專利名稱：一株灰黃青霉xj-ep-058菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制劑與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株香蕉內(nèi)生真菌及其抗香蕉枯萎病微生物劑、應用和該微生物制劑的制備方法，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病(Banana vascular wilt)又稱巴拿馬病、黃葉病，是由半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目鐮刀菌屬尖鐮孢菌古巴?；蚚/^sari腫oxysporum f. sp. cubense (Ε. F. Smith) Snyder]引起的一種維管束病害，是香蕉的一種毀滅性病害。2007年5月我國將香蕉枯萎病列入進境植物檢疫性有害生物名錄。目前，香蕉枯萎病廣泛分布于亞洲、非洲、 澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的香蕉產(chǎn)區(qū)。我國于I960年首次在廣西的芭蕉上發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病，20世紀70年代末在廣東、福建、海南、云南等省區(qū)陸續(xù)發(fā)生，主要為害粉蕉、越南蕉等品種。對香蕉枯萎病的防治，除在農(nóng)業(yè)防治方面采用輪作換茬、地塊選擇、清潔田園、力口強田間管理等措施來減少病害的侵染外，目前在很大程度上主要還是依賴于化學農(nóng)藥的使用，化學防治以其高效、簡便的特點，仍然是生產(chǎn)上采用的主要措施之一。但是長期或過量使用單一農(nóng)藥，易導致病害產(chǎn)生抗藥性，使得防效大大下降，且使農(nóng)藥殘留量增加，天敵被大量殺傷，農(nóng)田微生態(tài)平衡被破壞和環(huán)境被污染，因此，目前國內(nèi)外在研制高效低毒化學農(nóng)藥的同時，對生物農(nóng)藥的研制也給予了極大重視，目前在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中生物防治被認為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒?，其中微生物制劑是一種重要類型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株對香蕉枯萎病具有很好防治效果的灰黃青霉菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制劑和應用，以及該該微生物制劑的制備方法。本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
1、本發(fā)明提供的一株灰黃青霉菌株是灰黃青霉(Penicillium griseofulvum ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467。飽灰黃著霉、Pen c 11 um gr seofu 1 vum ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 于 2011年11月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)， 保藏號是CGMCC No. 5467，該普通微生物中心地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。飽灰黃著霉、Pen c 11 um gr seofu 1 vum )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467是從云南省西雙版納州勐臘縣勐捧鎮(zhèn)一株巴西蕉根部分離得到，其形態(tài)特征為菌落白色，中央為青色，短絨毛狀，基質(zhì)為白色，中央為黃褐色；分生孢子梗不對稱分枝，分生孢子串生，球形，頂端排成帚狀。2、一種抗香蕉枯萎病微生物制劑的制備方法，其步驟如下(1)試管種培 養(yǎng)
MM^.'mU (.Penicillium griseofulvum )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 菌株接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，于28° C下培養(yǎng)7天，獲得試管種；所述的固體培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯200g ；葡萄20g ；瓊脂15 20 g ；蒸餾水IOOOml ；pH 7. 0 ；
(2)液體種子培養(yǎng)
采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是
①配制液體種子培養(yǎng)基，按液體種子培養(yǎng)基配方所述的各成分及其含量混合而成液體種子培養(yǎng)基，所述的液體種子培養(yǎng)基的配方是葡萄糖20. Og,蛋白胨10. Og,酵母浸膏 5. 0g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 0 ；
②在每個三角瓶中裝入IOOml所述的液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入 Icm2的試管種，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)2天；
(3)制備所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑
采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是
①配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配配方所述的各成分及其含量混合而成液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方是馬鈴薯200g;葡萄糖20 g;自來水1000ml，pH 7. 0 ；
②在每個三角瓶中裝入200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入IOml 步驟(2)培養(yǎng)得到的液體種子，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)7天得發(fā)酵液；
③在發(fā)酵液中加入等體積的質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇，經(jīng)搖床振蕩10小時后，用轉(zhuǎn)速為4000 rpm的離心機離心15min，取上清液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55° C蒸去乙醇，用水稀釋到原發(fā)酵液體積，即成為所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑。 3、一種抗香蕉枯萎病微生物制劑，按以下步驟制備得到
(1)試管種培養(yǎng)
MM^.'mU (.Penicillium griseofulvum )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 菌株接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，于28° C下培養(yǎng)7天，獲得試管種；所述的固體培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯200g ；葡萄20g ；瓊脂15 20 g ；蒸餾水IOOOml ；pH 7. 0 ；
(2)液體種子培養(yǎng)
采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是
①配制液體種子培養(yǎng)基，按液體種子培養(yǎng)基配方所述的各成分及其含量混合而成液體種子培養(yǎng)基，所述的液體種子培養(yǎng)基的配方是葡萄糖20. Og,蛋白胨10. Og,酵母浸膏 5. 0g，蒸餾水 IOOOml ；pH 7. 0 ；
②在每個三角瓶中裝入IOOml所述的液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入 Icm2的試管種，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)2天；
(3)制備所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑
采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是
④配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配配方所述的各成分及其含量混合而成液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方是馬鈴薯200g ；葡萄糖20 g ；自來水IOOOml ；pH 7. 0 ；
⑤在每個三角瓶中裝入200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入IOml步驟(2)培養(yǎng)得到的液體種子，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)7天得發(fā)酵液；
⑥在發(fā)酵液中加入等體積的質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇，經(jīng)搖床振蕩10小時后，用轉(zhuǎn)速為4000 rpm的離心機離心15min，取上清液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55° C蒸去乙醇，用水稀釋到原發(fā)酵液體積，即成為可供使用的抗香蕉枯萎病微生物制劑。4、上述技術(shù)方案 1 所述的灰黃青霉 QPenicillium griseofulvum ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467在抗香蕉枯萎病中的應用。5、上述技術(shù)方案3所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑在抗香蕉枯萎病中的應用。所述的自來水是指通過自來水處理廠凈化、消毒后生產(chǎn)出來的符合中國飲用水標準的供人們生活、生產(chǎn)使用的水。本發(fā)明將所述的抗香蕉枯萎病微生物劑，采用孢子萌發(fā)抑制法、菌絲生長抑制法及溫室盆栽活體試驗三種方法，試驗該制劑對香蕉枯萎病的防治作用表明
本發(fā)明所述的灰黃青霉(/^fliciBi腫 ^ri1SeofWraffl )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 及其抗香蕉枯萎病微生物劑對香蕉枯萎病具有顯著的離體和活體防效，防治香蕉枯萎病效果顯著，可用于香蕉作物上枯萎病的防治。在孢子萌發(fā)抑制法試驗中，對香蕉枯萎病菌孢子的萌發(fā)抑制率達到100% ；在菌絲生長抑制法試驗中，對香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑平均為14.5mm (5次重復)，兩項試驗結(jié)果表明本發(fā)明灰黃青霉(/^fliciBi腫^ri1SeofWraffl )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467及其抗香蕉枯萎病微生物制劑對香蕉枯萎病菌具有很強的抑制活性。溫室盆栽活體試驗結(jié)果表明本發(fā)明灰黃青霉^riseo/Wra ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467及其抗香蕉枯萎病微生物制劑對盆栽香蕉的香蕉枯萎病表現(xiàn)出了顯著的防治效果，平均防治效果達到74. 38%。本發(fā)明具有原料成本低，生產(chǎn)工藝簡單易行，防治效果好的優(yōu)點，具有較好的應用前景。
具體實施例方式
以下實施例無特別說明為常規(guī)方法。實施例1 灰黃青霉腫容riseo/Wra ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 的獲得、鑒定和培養(yǎng)保存。1 > MMm-U (.Penicillium griseoful vum ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 的獲得。1. 1 材料 1. 1來源
采自云南省西雙版納州勐臘縣勐捧鎮(zhèn)的巴西蕉iMusa AAA Cavendish subgroup cv. Brazil)。1.2培養(yǎng)基
培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g ；葡萄糖20 g ；蒸餾水1000m 1 ；自然pH7. 0。1. 3 方法
樣品消毒處理預先取香蕉健康植株根部用自來水沖洗干凈、晾干水分后，采用以下方法進行表面消毒0. 2%升汞消毒30s，無菌水沖洗后75%乙醇消毒60s，最后再用無菌水沖洗、晾干。所述的百分數(shù)是質(zhì)量分數(shù)。分離培養(yǎng)上述香蕉組織樣品經(jīng)處理完畢后，在無菌條件下，切成0. 2cmX0. 2cm片段移植于培養(yǎng)基內(nèi)，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5—IOd后，培養(yǎng)基中可見有菌落形成，挑取植物組織周圍的菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面中，經(jīng)純化后即得到該內(nèi)生真菌。分類鑒定采用真菌學插片培養(yǎng)方法，對分離獲得的內(nèi)生真菌進行顯微形態(tài)特征的觀察、分類鑒定。在顯微鏡下觀察菌絲、有性或無性孢子、孢子著生狀態(tài)等形態(tài)特征，確定所分離獲得的內(nèi)生 真菌的分類地位。分類檢索參照文獻[1，2，3，4 ].魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海上?？茖W技術(shù)出版社，1979.H. L巴尼特，B. B亨特.沈崇堯譯.半知菌屬圖解[M].北京科學出版社，1977.中國科學院微生物研究所.常見與常用真菌[M].北京科學出版社，1978.邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學[M]北京中國林業(yè)出版社，1984. 上述得到的菌株的鑒定
對上述得到的菌株進行形態(tài)鑒定，菌落初白色，中央漸變?yōu)樘m綠色，中央突起，背面黃色。載片鏡檢時發(fā)現(xiàn)，分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細胞，分生孢子梗有橫隔膜，頂端排列成帚狀間枝，分枝多次；分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個孢子呈卵圓形，淺綠色， 光滑，無菌核。因此初步鑒定為真菌門(Fungi)半知菌類iFimgi Imperfect!)從梗孢目 (Moniliales) 包禾4· (Dematiaceae )( Pencillium )。用Mega軟件對測序結(jié)果進行同源性分析，與參比序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)樹上看，上述得到的菌株與灰黃青霉(Penicillium griseofulvum )的親緣關(guān)系最為接近，相似性99. 33%。經(jīng)上述鑒定表明所分離獲得的菌株為灰黃青霉griseofulvum )， 其代號為 XJ-EP-058，所述的灰黃青霉 QPenicillium griseofulvum ) XJ-EP-058 于 2011 年11月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號是CGMCC No. 5467，該普通微生物中心地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。(.Penicillium griseofulvum )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 的保存方法
(1)短期保存將灰黃青霉(Fenicilliumgriseofulvum ) XJ-EP-058菌株接種在PDA 固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2—8°C的冰箱中保藏； 所述的PDA固體培養(yǎng)基的配方是馬鈴薯200g ；葡萄20g ；瓊脂15 20 g ；蒸餾水IOOOml ；自然 PH7. 0 ；
(2)長期保存
1)將濾紙剪成直徑為0. 5 cm的小片，裝入0. 6 X 8cm的安瓿管中，每管1一2張，塞以棉塞，121 °C滅菌30分鐘。2)將灰黃青霉 QPenicillium griseofulvum ) XJ-EP-058 菌株接種在 PDA 固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。3)取滅菌脫脂牛乳1一2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。5)將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。6)將棉花塞入管內(nèi)，用火焰熔封，熔封后在-20°C低溫保存。實施例2 孢子萌發(fā)抑制法試驗
1、抗香蕉枯萎病微生物制劑及其制備方法抗香蕉枯萎病微生物制劑的制備方法，其步驟如下
(1)試管種培養(yǎng)
WH^E^I^M'mU (.Penicillium griseofulvum )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 菌株接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，于28° C下培養(yǎng)7天，獲得試管種；所述的固體培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯200g ；葡萄20g ；瓊脂15 20 g ；蒸餾水IOOOml ；自然ρΗ7· 0 ；
(2)液體種子培養(yǎng)
采用500ml三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是
①配制液體種子培養(yǎng)基，按液體種子培養(yǎng)基配方所述的各成分及其含量混合而成液體種子培養(yǎng)基，所述的液體種子培養(yǎng)基的配方是葡萄糖20. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母浸膏 5. 0g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 0 ；
②在每個三角瓶中裝入IOOml所述的液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入 Icm2的試管種，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)2天；
(3)制備所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑采用500ml三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是
⑦配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配配方所述的各成分及其含量混合而成液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方是馬鈴薯200g;葡萄糖20 g;自來水1000m 1 ；自然 pH 7. 0 ；
⑧在每個三角瓶中裝入200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入IOml 步驟(2)培養(yǎng)得到的液體種子，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)7天得發(fā)酵液；
⑨在發(fā)酵液中加入等體積的質(zhì)量分數(shù)為？％的乙醇，經(jīng)搖床振蕩10小時后，用轉(zhuǎn)速為4000 rpm的離心機離心15min，取上清液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55° C蒸去乙醇，用水稀釋到原發(fā)酵液體積，即成為所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑。本發(fā)明所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑可以通過上述方法制備得到。2、制備香蕉枯萎菌分生孢子懸浮液
將香蕉枯萎病菌4號小種標準菌株(香蕉枯萎病菌4號小種標準菌株購自中國微生物菌種資源庫，地址北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，北京市朝陽區(qū)北三環(huán)東路北京外貿(mào)安貞大樓)接種到培養(yǎng)基上28°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為常用的PDA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基的制備方法是取馬鈴薯200g去皮后切成小塊，加蒸餾水IOOOmL煮沸30分鐘，過濾后得到IOOOml濾液，然后加入葡萄糖20g，瓊脂20g，pH 7.0。待菌絲長滿培養(yǎng)基后用自來水洗去氣生菌絲， 于400nm日光燈照射下培養(yǎng)產(chǎn)分生孢子，2 — 3天待產(chǎn)生分生孢子后，用蒸餾水洗下分生孢子，并稀釋成濃度為在IOX 10低倍鏡下、每個視野30 - 40個分生孢子的香蕉枯萎病菌分生孢子懸浮液備用。3、孢子萌發(fā)抑制試驗
將制備的抗香蕉枯萎病微生物制劑供試樣品與配制好的香蕉枯萎病菌分生孢子懸浮液等體積混合，取75 μ 1加在凹玻片上，每處理5個重復，同時設清水為空白對照。在28° C 下保濕培養(yǎng)24h后察看空白對照分生孢子的萌發(fā)情況，以芽管長度超過分生孢子小端直徑一半時為萌發(fā)，當空白對照分生孢子的萌發(fā)率達到85%后，觀察抗香蕉枯萎病微生物制劑供試樣品對香蕉枯萎病菌分生孢子萌發(fā)的抑制情況。其中對照孢子萌發(fā)率是98. 76%，處理的5個重復的孢子萌發(fā)率均為零，按以下公式計算孢子萌發(fā)抑制率為100%。孢子萌發(fā)抑制率=(對照孢子萌發(fā)率一處理孢子萌發(fā)率)/(對照孢子萌發(fā)率)X 100% 實驗結(jié)果表明，用含有本發(fā)明所述的灰黃青霉(Penicillium griseofulvum )
XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制劑供試樣品對香蕉枯萎病菌分生孢子的萌發(fā)抑制率為
100% ο實施例3 菌絲生長抑制試驗
菌絲生長抑制試驗在內(nèi)徑為9cm的已滅菌培養(yǎng)皿中倒入8ml的水瓊脂培養(yǎng)基，水瓊脂培養(yǎng)基配方為瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.0。將實施例2所述的香蕉枯萎菌分生孢子懸浮液與10 ml PDA培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基與實施例2所述的PDA培養(yǎng)基相同)充分混勻， 倒入已盛有水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，制成雙層帶菌培養(yǎng)基。菌絲生長抑制實驗采用常規(guī)的杯碟法，即在每個帶菌雙層平板上放置牛津杯，在牛津杯內(nèi)加入實施例2所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑0. 2ml,以清水為空白對照，重復5個樣品，置28°C恒溫箱中培養(yǎng)72小時后，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。實驗數(shù)據(jù)5次重復抑菌圈直徑測量結(jié)果分別為14.7mm、15.5mm、13.8 mm、14.5 mm ,14.0 mm，平均為14.5 mm。實驗結(jié)果表明含有本發(fā)明所述的灰黃青霉 、PeniciIlium griseofulvum ) XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制劑對香蕉枯萎病菌菌絲生長具有較強的抑制作用。實施例4 溫室盆栽活體試驗
溫室盆栽防治效果試驗試驗用香蕉苗的準備方法在塑料大棚中，將組培的香蕉苗洗凈根部的培養(yǎng)基后，移栽于育苗袋中，待香蕉苗長出3、片葉(約1個月)后，再移植于直徑30cm的育苗盆中。移栽后經(jīng)常淋水保濕，每周施肥(每株2g/次復合肥溶于水中施用，以質(zhì)量分數(shù)計，復合肥中的N-P2O5-K2O為15-15-15) Γ2次。待香蕉苗長出6、片葉(約2個月)后，備用。配制濃度為IX IO7個/ml的香蕉枯萎病菌分生孢子懸浮液。將5ml該分生孢子懸浮液用傷根灌菌液的方法接種。傷根灌菌液的接種方法為用玻璃棒在植株附近插入土壤中，使植株的根部部分受到損傷，然后將備用的香蕉枯萎病菌分生孢子懸浮液從玻璃棒插入的空隙中灌注。接種24h后，澆灌實施例2所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑50ml，以空白清水為對照。接種5周后，調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數(shù)，計算防治效果。病情調(diào)查分級標準
級別發(fā)病情況 1級葉片健康，球莖不變色 2級下部葉片輕微黃化，根與球莖交接處變色 3級下部葉片大部分黃化，上部嫩葉開始變色，20%球莖變色 4級大部分或全部葉片黃化，50%球莖變色 5級死株，全部球莖變色病情指數(shù)=[〔Σ (病級株數(shù)X代表級數(shù))〕/ (調(diào)查總株數(shù)X最高代表級值)]X 100 防治效果=[(對照組病情指數(shù)_處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)]X 100% 實驗數(shù)據(jù)鋪灰鋪獄PeniciUium griseofulvum )XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制劑對香蕉枯萎病3次重復的溫室盆栽防治效果分別為76. 24%、70. 39%、77. 51%， 平均為74.38%。實驗數(shù)據(jù)表明含有本發(fā)明所述的灰黃青霉griseofulvum )XJ-EP-058的抗香蕉枯萎病微生物制劑供 試樣品在盆栽香蕉上也表現(xiàn)出顯著的防治效果， 其對香蕉枯萎病的平均防治效果為74. 38%，與其室內(nèi)離體抑菌效果具有較好的相關(guān)性。本發(fā)明所述的灰黃青霉griseofulvum ) XJ-EP-058及其抗香蕉枯萎病微生物制劑能實際應用。
權(quán)利要求
1.MMm-U (.Penicillium griseofulvum ) XJ-EP-058 CGMCC No. 5467。
2.一種抗香蕉枯萎病微生物制劑的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)試管種培養(yǎng)MM^.'mU (.Penicillium griseofulvum )XJ-EP-058 CGMCC No. 5467 菌株接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，于28° C下培養(yǎng)7天，獲得試管種；所述的固體培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯200g ；葡萄20g ；瓊脂15 20 g ；蒸餾水IOOOml ；pH 7. 0 ；(2)液體種子培養(yǎng)采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是①配制液體種子培養(yǎng)基，按液體種子培養(yǎng)基配方所述的各成分及其含量混合而成液體種子培養(yǎng)基，所述的液體種子培養(yǎng)基的配方是葡萄糖20. Og,蛋白胨10. Og,酵母浸膏 5. 0g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 0 ；②在每個三角瓶中裝入IOOml所述的液體種子培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入 Icm2的試管種，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)2天；(3)制備所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，方法是①配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按液體發(fā)酵培養(yǎng)基配配方所述的各成分及其含量混合而成液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方是馬鈴薯200g;葡萄糖20 g;自來水1000ml，pH 7. 0 ；②在每個三角瓶中裝入200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌30min，冷卻后接入IOml止少驟(2)培養(yǎng)得到的液體種子，28° C下于轉(zhuǎn)速為220 rpm的搖床上培養(yǎng)7天得發(fā)酵液；③在發(fā)酵液中加入等體積的質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇，經(jīng)搖床振蕩10小時后，用轉(zhuǎn)速為 4000 rpm的離心機離心15min，取上清液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55° C蒸去乙醇，用水稀釋到原發(fā)酵液體積，即成為所述的抗香蕉枯萎病微生物制劑。
3.一種抗香蕉枯萎病微生物制劑，其特征在于，按權(quán)利要求2所述的一種抗香蕉枯萎病微生物制劑的制備方法制備得到。
4.權(quán)利要求1 所述的灰黃青霉(/^fliciMi腫 ^ri1SeofWraffl ) XJ-EP—058 CGMCC No.5467或權(quán)利要求3所述的一種抗香蕉枯萎病微生物制劑在抗香蕉枯萎病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株灰黃青霉XJ-EP-058菌株及其抗香蕉枯萎病微生物制劑與應用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。所述的菌株是灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum)XJ-EP-058CGMCCNo.5467。含有該菌株的抗香蕉枯萎病微生物制劑通過試管種培養(yǎng)，菌株液體種子培養(yǎng)、菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)得到。該菌株及含有該菌株的抗香蕉枯萎病微生物劑對香蕉枯萎病具有顯著的離體和活體防效，對香蕉枯萎病菌孢子的萌發(fā)抑制率達到100%；對香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑平均為14.5mm，溫室盆栽活體試驗結(jié)果表明對香蕉枯萎病菌的平均防治效果達到74.38%。該微生物制劑的原料成本低，生產(chǎn)工藝簡單易行。
文檔編號C12R1/80GK102367421SQ20111039625
公開日2012年3月7日 申請日期2011年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月3日
發(fā)明者曾莉, 楊佩文, 番華彩, 郭志詳 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所