專利名稱：纖維素酶水解纖維素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維酶解領(lǐng)域，特別涉及一種纖維素酶水解纖維素的方法。
背景技術(shù)：
纖維素(cellulose)是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機溶劑， 是植物細胞壁的主要成分。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花的纖維素含量接近100%，為天然的最純纖維素來源。一般木材中， 纖維素占40 50%，還有10 30%的半纖維素和20 30%的木質(zhì)素。麻、麥稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。纖維素是重要的造紙原料。此夕卜，以纖維素為原料的產(chǎn)品也廣泛用于塑料、炸藥、電工及科研器材等方面。纖維素是通過生命現(xiàn)象、光合作用等生物方式轉(zhuǎn)化過來的物質(zhì)，包括樹木、草類、 農(nóng)作物秸稈等。在科研領(lǐng)域，纖維素被劃歸為新能源、環(huán)境友好新技術(shù)，它將對人類生活帶來的深刻影響可能超出了多數(shù)人的想象。對解決當(dāng)今世界所面臨的環(huán)境污染、糧食短缺、資料資源緊張和能源危機等問題有著重大的意義。纖維素大分子的基環(huán)是D-葡萄糖以β -1，4糖苷鍵組成的大分子多糖，分子量約 50000 2500000，相當(dāng)于300 15000個葡萄糖基脫水葡萄糖，其分子式為(C6H1005)n， 其化學(xué)組成含碳44. 44%、氫6. 17%、氧49. 39%。由纖維素降解產(chǎn)生的纖維素酶可以用做飼料添加劑、用于紡織業(yè)、用于中草藥可提高其有效成分的提取、用于提高酒和其他釀造產(chǎn)品的產(chǎn)率、用于蔬菜汁或果汁的生產(chǎn)以及工業(yè)生產(chǎn)等廣泛的用途。因此，纖維素的降解一直是人們研究的熱點。纖維素大分子的降解的方式有酸水解降解、氧化降解、生物降解、熱降解、機械降解、離子輻射降解等多種途徑.其中酶法水解是一種較為可行的途徑，目前采用生物資源酶解纖維素的方法有纖維素不易降解、纖維素轉(zhuǎn)化效率不高等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種纖維素酶水解纖維素的方法，采用本發(fā)明方法可以高效地降解纖維素，酶解率可達60-80%左右，為推動纖維素的大規(guī)模應(yīng)用，緩解能源匱乏危機提供基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的纖維素的酶解方法，有以下步驟1)將植物秸桿粉碎至60-80目； 2)取粉碎的植物秸桿80-100克，加入到500-600mL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液中；3)加熱40-45°C，加入2. 5-3. Og纖維素酶粉；4)再加入所用植物秸桿重量03. -0. 8%的激活劑，在45°C水浴中保溫反應(yīng)48小時后，即將纖維素進行酶解。所述激活劑為CaCl2或SiSO4。
所述磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液的pH = 4-5。所述植物秸桿含水量為10-30 %，纖維素含量為73 %。本發(fā)明所述方法將纖維素原料充分粉碎，以克服秸稈中的木質(zhì)素的障礙，降低天然纖維素的聚合度和結(jié)晶度，提高天然纖維素對纖維素酶解的敏感性。采用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液，使得纖維素酶水解在PH = 4-5的弱酸性條件下進行(模擬福壽螺胃中PH值)，有利于纖維素晶體結(jié)構(gòu)破壞，提高纖維素酶酶解活力，使纖維素酶水解充分，大大提高纖維素酶水解效率，酶解率可達60-80%左右。纖維素酶解后產(chǎn)物是低分子糖，更利于纖維素的大規(guī)模利用，如利用酶解后的產(chǎn)物葡萄糖產(chǎn)生酒精等。本發(fā)明將化學(xué)、物理、仿生等多種技術(shù)方法有機地結(jié)合起來，探求其真正的酶解反應(yīng)體系，形成物理化學(xué)、和仿生技術(shù)一體化酶解優(yōu)化體系，對纖維素的大規(guī)模應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實和理論意義。


圖1為DNS法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中，Y = 0. 0003X X 葡萄糖含量(μ g/mL)Y 吸光度值。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明不僅限于這些例子。一 .試劑和材料植物秸稈采用含水量為10-30%，纖維素含量為73%的麥稈、稻草、高粱桿、甘蔗
渣等；纖維素酶粉(活力大于10000U. g—1)購自上海生化制品有限公司；DNS試劑的配制準(zhǔn)確稱取酒石酸鉀鈉36. 4g，3，5_ 二硝基水楊酸1. 26g, NaOH4. 2g，苯酚1. 0g，無水亞硫酸鈉1. 0g。將酒石酸鉀鈉溶于IOOml蒸餾水中，加熱(不超過50°C )，依次加3，5- 二硝基水楊酸，NaOH，苯酚，無水亞硫酸鈉于熱溶液中，攪拌至溶解完全，冷卻后定容至200ml，貯存于棕色瓶子中，在避光處保存。磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液的配制分別稱取磷酸二氫鈉2.84g，檸檬酸 2. 101g，分別定容至100mL。吸取88. 74mL磷酸二氫鈉溶液和91. ^mL檸檬酸混合，調(diào)pH值為4. 5-4. 8 (模擬福壽螺胃中pH值)。其它試劑均采用市售的化學(xué)純產(chǎn)品。二.纖維素的酶解1、將植物秸桿粉碎，60-80目待用，其中含水量為10-30%，纖維素含量為73%。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測定纖維素的轉(zhuǎn)化效率DNS法原理DNS法即3，5_ 二硝基水楊酸比色法的英文簡稱。其原理是3，5_ 二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物-3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比。2. 1、DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取經(jīng)105°C烘干至恒重的無水葡萄1. 0000克，配成10mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。分別吸取10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. OmL于50mL容量瓶中， 用蒸餾水制成每毫升分別含有葡萄糖200μ g、400y g、600y g、800y g、1000y g、1200y g 的標(biāo)準(zhǔn)液。各取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液0. 5mL于試管中，加磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液1. 5mL, DNS 試劑3mL于沸水浴中沸騰7min，取出后立即加入蒸餾水IOmL混勻，冷卻后，于紫外分光光度計550nm處比色，以所得的光密度OD值為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)的葡萄糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1空白的制作以0. 5mL蒸餾水代替0. 5mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。Cx酶活力=A (分光度值對應(yīng)的葡萄糖含量)X 2/30 (u/mL)2. 2酶活定義及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線在40°C，pH4. 8條件下，定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μ g葡萄糖的酶量為一個酶活力單位U。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，用Excel進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 3纖維素酶的酶活力的測定用pH = 4. 8的醋酸緩沖溶液配制羧甲基纖維素鈉溶液。稱取0. 5g羧甲基纖維素鈉，加入50mlpH = 4. 8的醋酸緩沖液，加熱使其均勻溶解。準(zhǔn)確稱取Ig酶粉，用蒸餾水定容至一定體積，配制成稀釋酶溶液。在試管中加入1.5mll%羧甲基纖維素鈉溶液。再加入0.5ml稀釋酶液。在40士 1°C水浴中保溫反應(yīng)30min后，立即加入:3ml DNS試劑?？瞻讓φ找河?. 5mll%羧甲基纖維素鈉溶液加入:3ml DNS試劑，再加入0. 5ml稀釋酶液。同時在沸水浴中反應(yīng)7min，加入IOml蒸餾水。以空白對照液調(diào)零點，在λ max = 550nm下，用分光光度計測量吸光度值。Cx酶活力=A (分光度值對應(yīng)的葡萄糖含量μ g) X 2/30 (u/ml)3、在500mLpH = 4. 8的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液中加入步驟1所述的粉碎植物秸桿100克，加熱40-45°C使植物秸桿均勻。準(zhǔn)確加入2. 5g纖維素酶粉(活力大于 10000U. g—1)，加入植物秸桿重量的0. 5%激活劑氯化鈣或SiSO4,在45°C水浴中保溫反應(yīng)48 小時，立即加入30mL DNS試劑，同時在沸水浴中反應(yīng)7min，即完成對纖維素酶水解。3. 1激活劑氯化鈣的纖維素酶水解后酶活測定空白對照液用1.5ml 1 %羧甲基纖維素鈉溶液加入:3ml DNS試劑，再加入0. 5ml稀釋酶液。同時在沸水浴中反應(yīng)7min，加入IOml蒸餾水。以空白對照液調(diào)零點，在λ max = 550nm下，用分光光度計測量吸光度值。取步驟3得到的纖維素酶水解液做Ca2+離子(氯化鈣溶液)的酶活測定，見表2。表2添加Ca2+離子的酶活測定
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶水解纖維素的方法，其特征在于有以下步驟1)將植物秸桿粉碎至60-80目；2)取粉碎的植物秸桿80-100克，加入到500-600mL的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液中；3)加熱40-45°C，加入2.5-3. Og纖維素酶粉；4)再加入所用植物秸桿質(zhì)量0.3%-0.8的激活劑，在45°C水浴中保溫反應(yīng)48小時后， 即將纖維素酶水解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶水解纖維素的方法，其特征在于所述激活劑為 CaCl2 或 ZnSO4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶水解纖維素的方法，其特征在于所述磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液的PH = 4-5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維素酶水解纖維素的方法，有以下步驟1)將植物秸稈粉碎至60-80目；2)取粉碎的植物秸稈80-100克，加入到500-600mL的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液中；3)加熱40-45℃，加入2.5-3.0g纖維素酶粉；4)再加入所用植物秸稈質(zhì)量0.3％-0.8的激活劑，在45℃水浴中保溫反應(yīng)48小時后，即將纖維素進行酶解。本發(fā)明方法可以高效地降解纖維素，酶解率可達60-80％左右，為推動纖維素的大規(guī)模應(yīng)用，緩解能源匱乏危機提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12P19/14GK102517357SQ20111041872
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者王萬能 申請人:重慶理工大學(xué)