專利名稱：一種PsPR10P796啟動子及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動子及其應用，特別涉及一種PsPR10P796啟動子及其應用。
背景技術(shù)：
啟動子是DNA上結(jié)合RNA聚合酶并形成轉(zhuǎn)錄起始復合物的區(qū)域。外源基因在轉(zhuǎn)基因作物體內(nèi)的表達依靠啟動子對其的調(diào)控作用，表達量不足往往得不到理想轉(zhuǎn)基因植物。 因此，選擇合適的植物啟動子是增強外源基因表達首要問題。根據(jù)啟動子所控制的基因表達范圍和方式不同，啟動子可以分成組成型啟動子和特異性啟動子。在組成型表達啟動子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會表達。外源基因在植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達不但造成浪費，往往還會引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長和發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，近年來人們對特異性啟動子的研究越來越重視。隨著植物根特異性表達啟動子研究的不斷改進，現(xiàn)已分離了一些植物根特異性表達基因和增強序列，這些序列能在根部特異性或優(yōu)先激活從而啟動基因的表達，啟動子中存在負責根特異性表達的順式作用元件，受外來因素誘導或特定蛋白調(diào)控，包括組織特異性啟動子和誘導表達型啟動子。例如來自煙草的富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)基因，盡管其表達水平很低但是根特異性的，在煙草側(cè)根分化誘導過程中，在中柱鞘和內(nèi)皮層中其啟動子表現(xiàn)短時間活躍，特別是后期根發(fā)生組織細胞中活性強，屬于組織特異性啟動子。誘導表達是指植物細胞由于環(huán)境的變化而導致相關(guān)基因的表達。植物體內(nèi)存在著一套防御機制來對付不良環(huán)境，在這個過程中，環(huán)境誘導基因啟動子起著關(guān)鍵的作用。根對于植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，維持正常生長具有重要作用。在環(huán)境脅迫下，最先受到影響的器官是根部組織，如果將根部誘導型特異性啟動子應用于植物抗脅迫基因工程中，使抗性基因在根部細胞中特異表達，這樣就能降低能量消耗，使轉(zhuǎn)基因植物在獲得抗性的同時，又不影響正常的生長發(fā)育，對抗逆、抗病蟲的基因工程具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能夠調(diào)控目的基因高效特異表達于植物的根部組織的 PsPR10P796啟動子，并應用于植物抗逆基因工程。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種I^raiOP796啟動子，所述啟動子含有下列任意一組核苷酸序列a、SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互補的序列；本發(fā)明也不排除對上述a或b所述序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或修飾的核苷酸序列；或與上述a或b所述序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。進一步，所述的I^raiOP796啟動子優(yōu)選為含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的
啟動子。一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含所述的Ι^Ι^10Ρ796啟動子以及與之進行可操作連接的基因序列。一種載體，所述載體含有所述的啟動子或所述的DNA構(gòu)建體。一種重組細胞，所述的重組細胞包含所述的啟動子或所述的DNA構(gòu)建體或所述的載體。進一步，所述的重組細胞優(yōu)選為重組大腸桿菌細胞或重組農(nóng)桿菌細胞。一種含有所述的啟動子或所述的DNA構(gòu)建體或所述的載體或所述重組細胞的植物愈傷組織或植物。進一步，所述的植物愈傷組織或植物優(yōu)選為煙草。所述的PsPR10P796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用。進一步，所述的I^raiOP796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用為Ι^Ι^10Ρ796 啟動子在在抗逆轉(zhuǎn)基因煙草中的應用，將抗逆基因置于I^raiOP796啟動子下游，構(gòu)建植物表達載體，將載體導入煙草，得到抗逆轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明提供的啟動子核苷酸序列來自美洲東部白松(Pinus strobus) 0本發(fā)明利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得美洲東部白松I3sI3RIO基因上游796bp序列啟動子，其核苷酸如SEQ. ID. NO. 1所示，具體方法如下本發(fā)明從美洲東部白松根中提取 DNA，根據(jù)國際基因庫(GenBank)中已經(jīng)發(fā)布的其它植物I3RlO基因上游DNA序列，設(shè)計引物，序列如下Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTTRl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA利用上述引物進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(PCR)。將PCR產(chǎn)物與克隆載體(pEASY-T) 連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后篩選陽性重組子，進行序列測序，根據(jù)獲得的序列設(shè)計引物，引物序列如下F796 :AAAAGCTTGGTGATTACTCCAACAAAATCR2 :AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC以美洲東部白松根DNA為模板進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物與克隆載體(pEASY_T)連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，然后篩選陽性重組子，進行序列測序，得到一個796bp 啟動子序列，將該序列命名為PsPR10P796。該啟動子序列SEQ. ID. NO. 1信息如下
長度:796bp
類型核酸
鏈型雙鏈
來源美洲東部白松(Pinus ttrobus)
-796GTGATTACTCCAACA
-781AAATCTAATCCATCAATAAAAATGTACACAAACTAATTTTCATTTAATCTTTTTCTGCCC
-721ATTTAATAAAAAGATCAAAATTCTGGCAGCCGAATATTTGGTCTTTTGAACTTAACGAAT
-661ATATATATATCCACTGAAAAGTCATTTTGAAATATATGCATTCCACGGTAGCGATGGCAC
-601GGCGTTGGTGAATGTAGAAGCCTTTGTAAGCAATTTACGGCGTCTTTGACATTTGTGTAT
-541CTCTTCTAGATGGGTTAACAACACGGACTGACAAAACCGCGGTGGTTAGGGAAGTTAGAA
-481ACGATATTCATTGAAGGATCAGCCTGTAAATAAATAAATAAAAACAAATTATCCATTTCA
-421TGTCTTATCTTGTTATCTGGTCGTATCTACTCTTTGTCATTAATCGTCTCTGAAAGTGGG
-361AACCGGAACCGGAATCGTCTCTTGTCATTAGATGAGAAGAGAAATAACAAATCACCATGG
-301GATCTAGAAACATCCATCCATTCCGTTTATTCAAAGTCAGCACACACAGTGGGGTCCGGG
-241GGATCGTTGTCCTTTAGGACTTATCGAAACCAGGCATGGAGCTCGGTATTGTCGGCCACA
-181AAGGCCAAGGGTTCAATAAGAAAACCCAAGTAGTTGGCATTATGTGCGTCCATCGGTCAG
-121TCCAAATAACAAATAGTCACTTTCGAGTCTCATGTCATTACCTACGCGCTCTCTTTAATG
-61 TACAGATTTTAAAGGTTTGTAAACGACTACTATAAATACGGGCTCGTCTAGTGCAGTTGA
-1 GAACAAGGAGCTTTGTGCGATAATATTGAAGAAATATAAGTATTGTGTAGTTGCGAGAGA
60 GTTGAAAATG啟動子序列SEQ. ID. NO. 1中負號表示啟動子序列，正號表示啟動子下游序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種新的 I^raiOP796啟動子，具有較高的根特異誘導表達活性，能夠提高下游抗逆基因根特異轉(zhuǎn)錄水平，從而能夠增強轉(zhuǎn)基因植物抗逆能力。


圖1轉(zhuǎn)基因煙草受不同信號分子誘導后⑶S在I^raiOP796啟動子驅(qū)動下表達能力，(A B)為T3代對照處理轉(zhuǎn)基因煙草；(C H)為T3轉(zhuǎn)基因煙草分別利用以下信號分子處理NaCl，甘露醇，聚乙二醇，脫落酸，茉莉酸，水楊酸。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此基于本生煙草生長速度快、生活周期短、離體培養(yǎng)再生能力強和遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點，在下述實施例中以煙草為例對本發(fā)明進行了詳細說明。氨芐LB固體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、YEP培養(yǎng)基、MS液體培養(yǎng)基、MS預分化培養(yǎng)基、MS基本培養(yǎng)基、MS生根培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基及其組成均為公知常識。實施例1 調(diào)控目的基因高效特異表達于植物的根部組織的美洲東部白松 ^Ι^10Ρ796啟動子的克隆1. DNA提取利用植物DNA提取試劑盒(TransGen，Bei jing)提取美洲東部白松基因組DNA，作為模板。2. PRlO基因上游DNA序列擴增利用引物Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTT 和 Rl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA 進行PCR擴增，體系如下10XBuffer5 μ L, 10mmoL/L dNTP 2 μ L，PCR引物各25pmol，DNA模板 1 μ L (約200ng)，Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50 μ L0PCR反應步驟為94°C預變性5min ；93°C 變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸90sec，循環(huán)30次；最后72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒(TransGen，Beijing)回收片段，將所得片段連入pEASY_T載體(TransGen，Beijing)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞CTransGen，Bei jing)，然后利用氨芐LB固體培養(yǎng)基篩選陽性重組子，并進行PCR鑒定，然后進行序列測序，獲得一個1750bp 序列。
3. PsPR10P796 啟動子獲得利用引物F796 :AAAAGC TTG TGATTACTC CAACAAAAT C 禾口 R2 :AAG GAT CCC ATT TTC AAC TCT CTC GCAAC進行PCR擴增，體系如下=IOXBuffer 5 μ L, 10mmoL/L dNTP 2 μ L, PCR引物各25pmol，DNA模板1 μ L(以步驟2獲得的1750bp序列為模板)，Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50 μ L。PCR反應步驟為94°C預變性5min ；93°C變性30sec，5(TC退火30sec， 72°C延伸60sec，循環(huán)30次；最后72°C延伸lOmin。1 %瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒(TransGen，Beijing)回收片段，將所得片段連入pEASY_T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后利用含50mg/mL氨芐的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性重組子，并進行PCR鑒定，然后進行序列測序，獲得一個796bp序列，命名為I^raiOP796啟動子。實施例2 表達載體構(gòu)建及重組細胞的構(gòu)建(1)根據(jù)分離的I^raiOP796啟動子核苷酸序列，設(shè)計引物正向引物5，-AAAAGCTTGGTGATTACTCCAACAAAATC-3，劃橫線部分為HindIII酶切位點反向引物5，-AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC-3，劃橫線部分為BamH I酶切位點以該啟動子全長測序質(zhì)粒為模板，利用上述正向和反向引物進行PCR反應。(2)取步驟(I)PCR 產(chǎn)物 2μ L 與克隆載體 pEASY_T(TransGen，Beijing)連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(TransGen，Beijing)，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，篩選陽性重組子，進行PCR鑒定，獲得陽性大腸桿菌。(3)利用質(zhì)粒提取試劑盒(TransGen，Beijing)提取上述步驟(2)得到的陽性大腸桿菌的質(zhì)粒，將質(zhì)粒用HindIII和BamH I酶切，與用相同限制酶酶切的pBI121表達載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，對生長出的菌落進行PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定，獲得表達載體pBI 121。(4)取5μ 1表達載體pBI121，加入200μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞(Agrobacterium tumefaciens)，混勻；冰浴5min，再利用液氮冷凍lmin，迅速置于37°C水浴溫育5min，然后冰浴aiiin ；加入800 μ 1 YEB液體培養(yǎng)基，在，250r/min培養(yǎng)4 證；用移液器將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至YEB固體培養(yǎng)基(含100 μ g/ml利福平，50 μ g/ml卡那霉素)表面，均勻涂布于整個平板；倒置培養(yǎng)1 2d，可看到單克隆，挑取單菌落用微量堿法提取質(zhì)粒，進行PCR 和酶切檢測，獲得重組農(nóng)桿菌細胞。實施例3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得(1)本生煙草(Nicotiana tabacum)種子，播種于MS培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)至5 6 片真葉期，備用。(2)挑取實施例2獲得的重組農(nóng)桿菌(攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落)接種于含 50mg/L卡那霉素的YEP培養(yǎng)基中，，250rpm，振蕩培養(yǎng)4 至對數(shù)生長后期，將菌液用 MS液體培養(yǎng)基稀釋10倍待用。(3)取步驟(1)培養(yǎng)的煙草葉片剪切成5mmX5mm小塊，置于MS預分化培養(yǎng)基中， 280C，光照為16h/d，2000Lux,預培養(yǎng)2d，獲得預培養(yǎng)后的煙草葉片外植體。(4)將步驟( 預培養(yǎng)后的煙草葉片外植體浸入上述步驟( 菌液中5 lOmin， 用滅菌濾紙吸干多余菌液，轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基，弱光，280C，共培養(yǎng)2d。
(5)將步驟(4)共培養(yǎng)后的煙草葉片外植體先用含氨芐青霉素250mg/L的無菌水洗滌3次，再用含氨芐青霉素250mg/L的MS培養(yǎng)基洗滌1次，然后用濾紙吸干，轉(zhuǎn)入含卡那霉素100mg/L，氨芐青霉素250mg/L的MS培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)至芽長至Icm時，切下芽后，將芽轉(zhuǎn)入含卡那霉素50mg/L，氨芐青霉素250mg/L的MS生根培養(yǎng)基中，25 °C培養(yǎng)促進生根，生根后，移入無菌土的花盆中，溫室中25°C培養(yǎng)收種子，獲得T1、T2和Τ3代轉(zhuǎn)基因煙草種子。(6)轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定將步驟(5)中獲得的Τ1、Τ2和Τ3代轉(zhuǎn)基因煙草種子先用70%乙醇消毒30 60s，10%次氯酸鈉消毒15min，用滅菌水漂洗至少4次；去盡水加入0.2%的瓊脂，將種子均勻分布到V2MS培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素)表面；轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，葉片顏色為綠色的幼苗即為陽性苗(煙草轉(zhuǎn)基因陽性植株)，并提取煙草轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片基因組DNA，禾Ij用PCR驗證獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植株。實施例4 啟動子提高根部基因表達能力分析將上述實施例3獲得的T3代煙草轉(zhuǎn)基因陽性植株分別置于NaCl (200mM)，甘露醇 (300mM)和聚乙二醇(15% )脅迫條件下，或葉面噴灑水楊酸(5mM)，脫落酸(100 μ M)和茉莉酸(100 μ Μ)，并以相應無菌水處理作為對照。對小時后，GUS染色檢測轉(zhuǎn)基因煙草中 PsPR10P796啟動子下游⑶S基因表達活性，結(jié)果見圖1，(Α B)為Τ3代對照處理轉(zhuǎn)基因煙草；(C H) Τ3代轉(zhuǎn)基因煙草分別利用以下信號分子處理=NaCl，甘露醇，聚乙二醇，脫落酸，茉莉酸，水楊酸。通過以上脅迫誘導和信號分子誘導實驗，發(fā)現(xiàn)Ι^Ι^10Ρ796啟動子能夠激活下游⑶S基因表達活性顯著上調(diào)，達到1200pM Hig-1Iiiirr1,說明I^raiOP796啟動子具有較高的根特異誘導表達能力。該基因可以轉(zhuǎn)化水稻等農(nóng)作物，提高其抗脅迫能力，具有重大的經(jīng)濟和社會價值。
權(quán)利要求
1.一種I^PR10P796啟動子，其特征在于所述啟動子含有下列任意一組核苷酸序列a、 SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互補的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的I^raiOP796啟動子，其特征在于所述啟動子為含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的啟動子。
3.一種DNA構(gòu)建體，其特征在于所述DNA構(gòu)建體包含權(quán)利要求1所述的Ι^Ι^10Ρ796啟動子以及與之進行可操作連接的基因序列。
4.一種載體，其特征在于所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求3所述的 DNA構(gòu)建體。
5.一種重組細胞，其特征在于所述的重組細胞包含權(quán)利要求1所述的啟動子或權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求4所述的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的重組細胞，其特征在于所述的重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農(nóng)桿菌細胞。
7.一種含有權(quán)利要求1或2所述的啟動子或權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求 4所述的載體或權(quán)利要求5所述重組細胞的植物愈傷組織或植物。
8.如權(quán)利要求7所述的植物愈傷組織或植物為煙草。
9.如權(quán)利要求1或2所述的PsPR10P796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用。
10.如權(quán)利要求9所述的I^raiOP796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用，其特征在于所述的應用為I^raiOP796啟動子在在抗逆轉(zhuǎn)基因煙草中的應用，將抗逆基因置于 PsPR10P796啟動子下游，構(gòu)建植物表達載體，將載體導入煙草，得到抗逆轉(zhuǎn)基因煙草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PsPR10P796啟動子、DNA構(gòu)建體、載體、重組細胞、植物愈傷組織或植物及所述的PsPR10P796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用，所述啟動子含有下列任意一組核苷酸序列a、SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列；b、與SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列互補的序列；本發(fā)明PsPR10P796啟動子具有較高的根特異誘導表達活性，能夠提高下游抗逆基因根特異轉(zhuǎn)錄水平，從而能夠增強轉(zhuǎn)基因植物抗逆能力。
文檔編號C12N1/21GK102559675SQ20111038431
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者徐祥彬, 王慧中 申請人:杭州師范大學