg 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg NaN03550mg I71，溶劑為水；
E1 :琥珀酸鈉 3660mg L' KH2PO4IOOOmg 200mg L i, CuSO4Img L1, FeSO4Img L1, MnS045mg NaN03550mg I71，溶劑為水。L S Na2MoO4Img .L1, ZnCl22mg .L1, I71，K2HPO4IOOOmg L S Na2MoO4Img L 1 I71，K2HPO4IOOOmg L S Na2MoO4Img L 1 I71，K2HPO4IOOOmg L S Na2MoO4Img L 1I71，MgSO4. 7H20 ZnCl22mg L1,I71，MgSO4. 7H20 ZnCl22mg L1,I71，MgSO4. 7H20 ZnCl22mg L1,
權利要求
1.一株具有反硝化性能的反硝化產堿菌(Alcaligenes denitrificans)TB,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號=CCTCC NO M 2011368，保藏日期2011年10月28日。
2.如權利要求I所述的反硝化產堿菌TB，其特征在于該菌株16SrDNA序列如下CTT ACACATGCAGTCGAACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTG CCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTAGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCGCAA GACCTTGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTA GCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT TTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGG CAGGAAAGAAACGTCGCGGGTTAATACCCCGCGGAACTGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAA GAAAGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTG GAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACAC TGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACT AGCTGTTGGGGTCTTCGGACCTTGGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATT AAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTT ACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATG GCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAA AGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGG TAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAACCCGA TCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGG TGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAAC CGCAAGGAGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAA。
3.如權利要求I所述的反硝化產堿菌TB在生物處理氮氧化物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述菌株用于處理含有氮氧化物的廢水或廢氣。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述菌株用于處理含有N03_的廢水。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述應用為將所述反硝化產堿菌TB經培養(yǎng)獲得的菌懸液投入到含NO3-的廢水中，在20 40°C、pH4 9，好氧條件下培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具有反硝化性能的反硝化產堿菌，及其在生物處理氮氧化物中的應用。保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵政編碼430072，保藏編號CCTCC NOM2011368，保藏日期2011年10月28日。本發(fā)明提供了一種高效、耐受能力強的具有硝酸鹽降解能力的反硝化產堿菌及其應用，該菌株在4d內能對初始濃度為260mg/L的硝酸根去除率達到93％，該降解菌的發(fā)現對工業(yè)廢水中硝酸鹽的高效凈化具有重要意義。
文檔編號C12N1/20GK102533596SQ20111043275
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權日2011年12月21日
發(fā)明者朱濱歡, 蔣軼鋒, 陳建孟, 陳浚 申請人:浙江工業(yè)大學