專利名稱：一種以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)α -酮基丁酸的方法，具體地說，涉及利用以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細(xì)胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸作為底物，生產(chǎn)α -酮基丁酸的方法。
背景技術(shù)：
α-酮基丁酸是一種重要的中間體，可應(yīng)用于化學(xué)和藥物等領(lǐng)域。例如，α-酮基丁酸可用于生產(chǎn)L-異亮氨酸1、1-丙醇23、食品香料組分4以及D- α -羥基丁酸5。其中，D- α -羥基丁酸可用來制備azinothricin家族抗癌抗生素以及高聚物聚α -羥基丁酸 [Ρ(2ΗΒ)6。另外，α-酮基丁酸可轉(zhuǎn)變?yōu)長-α-氨基丁酸，而后者是合成左乙拉西坦等抗癲癇藥物的手性前體78。α -酮基丁酸的生產(chǎn)方法分為傳統(tǒng)的化學(xué)法和微生物催化法。前者指的是由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解而成0-酮基丁酸9。而文獻(xiàn)中報(bào)道的后者包括以下幾種以 1，2_丁二醇為起始底物，以馬紅球菌IF03730全細(xì)胞為催化劑，最終產(chǎn)物濃度為153. 8毫摩爾/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為68%，生產(chǎn)強(qiáng)度為4. 8毫摩爾/升/小時(shí)1°；以巴豆酸為起始底物， 以鋨和惡臭假單胞菌全細(xì)胞為催化劑，最終產(chǎn)物濃度為47毫摩爾/升，生產(chǎn)強(qiáng)度為9. 4毫摩爾/升/小時(shí)9；以DL-2-羥基丁酸為底物，以施氏假單胞菌SDM為催化劑，最終產(chǎn)物濃度為434. 9毫摩爾/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為91. 5%，生產(chǎn)強(qiáng)度為18. 1毫摩爾/升/小時(shí)11；以蘇氨酸為底物，粗糙脈胞菌的ilv-3突變體發(fā)酵產(chǎn)α -酮基丁酸78. 4毫摩爾/升，摩爾轉(zhuǎn)化率> 90%，生產(chǎn)強(qiáng)度為0. 7毫摩爾/升/小時(shí)4。1，2- 丁二醇、巴豆酸及DL-2-羥基丁酸只能通過化學(xué)法獲得，不能實(shí)現(xiàn)α-酮基丁酸的綠色生產(chǎn)。而蘇氨酸可以通過微生物發(fā)酵大規(guī)模獲得，全世界L-蘇氨酸的產(chǎn)量達(dá)到20，000噸12，非常適合作為α -酮基丁酸的起始底物。由L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化生成α-酮基丁酸，經(jīng)過了 L-蘇氨酸脫水酶催化的脫氨和脫水過程13。L-蘇氨酸脫水酶(L-蘇氨酸脫氨酶)分為合成型和降解型兩種。合成型L-蘇氨酸脫水酶在有氧條件下組成性表達(dá)，受到L-異亮氨酸的抑制；降解型L-蘇氨酸脫水酶厭氧條件下受L-蘇氨酸誘導(dǎo)表達(dá)，不受L-異亮氨酸的抑制141516。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，利用以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細(xì)胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸作為底物，生產(chǎn) α-酮基丁酸的方法還未見報(bào)道。參考文獻(xiàn)1Eggeling, I. , Codes, C. , Eggeling, L. , Sahm, H. , 1987. Regulation of acetohydroxy acid synthase in Corynebacterium glutamicum during fermentation of α -ketobutyrate to L-isoleucine. App1. Microbial. Biotechnol. 25,346-351.2Atsumi, S. , Hanai, T. , Liao, J. C. , 2008. Non-fermentative pathways for synthesis of branched—chain higher alcohols as biofuels. Nature 451,86-89.3Shen, C. R. , Liao, J. C. , 2008. Metabolic engineering of Escherichiacoli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways. Metab. Eng. 10,312-320.4Zurbriggen， B. D. ， Rekhif， N. ， Mehlmann-De-Campos, Μ. ， Lerch, K. ,2006. Production of α -ketobutyrate. U. S. patent 7144715.5Simon，E. S.，Plante，R. ,Whitesides,G. Μ. , 1989. D-Iactate dehydrogenase. Substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids. App1. Biochem. Biotechnol. 22，169-179.6Gao， C. ， Zhang, W. ， Ma, C. ， Liu, P. ， Xu, P. ，2011. Kinetic resolution of 2-hydroxybutanoate racemic mixtures by NAD-independent L-lactate dehydrogenase. Bioresour. Technol. 102，4595-4599.7Zhang，K.，Li，H.，Cho, K. Μ.，Liao，J. C. , 2010. Expanding metabolism for total biosynthesis of the nonnatural amino acid L-homoalanine. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 107,6234-6239.8Park，E.，Kim，M.，Shin，J. S.，2010. One-pot conversion of L-threonine mto L-homoalanine :biocatalytic production of an unnatural amino acid from a natural one. Adv. Synth. Catal. 352，3391-3398.9Furuyoshi，S.，Nawa, Y.，Kawabata, N. , 1991. Microbial production of 2-oxobutyric acid from crotonic acid. Agric. Biol. Chem. 55,123-128.10Nakahara，T.，Nakajima-kambe，T.，and Sato，S. , 1994. Production of 2-ketobutyric acid from 1，2—butanediol by resting cells ofRhodococcus equi IFO 3730. Biotechnol. Lett. 16，263-268.llGao，C. ， Zhang, W. ， Lv, C. ， Li， L. ，Ma, C. ，Hu, C. ，Xu, P. ，2010. Efficient production of 2-oxobutyrate from 2-hydroxybutyrate by using whole cells of Pseudomonas stutzeri stram SDM. Appl. Envrion. Microbiol. 76,1679-1682.12Debabov，V. G. ,2003. The threonine story. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 79，113-136.13Husain，A. ， Jeelani, G. ， Sato, D. ， Ali， V. ， Nozaki, Τ. , 2010. Characterization of two isotypes of L-threonine dehydratase from Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasito 1. 170,100—104.14Lam，V.M.S.，Chan，I.P.R.，Yeung，Y.G.，1980.Roleof L-threonine deaminase and L-threonine 3一dehydrogenase in the utilization of L-threonine by Pseudomonas aeruginosa· J. Gen. Microbiol. 117，539—542.15Umbarger，H. Ε. ,1956. Evidence for a negative-feedback mechanism in the biosynthesis of isoleucine.Science 123,848.16Luginbuhl，G.H.，Hofler，J. G.，Decedue，C. J.，Burns，R. 0.， 1974. Biodegradative L-threonine deaminase of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 120，559-561.
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細(xì)胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸作為底物，生產(chǎn)α -酮基丁酸的方法。本發(fā)明所述的以L-蘇氨酸作為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，步驟是(1)制備含生物催化劑的懸液選取假單胞菌屬、棒桿菌屬或芽孢桿菌屬等含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株，在 LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 2 7. 5磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2 4次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑；將生物催化劑重懸于上述磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為10 80克/升、生物催化劑濃度為40 150克濕細(xì)胞/升；在20 65°C,pH7. 0 11. 0條件下，以50 250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)1 30小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液將步驟O)的轉(zhuǎn)化液以5，000 14，000轉(zhuǎn)/分離心5 25分鐘，或者用200 400目濾布過濾，去除步驟O)中加入的生物催化劑，所得清液即為含α-酮基丁酸的溶液；(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測(cè)將上述含α-酮基丁酸的溶液于100°C加熱10分鐘，以5，000 14，000轉(zhuǎn)/分離
心1 10分鐘，將所得清夜用4%磺基水楊酸稀釋，4°C靜置過夜，離心后所得上清即為樣
P
ΡΠ Oα -酮基丁酸含量測(cè)定采用高效液相色譜AgilentllOO系統(tǒng)，層析柱為Aminex ΗΡΧ-87Η(美國)，分析條件為以10毫摩爾/升硫酸為流動(dòng)相，柱溫55°C，流速為0. 4毫升/ 分鐘，進(jìn)樣量5微升，采用示差折光檢測(cè)器。α -酮基丁酸的鑒定采用質(zhì)譜檢測(cè)。測(cè)定L-蘇氨酸濃度用氨基酸分析儀(Hitachi，L-8900，日本)。轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)生的α -酮基丁酸的物質(zhì)的量濃度+原L-蘇氨酸的物質(zhì)的量濃度)X 100%。上述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α -酮基丁酸的方法中步驟(1)所述含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株優(yōu)選施氏假單胞菌(I^eudomonas stutzeri) SDM CCTCC NO :M206010、谷氨酸棒桿菌 ATCC13032 或枯孢桿菌 ATCC23857。步驟( 所述L-蘇氨酸的濃度優(yōu)選20 60克/升；所述生物催化劑濃度優(yōu)選 60 120克濕細(xì)胞/升；所述溫度優(yōu)選30 60°C ；所述pH范圍優(yōu)選8. 0 10. 0 ；所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為2 M小時(shí)。本發(fā)明選用含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細(xì)胞作為生物催化劑，以 L-蘇氨酸作為底物，成功實(shí)現(xiàn)了 α-酮基丁酸的高效生產(chǎn)。本發(fā)明方法具有以下特點(diǎn)(1)菌體培養(yǎng)及反應(yīng)周期均較短。(2)底物L(fēng)-蘇氨酸生成α-酮基丁酸的轉(zhuǎn)化率高，可達(dá)99.6%以上。(3)產(chǎn)物α -酮基丁酸可積累到較高濃度。(4)所用菌株不需破碎，可直接用完整細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，操作方便。(5)利用完整細(xì)胞催化，無需添加價(jià)格昂貴的輔因子。
5
(6)生物催化劑可以通過過濾或離心去除，并且產(chǎn)物成分簡單，有利于后續(xù)分離提取。


圖1 α -酮基丁酸高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果。其中a為標(biāo)準(zhǔn)品，b為反應(yīng)樣品。圖2 產(chǎn)生的α -酮基丁酸質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。圖3 氨基酸分析儀檢測(cè)氨的生成。
具體實(shí)施例方式買施例1 (1)制備含生物催化劑的懸液選取施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸于磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為80克/升、生物催化劑濃度為150克濕細(xì)胞/升；在20°C，pH 11. 0條件下，以200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)20小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉(zhuǎn)化液，以12，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測(cè)將上述含α -酮基丁酸的溶液于100°C加熱10分鐘，以10，000轉(zhuǎn)/分離心10分
鐘，將所得清夜用4%磺基水楊酸稀釋，4°C靜置過夜，離心后所得上清即為樣品。α -酮基丁酸含量測(cè)定采用高效液相色譜AgilentllOO系統(tǒng)，層析柱為Aminex ΗΡΧ-87Η(美國)，分析條件為以10毫摩爾/升硫酸為流動(dòng)相，柱溫55°C，流速為0. 4毫升/ 分鐘，進(jìn)樣量5微升，采用示差折光檢測(cè)器。α -酮基丁酸的鑒定采用質(zhì)譜檢測(cè)。測(cè)定L-蘇氨酸濃度用氨基酸分析儀(Hitachi，L-8900,日本)。轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)生的α -酮基丁酸的物質(zhì)的量濃度+原L-蘇氨酸的物質(zhì)的量濃度)X 100%。經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)化液中α-酮基丁酸的濃度為34.2克/升，轉(zhuǎn)化率為49.9%。α-酮基丁酸的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，證實(shí)產(chǎn)物有α-酮基丁酸的生成。氨基酸分析儀測(cè)定樣品中有氨的生成，如圖3所示。產(chǎn)物為α-酮基丁酸和氨，證明本發(fā)明的以L-蘇氨酸作為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的過程是由L-蘇氨酸脫水酶催化的脫水脫氨過程。另外，由于微生物細(xì)胞是在有氧條件下培養(yǎng)，且培養(yǎng)過程不需要添加誘導(dǎo)劑，所以催化過程涉及到的L-蘇氨酸脫水酶為合成型的。實(shí)施例2 (1)制備含生物催化劑的懸液
選取枯草芽孢桿菌ATCC23857，在LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸于磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到 200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為10克/升、生物催化劑濃度為60克濕細(xì)胞/升；在30°C, pH 8. 0條件下，以200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)M小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉(zhuǎn)化液，以12，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)化液中α -酮基丁酸的濃度為0. 64克/升，轉(zhuǎn)化率為7. 5%。實(shí)施例3 (1)制備含生物催化劑的懸液選取施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸于磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為60克/升、生物催化劑濃度為120克濕細(xì)胞/升；在65°C，pH 7. 0條件下，以200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)M小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉(zhuǎn)化液，以12，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)化液中α-酮基丁酸的濃度為19.6克/升，轉(zhuǎn)化率為38. 1%。實(shí)施例4 (1)制備含生物催化劑的懸液選取谷氨酸棒桿菌ATCC13032，在LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸于磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到 200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為20克/升、生物催化劑濃度為40克濕細(xì)胞/升；在60°C，pH 10. 0條件下，以200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)20小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液
將上述轉(zhuǎn)化液，以12，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)化液中α -酮基丁酸的濃度為12. 1克/升，轉(zhuǎn)化率為70. 6%。實(shí)施例5 (1)制備含生物催化劑的懸液選取施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸于磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為30克/升、生物催化劑濃度為60克濕細(xì)胞/升；在50°C, pH 8. 0條件下，以200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)6小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉(zhuǎn)化液，以12，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，轉(zhuǎn)化液中α -酮基丁酸的濃度為25. 6克/升，轉(zhuǎn)化率為99. 6%。本發(fā)明中涉及的含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDMCCTCC NO :M206010為申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，該菌株先前已進(jìn)行了專利保護(hù)與保藏；谷氨酸棒桿菌ATCC13032及枯草芽孢桿菌ATCC23857購自美國模式培養(yǎng)物集存庫 (American type culture collection)。
權(quán)利要求
1.一種以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，步驟是(1)制備含生物催化劑的懸液選取假單胞菌屬、棒桿菌屬或芽孢桿菌屬含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株，在LB培養(yǎng)基中以常規(guī)搖瓶或者發(fā)酵罐方式有氧培養(yǎng)；分離并收集菌體，用PH 7. 2 7. 5磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2 4次，分離得到的微生物完整細(xì)胞即為生物催化劑；將生物催化劑重懸于上述磷酸鉀緩沖液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?2)轉(zhuǎn)化將步驟(1)中制得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為10 80克/升、生物催化劑濃度為40 150克濕細(xì)胞/升；在20 65°C, pH7. 0 11. 0條件下，以50 250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)1 30小時(shí)，得轉(zhuǎn)化液；(3)制取含α-酮基丁酸的溶液將步驟O)的轉(zhuǎn)化液以5，000 14，000轉(zhuǎn)/分離心5 25分鐘，或者用200 400 目濾布過濾，去除步驟O)中加入的生物催化劑，所得清液即為含α-酮基丁酸的溶液。
2.如權(quán)利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其特征在于，步驟(1)所述含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株選施氏假單胞菌(P.stutzerDSDM CCTCC NO M206010、谷氨酸棒桿菌ATCC13032或枯草芽孢桿菌ATCC23857。
3.如權(quán)利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其特征在于，步驟 ⑵所述的L-蘇氨酸的濃度是20 60克/升。
4.如權(quán)利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其特征在于，步驟(2)所述的生物催化劑濃度是60 120克濕細(xì)胞/升。
5.如權(quán)利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其特征在于，步驟 ⑵所述的溫度選30 60°C。
6.如權(quán)利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其特征在于，步驟 ⑵所述的PH范圍是8. 0 10. 0。
7.如權(quán)利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其特征在于，步驟 (2)所述的反應(yīng)時(shí)間為2 M小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以L-蘇氨酸為底物生產(chǎn)α-酮基丁酸的方法，其中產(chǎn)物α-酮基丁酸是以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細(xì)胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸為底物，在20～65℃，pH 7.0～11.0條件下，以50～250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩轉(zhuǎn)化后獲得。本發(fā)明的方法具有以下特點(diǎn)(1)采用生物催化的方法，反應(yīng)體系簡單，反應(yīng)條件溫和，步驟簡短，操作簡便；生物催化劑可以容易地除去，便于后續(xù)產(chǎn)物分離純化；(2)底物L(fēng)-蘇氨酸生成α-酮基丁酸的轉(zhuǎn)化率高，可達(dá)99.6％以上，產(chǎn)物α-酮基丁酸可積累到較高濃度；(3)底物L(fēng)-蘇氨酸價(jià)格低廉，易于獲得。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)α-酮基丁酸的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102433360SQ20111037623
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者張文, 許平, 馬翠卿, 高超 申請(qǐng)人:山東大學(xué)