專(zhuān)利名稱(chēng)：一株櫻桃根際促生假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株櫻桃根際促生假單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
櫻桃(Cerasuspseudocerasus (Lindl. )G. Don)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬 (Cerasus Mill.)植物，是落葉果樹(shù)中果實(shí)成熟最早的樹(shù)種之一，其果實(shí)色澤鮮艷、香味濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富，并具有一定的醫(yī)療保健價(jià)值。櫻桃施肥是櫻桃管理過(guò)程中的一個(gè)不可忽略的環(huán)節(jié)。施肥效應(yīng)除了受土壤、植物本身營(yíng)養(yǎng)特性和施肥量等的影響外，還與肥料品種等有關(guān)?，F(xiàn)階段櫻桃施肥以速效肥料為主，雖然大幅度的提高了櫻桃產(chǎn)量，但速效肥料養(yǎng)分利用率低下，容易造成土壤板結(jié)，地表水的富營(yíng)養(yǎng)化和地下水的污染，還會(huì)導(dǎo)致櫻桃果實(shí)品質(zhì)的急劇下降。眾所周知，微生物廣泛地存在于自然界中，與土壤肥力和作物微生態(tài)環(huán)境關(guān)系密切，所以許多學(xué)者將微生物與農(nóng)業(yè)聯(lián)系起來(lái)，開(kāi)創(chuàng)了微生物農(nóng)業(yè)工程。各類(lèi)微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用技術(shù)不斷被報(bào)道，微生物肥料就是其中之一。微生物肥料不僅能改良土壤，改善土壤區(qū)系的生態(tài)環(huán)境，還能有效提高植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收。因此，探尋新的肥料，尤其是生物質(zhì)肥料，以替代或部分替代化肥的研究備受關(guān)注。植物根際的微生物多而活躍，構(gòu)成了根際特有的微生物區(qū)系。植物根際促生細(xì)菌 (PGPR)是生存在植物根際范圍中，能直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸娴募?xì)菌統(tǒng)稱(chēng)。植物根際促生細(xì)菌可分泌植物促生物質(zhì)，包括植物激素、維生素、氨基酸和其它活性有機(jī)小分子及衍生物等；還可改善植物根際的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，有效控制植物病害等。植物根際促生細(xì)菌的類(lèi)群繁多，其中既有有益的種群，也有有害的種群。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已發(fā)現(xiàn)包括假單胞菌和芽抱桿菌等20多個(gè)屬的植物根際促生細(xì)菌具有防病促生潛能的報(bào)道。 目前，有關(guān)大櫻桃根際促生細(xì)菌菌株的篩選及應(yīng)用的研究未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一株櫻桃根際促生假單胞菌及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一株櫻桃根際促生假單胞菌，其分類(lèi)命名為假單胞菌pseudomonas sp.，已于2011 年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5319。所述櫻桃根際促生假單胞菌的菌落特征為在LB平板上培養(yǎng)24h后呈圓形不透明，表面光滑；菌體細(xì)胞大小為(0.5-1.0) μ mX (1.5-2.5) μ m;不產(chǎn)芽孢，G—，細(xì)胞直或微彎桿狀。所述櫻桃根際促生假單胞菌的生理生化特征為明膠液化試驗(yàn)陰性，淀粉水解試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性，伏-普試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性，硫化氫試驗(yàn)陰性，葡萄糖產(chǎn)酸陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)氣陰性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)陽(yáng)性，果糖試驗(yàn)陰性，蔗糖試驗(yàn)陰性，甘露醇試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，卵磷脂酶試驗(yàn)陰性，脲酶試陰性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性，賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性。所述櫻桃根際促生假單胞菌的最適培養(yǎng)條件為L(zhǎng)B培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏 5g，NaCl 10g，蒸餾水 1000ml。溫度37°C，pH 7.0。所述櫻桃根際促生假單胞菌可以用于制備微生物肥料。應(yīng)用時(shí)，培養(yǎng)櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，菌懸液作為液態(tài)肥料，菌懸液的濃度優(yōu)選為1.0X IO8CfuAil。或 培養(yǎng)櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，然后將菌懸液接種到有機(jī)肥中，制成櫻桃生物有機(jī)肥，菌懸液的濃度優(yōu)選為5. OX IO8Cfu/毫升，櫻桃有機(jī)肥中活菌數(shù)優(yōu)選為0. 5X 108cfu/g。所述有機(jī)肥為腐熟雞糞。本發(fā)明還提供了一種微生物肥料，是通過(guò)以下制備方法得到的培養(yǎng)櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，菌懸液作為液態(tài)肥料?；蚺囵B(yǎng)櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液， 然后將菌懸液接種到有機(jī)肥中，制成櫻桃生物有機(jī)肥。經(jīng)研究表明，本發(fā)明的櫻桃根際促生假單胞菌制備的菌懸液接種于櫻桃扦插苗可明顯促進(jìn)櫻桃根系生長(zhǎng)，提高細(xì)根(< 2mm)的比例，增加櫻桃苗地徑和苗高的生長(zhǎng)。與對(duì)照相比，差異達(dá)極顯著水平。將本發(fā)明的櫻桃根際促生假單胞菌接種到發(fā)酵雞糞中制成生物肥料，施用于六年生的大櫻桃根系周?chē)?，可顯著提高根系活力，活化土壤中的磷和鉀。以上研究結(jié)果表明，本發(fā)明的櫻桃根際促生假單胞菌能明顯促進(jìn)大櫻桃生長(zhǎng)發(fā)育，改善櫻桃根際土壤的生長(zhǎng)環(huán)境，本發(fā)明為將來(lái)開(kāi)發(fā)大櫻桃專(zhuān)用的微生物肥料提供了優(yōu)良的菌株資源， 將會(huì)得到廣泛的應(yīng)用。


一株櫻桃根際促生假單胞菌，菌株為YT3，該菌株分類(lèi)命名為假單胞菌 pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5319。
圖1為YT3處理組與對(duì)照組的櫻桃根系對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1櫻桃根際促生假單胞菌的篩選(1)篩選過(guò)程通過(guò)梯度稀釋法，從山東省泰安市櫻桃根際土樣中分離出73株分離物，從山東省淄博市沂源縣南麻櫻桃園的根際土樣中分離出373株分離物。通過(guò)三區(qū)劃線法對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化，并通過(guò)鏡檢判斷菌株是否純化，對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到LB斜面上保存?zhèn)溆?。通過(guò)保綠法篩選出25株保綠效果較好的菌株，結(jié)合蘿卜子葉增重法，最終篩選出1株具有良好促生效果的細(xì)菌，記為YT3。(2)菌落特征及菌體形態(tài)在LB平板上培養(yǎng)24h后呈圓形不透明，表面光滑。菌體細(xì)胞大小為(0.5-1.0) UmX (1. 5-2. 5) μ m。不產(chǎn)芽孢，G_，細(xì)胞直或微彎桿狀。(3)生理生化特征明膠液化試驗(yàn)陰性，淀粉水解試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性，伏-普試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性，硫化氫試驗(yàn)陰性，葡萄糖產(chǎn)酸陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)氣陰性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)陽(yáng)性，果糖試驗(yàn)陰性，蔗糖試驗(yàn)陰性，甘露醇試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，卵磷脂酶試驗(yàn)陰性，脲酶試陰性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性，賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性。(4) 16S rDNA 序列分析16SrDNA基因序列，見(jiàn)核苷酸序列表所示。將所測(cè)16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，結(jié)果表明YT3與I^seudomonas putida同處于一個(gè)最小分支上，其16S rDNA 序列與I^seudomonasputida^S^ZO)的相似性達(dá)97. 16%。結(jié)合菌落形態(tài)，生理生化特征和 16S rDNA序列分析，鑒定為假單胞菌I^seudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5319。實(shí)施例2盆栽試驗(yàn)將保存的櫻桃根際促生枯草芽孢桿菌YT3在LB斜面上活化，挑取一環(huán)接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，于37°C，ISOrpm條件下振蕩培養(yǎng)2天，調(diào)菌液含量為2. 5X IO8Cfu/ ml (懸液A)，備用。將櫻桃苗在懸液A中沾根后定植。將制備好的懸液A調(diào)菌液濃度至 1. OX 108CfU/ml (懸液B)，取50ml懸液B均勻澆灌于櫻桃苗根部周?chē)?。櫻桃苗在無(wú)菌水中沾根后，澆灌等量的無(wú)菌水為對(duì)照。正常管理，于當(dāng)年櫻桃苗停止后測(cè)定櫻桃根系的鮮重、 毛細(xì)根重、苗高和地徑。結(jié)果如表1和圖1所示。從表中可以看出，YT3處理櫻桃的總根重、細(xì)根重(< 2mm)、苗高和地徑均分別比對(duì)照提高了 18. 33%、66. 51%、15.和18. 84%。差異均達(dá)顯著水平。以上表明菌株 YT3對(duì)櫻桃生長(zhǎng)，尤其對(duì)毛細(xì)根的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。表 權(quán)利要求
1.一株櫻桃根際促生假單胞菌，其特征在于該菌株分類(lèi)命名為假單胞菌 pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5319。
2.權(quán)利要求1所述的櫻桃根際促生假單胞菌在制備微生物肥料中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用時(shí)，培養(yǎng)櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，菌懸液作為液態(tài)肥料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述菌懸液的濃度為1.OX 108CfU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用時(shí)，培養(yǎng)櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，然后將菌懸液接種到有機(jī)肥中，制成櫻桃生物有機(jī)肥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述菌懸液的濃度為5.OX 108CfU/ml，櫻桃生物有機(jī)肥中活菌數(shù)為0. 5X 108cfu/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述有機(jī)肥為腐熟雞糞。
8.—種微生物肥料，其特征在于是通過(guò)以下制備方法得到的培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，菌懸液作為液態(tài)肥料。
9.一種微生物肥料，其特征在于是通過(guò)以下制備方法得到的培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的櫻桃根際促生假單胞菌，得菌懸液，然后將菌懸液接種到有機(jī)肥中，制成櫻桃生物有機(jī)肥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株櫻桃根際促生假單胞菌，其分類(lèi)命名為假單胞菌pseudomonas sp.，已于2011年10月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5319。本發(fā)明還公開(kāi)了上述櫻桃根際促生假單胞菌在促進(jìn)櫻桃生長(zhǎng)中的應(yīng)用。該菌株制成菌劑接種于櫻桃扦插苗，結(jié)果表明，該菌劑可明顯促進(jìn)櫻桃根系生長(zhǎng)，提高細(xì)根的比例，增加櫻桃苗地徑和苗高的生長(zhǎng)。與對(duì)照相比，差異達(dá)顯著水平。將本發(fā)明的櫻桃根際促生假單胞菌接種到發(fā)酵雞糞中制成生物肥料，施用于六年生的大櫻桃根系周?chē)?，可顯著提高根系活力，活化土壤中的磷和鉀。以上研究結(jié)果表明，本發(fā)明的櫻桃根際促生假單胞菌能明顯促進(jìn)大櫻桃生長(zhǎng)發(fā)育，改善櫻桃根際土壤的生長(zhǎng)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102391972SQ20111037628
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者丁延芹, 劉方春, 姚良同, 杜振宇, 杜秉海, 邢尚軍, 陳波, 馬丙堯, 馬海林 申請(qǐng)人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院