專(zhuān)利名稱(chēng)：用于拯救麻疹病毒的組合物、試劑盒、用途及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于拯救麻疹病毒的組合物、含該組合物的試劑盒、該組合物的用途及拯救麻疹病毒的方法。
背景技術(shù)：
麻疫病毒(measles virus, MV)是副粘病毒科麻疫病毒屬(morbiIIivirus)的成員，是一種含有未分段的線(xiàn)狀單鏈RNA的有包膜病毒，其通過(guò)呼吸道飛沫小滴，或者接觸感染。易感人群對(duì)麻疹的發(fā)病率幾乎達(dá)到100%，因此麻疹病毒是在全世界范圍內(nèi)引起高度傳染性疾病的病毒之一 。國(guó)內(nèi)所用的麻疹疫苗株為滬191 (S191)株(NCBI編號(hào):EU435017.1)，該病毒株是在1960年從上海的I例2歲男麻疹患者的血液中分離得到的。滬191株生產(chǎn)的麻疹疫苗穩(wěn)定性良好，其臨床安全性和免疫原性均良好，有效性和安全性已經(jīng)得到明確的肯定，是中國(guó)麻疹疫苗的主要生產(chǎn)株。麻疹病毒疫苗接種能激發(fā)持久的免疫應(yīng)答，帶來(lái)長(zhǎng)期的保護(hù)作用，遺傳性穩(wěn)定同時(shí)無(wú)致病性的返祖現(xiàn)象。但最初制備麻疹疫苗的工藝復(fù)雜，需要在不同的細(xì)胞系中傳代許多次才能得到減毒的毒株，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。RNA病毒反向遺傳學(xué)的興起促進(jìn)了 RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立和發(fā)展，這使得能夠利用負(fù)鏈RNA病毒的cDNA來(lái)進(jìn)行病毒的拯救(Schell MJ, Mebatsion T, ConzelmannKK.1nfectious rabie s virus from clone cDNA.EMBO J.1994,13:4195-4203),從而利用拯救出的病毒研究病毒的分子特征、致病機(jī)理、病毒與宿主之間的相互作用，以及開(kāi)展新型減毒活載體疫苗的研究，或者用來(lái)制備疫苗。利用如此拯救出的病毒進(jìn)行疫苗制備將大大縮短制備時(shí)間，而且可為研究者提供一種輸送治療基因的載體，甚至研制出一種新型的致弱活病毒嵌合疫苗。鑒于負(fù)鏈RNA病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，以及其可以為進(jìn)一步的研究如致病機(jī)理、減毒機(jī)理研究提供研究平臺(tái)的前景。Inoue K等利用RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)成功拯救了狂犬病毒(Inoue K, Shoji Y, Kurane I, Iijima T, Sakai T, Morimoto K.An improvedmethod for recovering rabies virus from cloned cDNA.J Virol Methods.2003,107(2):229-36)，但其所使用的載體質(zhì)粒為pcDNA3.1，其在拯救負(fù)鏈RNA病毒方面存在一些不足，并且該文獻(xiàn)報(bào)道的拯救體系和方法較為復(fù)雜，拯救難度較大。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明基于廣泛使用的麻疹病毒減毒疫苗株具有的無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，提供了一種用于拯救麻疹病毒的組合物，以及拯救麻疹病毒的方法。具體而言，本發(fā)明提供了:(I) 一種用于拯救麻疫病毒(measles virus)的組合物,該組合物包含:I)重組轉(zhuǎn)錄載體，其含有麻疹病毒全基因組cDNA，其中所述麻疹病毒全基因組的5’端和3’端分別包含具有自我剪切功能的核酶序列；
2)第一重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的核衣殼蛋白的編碼基因；3)第二重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的磷蛋白的編碼基因；和4)第三重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的RNA聚合酶的編碼基因。(2)根據(jù)⑴所述的組合物，其中所述轉(zhuǎn)錄載體、所述第一重組表達(dá)載體、所述第二重組表達(dá)載體、所述第三重組表達(dá)載體的比例范圍為:(3.5 4): (I 1.5): (0.1): (0.2 I)。(3)根據(jù)(I)所述的組合物，其中所述5’端的具有自我剪切功能的核酶序列為錘頭狀核酶序列、并且/或者所述3’端的具有自我剪切功能的核酶序列為丁肝病毒核酶序列。(4)根據(jù)(3)所述的組合物，其中所述重組轉(zhuǎn)錄載體具有如圖1所示的pVAXm-mvfull質(zhì)粒的物理圖譜、所述第一重組表達(dá)載體具有如圖2所示的pVAXm-N質(zhì)粒的物理圖譜、所述第二重組表達(dá)載體具有如圖3所示的pVAXm-P質(zhì)粒的物理圖譜、并且/或者所述第三重組表達(dá)載體具有如圖4所示的pVAXm-L質(zhì)粒的物理圖譜。(5)根據(jù)(I)所述的組合物，所述麻疹病毒為中國(guó)麻疹疫苗株S191。(6) 一種試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)(I)至(5)中任意一項(xiàng)所述的組合物。(7)根據(jù)(I)至(5)中任意一項(xiàng)所述的組合物在拯救麻疹病毒中的用途。(8)根據(jù)(I)至(5)中任意一項(xiàng)所述的組合物在制備麻疹疫苗中的用途。

(9) 一種拯救麻疹病毒的方法，該方法包括:將根據(jù)(I)至(5)中任意一項(xiàng)所述的組合物共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，從而進(jìn)行麻疹病毒的拯救。(10)根據(jù)(9)所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:1.本發(fā)明提供了一種用于拯救麻疹病毒的組合物，其能夠簡(jiǎn)單方便地拯救麻疹病毒，并且所拯救的麻疹病毒可用于制備麻疹疫苗。2.本發(fā)明提供的用于拯救麻疹病毒的組合物中還進(jìn)一步優(yōu)化了共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體的比例，利用共轉(zhuǎn)物以?xún)?yōu)化的比例接種VeiO細(xì)胞后，可觀察到細(xì)胞發(fā)生較為明顯的CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))融合病變，即病毒侵染VeiO細(xì)胞后產(chǎn)生明顯的細(xì)胞形態(tài)上的變化，并且以第一代拯救病毒為毒種感染Vero細(xì)胞后，間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示Vero細(xì)胞中有部分細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)綠色熒光，并且以第三代拯救病毒為毒種感染Vero細(xì)胞后，獲得了同樣的陽(yáng)性結(jié)果，這證實(shí)所拯救的病毒獲得了感染性，因此本發(fā)明獲得了優(yōu)異的病毒拯救效果。3.本發(fā)明優(yōu)選對(duì)pVAXl載體質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建，pVAXl的優(yōu)點(diǎn)在于:本研究所用的轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體PVAXl是美國(guó)FDA認(rèn)可的可應(yīng)用于核酸疫苗的表達(dá)載體，其通過(guò)對(duì)pcDNA3.1載體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行一系列的優(yōu)化而獲得，這些優(yōu)化包括:1)去除了 pcDNA3.1載體中對(duì)基因復(fù)制和對(duì)外源蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)的序列，這樣盡可能地降低了載體序列與人類(lèi)基因的同源性，因此大大降低了與染色體整合的可能性；2)將pcDNA3.1載體上的氨芐抗性基因換成了卡那霉素抗性基因，這類(lèi)抗生素不易引起人體過(guò)敏反應(yīng)，更適宜各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此夕卜，由于去除了 pcDNA3.1上的一些結(jié)構(gòu)序列，使得PVAXl載體比pcDNA3.1和其他載體更小、更利于轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。4.本發(fā)明通過(guò)基因合成技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)pVAXl載體質(zhì)粒的突變改造，簡(jiǎn)化了拯救體系和流程，縮短了制備時(shí)間，適于研究、工業(yè)應(yīng)用以及應(yīng)急制備。


圖1為pVAXm-mvfull質(zhì)粒的物理圖譜；圖2為pVAXm-N質(zhì)粒的物理圖譜；圖3為pVAXm-P質(zhì)粒的物理圖譜；圖4為pVAXm-L質(zhì)粒的物理圖譜；圖5為示出在293T細(xì)胞、Vero細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中蛋白N(A)、P(B)、L(C)瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果圖；圖6為示出利用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的共轉(zhuǎn)染比例拯救獲得的麻疹病毒感染細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果圖；圖7為示出采用本發(fā)明的組合物使麻疹病毒從cDNA獲得感染性的過(guò)程的示意圖。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式
的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。副粘病毒科為一組不分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒，共分為兩個(gè)亞科:副粘病毒亞科和肺病毒亞科。其中副粘病毒亞科由三個(gè)屬組成:副粘病毒屬、麻疹病毒屬和腮腺炎病毒屬。副粘病毒亞科的成員為球型有包膜病毒，基因組長(zhǎng)約15.5kb，與同為RNA病毒的彈狀病毒、絲狀病毒一起構(gòu)成單負(fù)鏈病毒家族(Mononegavirales)。副粘病毒均為單鏈RNA病毒，病毒得結(jié)構(gòu)基因序列串聯(lián)排列，各基因間均由基因間保守序列隔開(kāi)，結(jié)構(gòu)基因數(shù)目在不同病毒間有所差別，其中麻疹病毒為六個(gè)?；蚪M(-)RNA與病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(即核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)和RNA聚合酶蛋白(L))緊密結(jié)合，構(gòu)成螺旋形核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體。這種(-)RNP復(fù)合體即為病毒自然增殖過(guò)程中的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板?；蚪M3’端具有RNA聚合酶啟動(dòng)子，各結(jié)構(gòu)基因間的非編碼區(qū)具有停止信號(hào)(終止轉(zhuǎn)錄及腺苷酸化信號(hào))及再啟動(dòng)信號(hào)，這樣產(chǎn)生各結(jié)構(gòu)基因的mRNA。在mRNA翻譯并且翻譯產(chǎn)物堆積到一定程度后，RNA聚合酶忽略基因間信號(hào)，從而復(fù)制出完整的RNP模板,造成通讀(read-through),從而產(chǎn)生全長(zhǎng)的反基因組(+)RNP。通讀的前提條件是新合成的N蛋白與新生的RNA鏈之間不斷結(jié)合。(+)RNP反過(guò)來(lái)作為(-)RNP合成的模板。對(duì)正鏈RNA病毒而言，無(wú)論是提供通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄cDNA而獲得的RNA，還是提供自身表達(dá)的來(lái)自DNA的RNA，其均可以自行產(chǎn)生感染性的后代，因?yàn)樵摬《韭懵兜腞NA本身即具有感染性。因此對(duì)正鏈RNA病毒而言，建立基于轉(zhuǎn)錄載體的反向遺傳系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單。而對(duì)負(fù)鏈RNA病毒而言，無(wú)論是基因組的負(fù)鏈(-)RNA，還是反基因組的正鏈(+)RNA，都不具有感染性。想要獲得有功能的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板，(+)RNA還必須與三個(gè)或四個(gè)病毒蛋白結(jié)合，從而組成(+)RNP，其在相同的輔助蛋白的作用下復(fù)制成(-)RNP。(_)RNP—旦形成，其便可以作為病毒自然感染周期的起始模板，導(dǎo)致子代病毒產(chǎn)生。因此，拯救負(fù)鏈RNA病毒的關(guān)鍵是獲得有功能的RNP。

在本文中，術(shù)語(yǔ)“拯救病毒”(或“病毒拯救”)是指，利用病毒的全長(zhǎng)cDNA為模板，構(gòu)建含有病毒全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，利用宿主的RNA聚合酶系統(tǒng)合成病毒RNA，并且使其具有感染性的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“感染性克隆”是指能夠拯救病毒的遺傳材料，一般為在體外轉(zhuǎn)錄載體中含有整個(gè)病毒基因組cDNA，或在輔助質(zhì)粒的作用下，使該cDNA本身或者從該cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性。本發(fā)明提供了一種用于拯救麻疹病毒的組合物，并在此基礎(chǔ)上提供了一種拯救麻疹病毒的方法。本發(fā)明人對(duì)構(gòu)建感染性克隆的載體質(zhì)粒進(jìn)行突變改造，使得麻疹病毒全基因組序列和/或結(jié)構(gòu)蛋白N、P、L的編碼序列能夠被分別克隆入該改造好的載體質(zhì)粒，并且獲得進(jìn)行病毒拯救的轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體。通過(guò)將上述轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞來(lái)拯救病毒(參見(jiàn)圖7)。在共轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體的比例，獲得了優(yōu)異的病毒拯救效果。具體而言，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種組合物，其至少包括一個(gè)含有麻疹病毒全基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄載體和三種表達(dá)載體，所述三種表達(dá)載體分別為第一重組表達(dá)載體(含有麻疹病毒的核衣殼蛋白的編碼基因)、第二重組表達(dá)載體(含有麻疹病毒的磷蛋白的編碼基因)和第三重組表達(dá)載體(含有RNA聚合酶的編碼基因)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄載體”是指，包含外源插入的核酸分子的載體，其僅能夠使目的基因轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指，在轉(zhuǎn)錄載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件(如啟動(dòng)子、RBS、終止子等)，從而使目的基因能夠表達(dá)的載體。術(shù)語(yǔ)“載體質(zhì)?！笔侵覆话庠床迦氲暮怂岱肿拥沫h(huán)狀DNA分子。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄載體、第一重組表達(dá)載體、第二重組表達(dá)載體、第三重組表達(dá)載體的比例范圍為:(3.5 4): (I 1.5): (0.1): (0.2 I)。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄載體、第一重組表達(dá)載體、第二重組表達(dá)載體、第三重組表達(dá)載體的比例為:4.0: 1.5: 0.1: 0.5。優(yōu)選地，需要將外源核酸分子插入載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，因此需要對(duì)所插入的核酸分子進(jìn)行改造，包括在其5’端和3’端分別引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。在本發(fā)明中，在 轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞之后啟動(dòng)病毒的自我復(fù)制過(guò)程。優(yōu)選地，本發(fā)明的麻疹病毒全基因組的5’端和3’端分別可包含具有自我剪切功能的核酶序列。這些核酶序列通過(guò)自我剪切而避免了在轉(zhuǎn)錄本兩端具有多余的非病毒基因組序列，從而獲得精確的麻疹病毒基因組轉(zhuǎn)錄本cDNA，進(jìn)而利于病毒啟動(dòng)自我復(fù)制過(guò)程而并實(shí)現(xiàn)病毒拯救。具有3’端自我剪切功能的核酶的例子包括發(fā)卡核酶、RNaseP、丁肝病毒核酶、錘頭狀核酶，其中優(yōu)選為錘頭狀核酶。具有5’端自我剪切功能的核酶的例子包括發(fā)卡核酶、RNaseP、丁肝病毒核酶、錘頭狀核酶，其中優(yōu)選為丁肝病毒核酶。在本發(fā)明中，可以使用的轉(zhuǎn)錄載體的載體質(zhì)粒的例子包括本領(lǐng)域中常用的載體質(zhì)粒,例如 pBluescript、pC1、pGEM、pUC119/118、pVAXl 等)，其中優(yōu)選為 pVAXl。在本發(fā)明中，可以使用的表達(dá)載體的載體質(zhì)粒的例子包括本領(lǐng)域中常用的載體質(zhì)粒,例如 pCMV-script、pC1、pVAX l、pcDNA3.1 等，其中優(yōu)選為 pVAXl。pVAXl 是美國(guó) FDA 認(rèn)可的可應(yīng)用于核酸疫苗的表達(dá)載體，其通過(guò)對(duì)pcDNA3.1載體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行一系列的優(yōu)化而獲得，這些優(yōu)化包括:1)去除了 PCDNA3.1載體中對(duì)基因復(fù)制和對(duì)外源蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)的序列，這樣盡可能地降低了載體序列與人類(lèi)基因的同源性，因此大大降低了與染色體整合的可能性；2)將pcDNA3.1載體上的氨芐抗性基因換成了卡那霉素抗性基因，這類(lèi)抗生素不易引起人體過(guò)敏反應(yīng)，更適宜各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，由于去除了 PCDNA3.1上的一些結(jié)構(gòu)序列，使得PVAXl載體比pcDNA3.1和其他載體更小、更利于轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。可以對(duì)載體質(zhì)粒pVAXl的原有序列進(jìn)行改造，將其第34位堿基T突變?cè)O(shè)計(jì)為G，第50位堿基A突變?cè)O(shè)計(jì)為T(mén)，從而消除MluI酶切位點(diǎn)和SpeI酶切位點(diǎn)，并且將其第725-730位堿基序列AGCTCG突變?cè)O(shè)計(jì)為ACGCGT，從而使該載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中具有Mlu I酶切位點(diǎn)。可以通過(guò)全基因合成來(lái)改造設(shè)計(jì)好的載體質(zhì)粒序列，也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它常規(guī)方法(如設(shè)計(jì)引物以進(jìn)行基因突變)來(lái)進(jìn)行改造。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組轉(zhuǎn)錄載體具有如圖1所示的pVAXm-mvfull質(zhì)粒的物理圖譜、第一重組表達(dá)載體具有如圖2所示的pVAXm-N質(zhì)粒的物理圖譜、第二重組表達(dá)載體具有如圖3所示的pVAXm-P質(zhì)粒的物理圖譜、并且/或者第三重組表達(dá)載體具有如圖4所示的PVAXm-L質(zhì)粒的物理圖譜。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述重組轉(zhuǎn)錄載體包含轉(zhuǎn)錄框，其中包含的元件為:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、待轉(zhuǎn)錄基因序列和BGHpAz終止子。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該轉(zhuǎn)錄框在5'至3'方向上可操作地連接有:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、緊鄰CMV啟動(dòng)子的錘頭狀核酶序列、麻疹病毒全基因組cDNA序列、丁型肝炎病毒核酶序列和BGHpAz終止子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一重組表達(dá)載體包含表達(dá)框，其中包含的元件為:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、待表達(dá)基因序列和BGHpAz終止子。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該表達(dá)框在5'至3'方向上可操作地連接有:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、緊鄰CMV啟動(dòng)子的核蛋白(N) DNA序列和BGHpAz終止子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二重組表達(dá)載體包含表達(dá)框，其中包含的元件為:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、待表達(dá)基因序列和BGHpAz終止子。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該表達(dá)框在5'至3'方向上 可操作地連接有:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、緊鄰CMV啟動(dòng)子的磷蛋白(P) DNA序列和BGHpAz終止子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第三重組表達(dá)載體包含表達(dá)框，其中包含的元件為:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、待表達(dá)基因序列和BGHpAz終止子。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該表達(dá)框在5'至3'方向上可操作地連接有:pUC復(fù)制起始子、CMV啟動(dòng)子、緊鄰CMV啟動(dòng)子的RNA聚合酶蛋白(L)DNA序列和BGHpAz終止子。在本發(fā)明中，麻疹病毒可以為(例如):中國(guó)麻疹疫苗株S191和中國(guó)麻疹疫苗株CC-47，其中優(yōu)選為中國(guó)麻疹疫苗株S191。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明的組合物可以用于拯救麻疹病毒。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以用于制備麻疹疫苗。目前，我國(guó)還沒(méi)有利用反向遺傳技術(shù)來(lái)獲得成功拯救的麻疹減毒病毒，進(jìn)而利用其生產(chǎn)疫苗。本發(fā)明的組合物能夠成功拯救麻疹病毒，并獲得麻疹疫苗株(如S191)，進(jìn)而填補(bǔ)國(guó)內(nèi)在這方面的空白。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種拯救麻疹病毒的方法，該方法包括:將本發(fā)明的組合物共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，從而進(jìn)行麻疹病毒的拯救。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行了突變改造，并構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄載體和三種表達(dá)載體(其中轉(zhuǎn)錄載體含有麻疹病毒全基因組cDNA，所述三種表達(dá)載體分別含有麻疹病毒的核衣殼蛋白的編碼基因、磷蛋白的編碼基因和RNA聚合酶的編碼基因)。本發(fā)明人還篩選出了適合進(jìn)行麻疹病毒拯救的宿主細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入篩選出的宿主細(xì)胞中，從而進(jìn)行麻疹病毒的拯救，并檢測(cè)了麻疹病毒的拯救。優(yōu)選地,這樣進(jìn)行宿主細(xì)胞的篩選:利用Western-Blot檢測(cè)所述蛋白N、P和L在宿主細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，如果能夠成功表達(dá)N、P、L三種蛋白，則認(rèn)為該宿主細(xì)胞適合進(jìn)行麻疹病毒的拯救。可以根據(jù)上述方法對(duì)本領(lǐng)域已知的細(xì)胞進(jìn)行篩選，例如對(duì)293T細(xì)胞、VeiO細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞進(jìn)行了篩選。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其中的293T細(xì)胞能夠成功表達(dá)N、P兩種蛋白。由于L蛋白的表達(dá)量小，因此利用目前的檢測(cè)方法未能在上述三種細(xì)胞中檢測(cè)到L蛋白的表達(dá)，但后續(xù)的對(duì)拯救麻疹病毒的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明293T細(xì)胞能夠成功拯救該病毒，因此使用293T細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。在本文中，293T細(xì)胞是指人胚腎傳代細(xì)胞；Vero細(xì)胞是指非洲綠猴腎傳代細(xì)胞；BHK21細(xì)胞是指幼倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞。如上文所述，在拯救諸如麻疹病毒這樣的單負(fù)鏈RNA病毒時(shí)，需要將包含麻疹病毒全基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄載體和三種分別包含結(jié)構(gòu)蛋白N、P和L的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，這樣病毒才能夠在宿主細(xì)胞中完成復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而產(chǎn)生感染性病毒顆粒，從而實(shí)現(xiàn)病毒的拯救。然而，在共轉(zhuǎn)染過(guò)程中，通常需要摸索進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的載體的比例，如果比例不合適，則不能夠成功拯救病毒。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的，摸索四種載體的合適的共轉(zhuǎn)染比例是困難的，并且需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的方法由拯救的麻疹病毒制備麻疹疫苗。例如用拯救的麻疹病毒與單細(xì)胞懸液混合的接種模式接種，病毒液的量與細(xì)胞懸液的量的比通常為1: 100 I: 200，選擇無(wú)污染、形態(tài)正常的單層細(xì)胞，開(kāi)啟工作種子，以無(wú)菌方式取定量病毒液，力口至配制完畢的細(xì)胞維持液中搖勻，以無(wú)菌方式開(kāi)啟細(xì)胞培養(yǎng)瓶，換以新鮮的含適量病毒的細(xì)胞維持液，加塞后置33°C繼續(xù)培養(yǎng)至CPE達(dá)到“++” (用+表示細(xì)胞病變的程度，“ + ”表示輕度病變，“++”表示中度病變，“+++”表示重度病變)，棄舊維持液，洗滌細(xì)胞面，更換疫苗液，待CPE達(dá)到“+++”時(shí)，于2 8°C釋放病毒，進(jìn)而收獲病毒。然后，可以將收獲的麻疹病毒與可任選的可藥用載體(如麻疹疫苗中常用的佐劑等)混合，制備成疫苗。本發(fā)明所構(gòu)建的組合物還可以應(yīng)用于病毒載體的開(kāi)發(fā)。已知，副粘病毒基因組能夠容納一定長(zhǎng)度的外源基因，將外源基因插入病毒基因組中，并且使其具有能被病毒RNA聚合酶識(shí)別的起始和終止信號(hào)，這樣便能夠表達(dá)該基因。因此，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄載體的麻疹病毒全基因組中插入目的病毒基因，例如表達(dá)目的病毒的表面抗原的基因，利用本發(fā)明的組合物在宿主細(xì)胞中進(jìn)行病毒的拯救，由此便可以表達(dá)該病毒的表面抗原。該表面抗原在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)相應(yīng)的體液免疫反應(yīng)，由此，麻疹病毒載體有望用于重組疫苗的構(gòu)建。以下通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步解釋或說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。
實(shí)施例材料和方法:除非另有說(shuō)明，細(xì)胞培養(yǎng)采用生物學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)方法，所用細(xì)胞培養(yǎng)基為添加了 10%胎牛血清(購(gòu)自Sigma公司)的DMEM high glucose (購(gòu)自Hyclone公司)培養(yǎng)基,使用前添加青霉素-鏈霉素雙抗(其中青霉素的含量為10kU/ml,鏈霉素的含量為10mg/ml,在細(xì)胞培養(yǎng)液中推薦的青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.lmg/ml。)(購(gòu)自Amresco公司)。細(xì)胞傳代所用胰蛋白酶可購(gòu)自GIBCO公司。在細(xì)胞培養(yǎng)箱(購(gòu)自Thermo公司)中培養(yǎng)細(xì)胞(37°C，5% CO2)。實(shí)施例1:轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體的構(gòu)建1.核酸序列的突變改造對(duì)載體質(zhì)粒pVAXl (購(gòu)自Invitrogen公司，具有CMV啟動(dòng)子)的原有序列進(jìn)行改造，將其第34位堿基T突變?cè)O(shè)計(jì)為G，第50位堿基A突變?cè)O(shè)計(jì)為T(mén)，從而消除MluI酶切位點(diǎn)和SpeI酶切位點(diǎn)，并且將其第725-730位堿基序列AGCTCG突變?cè)O(shè)計(jì)為ACGCGT，從而使該載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn) 中具有Mlu I酶切位點(diǎn)。合成改造設(shè)計(jì)好的載體質(zhì)粒序列(由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行)，將其命名為pVAXm。對(duì)該載體質(zhì)粒序列進(jìn)行測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:1所示。在麻疹病毒S191株的全基因組序列(NCBI編號(hào):EU435017.1)的5’端和3’端分別設(shè)計(jì)引入錘頭狀核酶序列和丁肝病毒核酶序列，并且在錘頭狀核酶序列和丁肝病毒核酶序列的上游分別設(shè)計(jì)引入Mlu I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)，使麻疹病毒全基因組序列的5’端緊貼于載體的CMV啟動(dòng)子下游。將所述麻疹病毒全基因組序列第2101位堿基C突變?cè)O(shè)計(jì)為A，用作與母本病毒區(qū)別鑒定的遺傳標(biāo)簽。合成設(shè)計(jì)改造好的麻疹病毒全基因組cDNA序列(由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行)，對(duì)該序列進(jìn)行測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:2所不。在麻疹病毒復(fù)制結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白N(175-1752)、磷蛋白P(1874_3397)和RNA聚合酶L(9301-15852)的核酸序列的5’端和3’端分別設(shè)計(jì)引入Mlu I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)。合成設(shè)計(jì)改造好的三種結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列(由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行)，對(duì)這些序列進(jìn)行測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:3、4、5所示。測(cè)序結(jié)果顯示，對(duì)上述核酸序列的突變改造成功。2.轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體的構(gòu)建I)轉(zhuǎn)錄載體pVAXm-mvfull的構(gòu)建將Ιμ Mlu I (購(gòu)自 Takara 公司)、1 μ I Not I (購(gòu)自 Takara 公司)、I μ I 10ΧΗ緩沖液(購(gòu)自Takara公司)、2 μ I基因組cDNA和4.5 μ I去離子水加入Eppendorf管，在37°C水浴中酶切2小時(shí)。將Ιμ Mlu I (購(gòu)自 Takara 公司)、1 μ I Not I (購(gòu)自 Takara 公司)、I μ I IOXH緩沖液(購(gòu)自Takara公司)、0.5 μ I載體質(zhì)粒pVAXm和4.5 μ I去離子水加入Eppendorf管，在37°C水浴中酶切2小時(shí)。將I μ I酶切后的基因組cDNA和5 μ I載體質(zhì)粒pVAXm，以及0.4 μ 1Τ4連接酶(購(gòu)自Takara公司)和I μ I IOX緩沖液(購(gòu)自Takara公司)加入Eppendorf管,在16°C下進(jìn)行連接反應(yīng)過(guò)夜。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購(gòu)自QIAGEN)回收連接產(chǎn)物，方法按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。從而獲得轉(zhuǎn)錄載體pVAXm-mvfull。對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:6所示。2)表達(dá)載體pVAXm-N的構(gòu)建
按照pVAXm-mvfull的構(gòu)建方法進(jìn)行表達(dá)載體pVAXm_N的構(gòu)建,不同之處在于:MluI的量為0.5 μ 1，Not I的量為0.5μ1，所加入的DNA為2μ I衣殼蛋白(N)的編碼基因。連接反應(yīng)時(shí)的載體質(zhì)粒PVAXm的量為3 μ 1，T4連接酶的量為0.3 μ I。對(duì)所得pVAXm-N的序列測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:7所示。(3)表達(dá)載體pVAXm-P的構(gòu)建按照pVAXm-mvfull的構(gòu)建方法進(jìn)行表達(dá)載體pVAXm_P的構(gòu)建,不同之處在于:MluI的量為0.5 μ 1，Not I的量為0.5μ1，所加入的DNA為2μ I磷蛋白⑵的編碼基因。連接反應(yīng)時(shí)，載體質(zhì)粒PVAXm的量為3 μ I，T4連接酶的量為0.3 μ I。對(duì)所得pVAXm-P的序列測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:8所示。(4)表達(dá)載體pVAXm-L的構(gòu)建按照pVAXm-mvfull的構(gòu)建方法進(jìn)行表達(dá)載體pVAXm_L的構(gòu)建,不同之處在于:MluI的量為0.5 μ 1，Not I的量為0.5 μ 1，所加入的DNA為4μ I RNA聚合酶(L)的編碼基因，去離子水的量為2.5 μ I。連接反應(yīng)時(shí)，載體質(zhì)粒pVAXm的量為3 μ 1，Τ4連接酶的量為
0.3 μ I。對(duì)所得pVAXm-L的序列測(cè)序鑒定(由Takara公司進(jìn)行)，所得序列如序列表中的SEQ ID N0.:9 所示。實(shí)施例2:篩選合適的 宿主細(xì)胞1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別將Vero細(xì)胞(購(gòu)自上海細(xì)胞資源中心)和293T細(xì)胞(購(gòu)自上海細(xì)胞資源中心)進(jìn)行1:1傳代培養(yǎng)，以5X IO5個(gè)/孔的量將細(xì)胞鋪于6孔板的孔中；將BHK-21細(xì)胞(購(gòu)自上海細(xì)胞資源中心)進(jìn)行1: 2傳代培養(yǎng)，以5X IO5個(gè)/孔的量將細(xì)胞鋪于6孔板中。待六孔板中的細(xì)胞融合至密度為80-90 %時(shí)，用三種表達(dá)載體pVAXm-N、pVAXm-P和pVAXm-L分別轉(zhuǎn)染三種細(xì)胞系，方法如下:溶液1:用240 μ I/孔無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋10 μ I/孔轉(zhuǎn)染劑(Iipofectamine 2000，可購(gòu)自Invitrogen公司)，在室溫下輕柔混勻5分鐘；溶液2:用10 μ I/孔無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4μ g/孔表達(dá)載體；將溶液I與溶液2混合，在室溫下置20分鐘。與此同時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗6孔板中的細(xì)胞兩次，之后加入2ml無(wú)血清培養(yǎng)基。將溶液I與溶液2的混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。在37°C、5% CO2中培養(yǎng)5-6小時(shí)。6小時(shí)之后，將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清(購(gòu)自Sigma公司)的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 °C、5% CO2中培養(yǎng)48-72小時(shí)。2.檢測(cè)蛋白N、P和L的瞬時(shí)表達(dá)利用Western-Blot檢測(cè)蛋白的瞬時(shí)表達(dá)，方法與生物學(xué)領(lǐng)域中常規(guī)的Western-Blot方法相同。其中，運(yùn)用Bio-rad半干電轉(zhuǎn)系統(tǒng),將蛋自質(zhì)從SDS-PAGE膠中轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，所用第一抗體為用封閉液(3% (w/v)的脫脂奶粉)稀釋200倍的麻疹病毒免疫兔血清(稀釋前為lmg/ml),在室溫下輕柔搖蕩孵育I小時(shí)；第二抗體為用封閉液(3% (w/v)的脫脂奶粉)稀釋10000倍的抗兔抗體(稀釋前為100μ g/ml，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，在室溫下輕柔搖蕩孵育I小時(shí)。用5ml與第二抗體作用的顯色液TMB (購(gòu)自sigma公司)處理之后，觀察分析所顯示的蛋白條帶，結(jié)果如圖5所顯示。由圖5可知，蛋白N、P在293T細(xì)胞中成功表達(dá)，其中磷蛋白P(54KD)的泳動(dòng)速度慢于核衣殼蛋白N(58KD)的泳動(dòng)速度,這可能由磷酸化修飾或者糖基化修飾所導(dǎo)致。在Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞中未見(jiàn)核衣殼蛋白N和磷蛋白P蛋白的表達(dá)。而在三種細(xì)胞中都未觀察到蛋白L的表達(dá)，這可能由其表達(dá)量極低而檢測(cè)方法無(wú)法檢測(cè)，最終共轉(zhuǎn)染體系的成功也間接證實(shí)了蛋白L的表達(dá)導(dǎo)致。實(shí)施例3:麻疹病毒的拯救1.共轉(zhuǎn)染將經(jīng)過(guò)消毒的蓋玻片放入六孔培養(yǎng)板的孔中，之后加入2mlopt imem (可購(gòu)自GIBCO公司)培養(yǎng)基，并且以8父105個(gè)/孔的量將2931'細(xì)胞鋪于6孔板的孔中，在371:、5體積％ CO2中培養(yǎng)過(guò)夜。之后，用上述構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄載體和三種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法如下:將轉(zhuǎn)染劑(Iipofectamine 2000,可購(gòu)自Invitrogen公司)混勻后，吸取10 μ I/孔，用100 μ 1 optimem(GIBCO)培養(yǎng)基稀釋?zhuān)覝仂o置5分鐘。之后，用100 μ Ioptimem(GIBCO)培養(yǎng)基稀釋四種載體，四種載體的比例見(jiàn)表I (組1_11)，將其與上述稀釋好的轉(zhuǎn)染劑混勻之后于室溫靜置20分鐘。將500 μ I/孔的上述混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，混勻。在37°C、5體積％ CO2中培養(yǎng)8小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)。在本實(shí)施例中設(shè)置未轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體的陰性對(duì)照(對(duì)照組)。由于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染是以脂質(zhì)體的方式進(jìn)行的，因此不同分子量的質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的量和速度差異較大，相對(duì)分子量越小越容易轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。pVAXm-mvfull的分子量最大，因此共轉(zhuǎn)染的量應(yīng)最大以增加進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會(huì)。pVAXm-L的分子量次之，其它兩種質(zhì)粒的分子量更次之。在整個(gè)拯救體 系中，病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程中所需要的RNA聚合酶的量極少，因此pVAXm-L的量應(yīng)為最小，但因其表達(dá)量極少，共轉(zhuǎn)染時(shí)需適當(dāng)提高其轉(zhuǎn)染用量。共轉(zhuǎn)染后，根據(jù)細(xì)胞的CPE融合病變的程度和免疫熒光實(shí)驗(yàn)的熒光強(qiáng)度可以確定能夠成功拯救病毒的四種質(zhì)粒的比例。2.檢測(cè)麻疹病毒的拯救分別對(duì)對(duì)照組和下表I中的各組進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。當(dāng)293T細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合至密度為95-100%時(shí)，將其從培養(yǎng)箱中取出。用預(yù)溫的lXPBS(8g NaCU0.2g KC1、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L)洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。用丙酮低溫固定20-30分鐘，之后按相同的方法進(jìn)行清洗。用0.5體積％的Triton X-100的PBS溶液透化2_5分鐘，之后按相同的方法進(jìn)行清洗。加入5% (w/v) BSA的PBS溶液，室溫封閉30分鐘，之后加入用1% (w/v) BSA的PBS溶液稀釋1000倍的作為第一抗體的麻疹病毒免疫兔血清(稀釋前l(fā)mg/ml)，置于濕盒中孵育過(guò)夜。按相同的方法進(jìn)行清洗，每次10分鐘。加入用1% (w/v)BSA的PBS溶液稀釋1500倍的作為第二抗體的抗兔抗體(FITC標(biāo)記)(稀釋前100ug/ml)，在37°C下避光孵育30分鐘。按相同的方法進(jìn)行清洗，每次10分鐘。之后用95體積％的甘油封片。免疫熒光結(jié)果顯示，在對(duì)照組細(xì)胞中未見(jiàn)綠色熒光，而與對(duì)照組相比，在以組5、組7和組8的比例共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中可見(jiàn)綠色熒光，這表明本發(fā)明成功拯救出了麻疹病毒，并且能夠成 功拯救麻疹病毒的四種質(zhì)粒的比例范圍為(3.5 4): (I
1.5): (0.1): (0.2 1)。最佳的共轉(zhuǎn)染比例是4.0: 1.5: 0.1: 0.5。將各個(gè)共轉(zhuǎn)染比例和拯救結(jié)果總結(jié)在下表I中。表1:轉(zhuǎn)錄載體pVAXm-mvfull及表達(dá)載體pVAXm-N、pVAXm-P和pVAXm-L的共轉(zhuǎn)染
權(quán)利要求
1.一種用于拯救麻疫病毒(measles virus)的組合物,該組合物包含: 1)重組轉(zhuǎn)錄載體，其含有麻疹病毒全基因組cDNA，其中所述麻疹病毒全基因組的5’端和3’端分別包含具有自我剪切功能的核酶序列； 2)第一重組表達(dá)載體，其含有麻疫病毒的核衣殼蛋白的編碼基因； 3)第二重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的磷蛋白的編碼基因；和 4)第三重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的RNA聚合酶的編碼基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述轉(zhuǎn)錄載體、所述第一重組表達(dá)載體、所述第二重組表達(dá)載體、所述第三重組表達(dá)載體的比例范圍為:(3.5 4): (I 1.5): (0.1): (0.2 1)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述5’端的具有自我剪切功能的核酶序列為錘頭狀核酶序列、并且/或者所述3’端的具有自我剪切功能的核酶序列為丁肝病毒核酶序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述重組轉(zhuǎn)錄載體具有如圖1所示的pVAXm-mvfull質(zhì)粒的物理圖譜、所述第一重組表達(dá)載體具有如圖2所示的pVAXm-N質(zhì)粒的物理圖譜、所述第二重組表達(dá)載體具有如圖3所示的pVAXm-P質(zhì)粒的物理圖譜、并且/或者所述第三重組表達(dá)載體具有如圖4所示的pVAXm-L質(zhì)粒的物理圖譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述麻疹病毒為中國(guó)麻疹疫苗株S191。
6.一種試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的組合物在拯救麻疹病毒中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的組合物在制備麻疹疫苗中的用途。
9.一種拯救麻疹病毒的方法，該方法包括:將根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的組合物共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，從而進(jìn)行麻疹病毒的拯救。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供用于拯救麻疹病毒(measles virus)的組合物、試劑盒、用途及方法。本發(fā)明的用于拯救麻疹病毒的組合物包含1)重組轉(zhuǎn)錄載體，其含有麻疹病毒全基因組cDNA，其中所述麻疹病毒全基因組的5’端和3’端分別包含具有自我剪切功能的核酶序列；2)第一重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的核衣殼蛋白的編碼基因；3)第二重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的磷蛋白的編碼基因；和4)第三重組表達(dá)載體，其含有麻疹病毒的RNA聚合酶的編碼基因。本發(fā)明的組合物能夠簡(jiǎn)單方便地拯救麻疹病毒，并且所拯救的麻疹病毒可用于制備麻疹疫苗，適于工業(yè)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/00GK103160473SQ20111041524
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者王健, 陳祥鵬, 孫麗媛, 李莉莉, 張振龍, 沈心亮 申請(qǐng)人:北京微谷生物醫(yī)藥有限公司