專利名稱：一種萵苣原生質體的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物原生質體技術工程領域，具體涉及一種萵苣原生質體的提取方法。
背景技術：
萵苣(Lactuca sativa L.)為一年或者兩年生草本植物，屬菊科萵苣屬，萵苣可分為莖用和葉用兩種類型。莖用萵苣肉質鮮嫩，可生食、涼拌、炒食、干制或腌制；葉用萵苣主要食用葉片或葉球。萵苣含有豐富的胡蘿卜素、硫胺素、核黃素以及鈣、磷、銅、碘、錳等礦物質營養(yǎng)，碳水化合物的含量較低，而無機鹽、維生素則含量較豐富，尤其煙酸的含量頗豐， 系胰島素激活劑，糖尿病患者食之有益；萵苣中鉀離子含量為鈉鹽的27倍，有利于體內水鹽平衡，對于高血壓、心臟病患者有益，具有降低血壓和預防心率紊亂的作用。萵苣葉綠素能滋潤皮膚，清潔口腔；萵苣還有增進食欲、刺激消化液分泌、促進胃腸蠕動等功能。萵苣內含有多種重要化學物質，能中和消化過程中所產生的酸，有利于消化器官更好地吸收食物營養(yǎng)。生食萵苣，其Vc不致被破壞，有利于人體健康。萵苣葉的營養(yǎng)成分超過其莖部，被美食家譽為“綠色精靈”。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，萵苣中的一種芳香烴羥化脂，能夠分解食物中的致癌物質亞硝胺，對于肝癌、胃癌癌細胞的形成有一定的預防作用，也可減輕癌癥患者放療或化療的反應。萵苣廣泛栽培于世界各地，已成為人們喜愛的主要蔬菜。在一定程度上對萵苣進行種質創(chuàng)新，同樣適應現(xiàn)代化社會發(fā)展的需求。通過原生質體培養(yǎng)能得到由單細胞衍生出來的體細胞克隆，這是植物篩選高產，穩(wěn)定細胞系的良好途徑。因為萵苣的原生質體含有其個體的全部遺傳信息，在同一時間內獲得的大量原生質體在遺傳上是同質的；原生質體能夠克服性細胞的不親和障礙，便于進行遠緣體細胞雜交，從而獲得遠緣雜種；原生質體可直接攝取外緣的DNA、細胞器、病毒、質粒等，是進行遺傳轉化研究的理想受體，可以獲得轉基因萵苣；萵苣原生質體培養(yǎng)過程中，會產生一些次生代謝物，在技術成熟的條件下可以分離提取；因此利用原生質體培養(yǎng)途徑進行萵苣的種質資源創(chuàng)新不失為一種可行且有效的途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種萵苣原生質體的提取方法，該方法由萵苣無菌苗的培養(yǎng)、原生質體的質壁分離、原生質體的酶解以及原生質體的純化四個步驟完成。該方法以提高萵苣原生質體的活力，簡單易于操作，分離材料易于得到，酶解的方法簡單，去除細胞壁條件溫和，分離的原生質體得率高，活性強，易于萵苣原生質體的培養(yǎng)和植株再生，為原生質體融合奠定了基礎。另外原生質體的超低溫保存對于有優(yōu)良性狀的種質資源的保存也有極其重要的價值。本發(fā)明所述的一種萵苣原生質體的提取方法，按下列步驟進行
a、取萵苣種子，用自來水流動沖洗40-120 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒10-60s，用0. 1%升汞滅菌2-10 min，再用無菌水沖洗4_6次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS，溫度20 士 1 °C，光照2500-3000 lx，時間16 h/d，培養(yǎng)時間15-35d ；
C、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎后浸入原生質體清洗液+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理1-4小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片置于pH5.4-6. 2的酶液中，溫度20-28°C， 轉速40-80rpm，黑暗條件下震蕩12-16小時進行酶解；
e、將步驟d中的葉片組織，用300-500目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體，棄去上清液，加入原生質體清洗液+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液+15-25%的蔗糖溶液上， 1000r/min條件下離心5-lOmin，即可得到處于中間部分的萵苣原生質體。步驟b中的誘導培養(yǎng)基中含有蔗糖25_35g/L和瓊脂6_8g/L，pH值為5. 8。步驟d中所述酶液為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1_2%，離析酶 0. 2-0. 8%,甘露醇 9%-13%，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)3_7mmol/L，慶大霉素 0. 1-0. 5mg/ L,四環(huán)素0. 1-0. 5mg/L,氨芐3_5mg/L混合均勻。本發(fā)明所述方法簡單易于操作，分離材料易于得到，方法實用。酶解的方法簡單， 去除細胞壁條件溫和，分離的原生質體得率高，活性強，易于萵苣原生質體的培養(yǎng)和植株再生，為原生質體融合奠定了基礎。另外原生質體的超低溫保存對于有優(yōu)良性狀的種質資源的保存也有極其重要的價值。


圖1為本發(fā)明酶解和純化后的萵苣原生質體圖。
具體實施例方式本發(fā)明采用萵苣無菌苗為對象 實施例1
a、取萵苣種子，用自來水流動沖洗120min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒45s，0. 1%升汞滅菌5 min,無菌水沖洗4次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖30/L和瓊脂7g/L中，pH 值為5. 8，溫度20士 1 °C，光照30001x，時間16 h/d，培養(yǎng)20d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在25°C黑暗條件下，處理2小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.75的酶液中，在溫度25°C、 轉速54rpm搖床上黑暗條件下震蕩12小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1%，離析酶0.2%，甘露醇9%，2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸5mmol/L，慶大霉素0. lmg/L,四環(huán)素0. lmg/L,氨芐4mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用300目的細胞篩過濾，然后500r/min離心5min沉淀原生質體，棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW) +13%甘露醇的清洗液，輕輕混勻，進行原生質體清洗，1000r/min離心5min棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質 4體清洗液(CPW) +21%蔗糖的溶液上，1000r/min條件下離心6min，取中間部分即為分離純化后得到的萵苣原生質體；
再將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)，計數(shù)結果為4. 92Χ105個。實施例2:
a、取萵苣種子，用自來水流動沖洗40min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒60s，0. 1%升汞滅菌10 min，無菌水沖洗5次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖25g/L和瓊脂6g/L，pH值為 5. 8，溫度 20士 1 °C，光照 30001x，時間 16 h/d，培養(yǎng) 15d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理2小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.75的酶液中，溫度28°C、轉速40rpm黑暗條件下震蕩12小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1. 5%,離析酶0. 4%,甘露醇10%，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸，3mmol/L，慶大霉素 0. lmg/L,四環(huán)素0. lmg/L,氨芐3mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用300目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+15%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心5min，取處于中間部分的萵苣原生質體；
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)，計數(shù)結果為 0. 567Χ105 個。實施例3:
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗60 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒20s, 0. 1%升汞滅菌lOmin，無菌水沖洗6次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖30g/L和瓊脂6g/L，pH值為 5.8，溫度20士11，光照 260011，時間 16 h/d，培養(yǎng) 20d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理1小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.75的酶液中，在溫度20°C、 轉速60rpm黑暗條件下震蕩16小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1%，離析酶0.8%，甘露醇13%，2_ (N-嗎啡啉)乙磺酸5mmol/L，慶大霉素 0. 5mg/L,四環(huán)素0. 5mg/L,氨芐3mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用400目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+21%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心lOmin，取處于中間部分的萵苣原生質體；
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)，計數(shù)結果為 2. 72Χ105 個。實施例4:
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗100 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒40s，0. 1%升汞滅菌4 min,無菌水沖洗4次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖25g/L和瓊脂8g/L，pH值為 5. 8，溫度 20士 1°C，光照 28001x，時間 16 h/d，培養(yǎng) 25d ；
C、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理1小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.4的酶液中，溫度25V、轉速SOrpm黑暗條件下震蕩14小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1. 5%,離析酶0. 2%,甘露醇11%，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸7mmol/L，慶大霉素 0. 2mg/L,四環(huán)素0. 2mg/L,氨芐5mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用500目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+25%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心6min，取出中間部分的萵苣原生質體，
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)。計數(shù)結果為 2. 68Χ105 個。實施例5
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗80 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒30s，0. 1%升汞滅菌5min，無菌水沖洗6次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖35g/L和瓊脂8g/L，pH值為 5.8，溫度20士11，光照 300011，時間 16 h/d，培養(yǎng) 35d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理3小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.4的酶液中，溫度25V、轉速50rpm黑暗條件下震蕩12小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1. 5%,離析酶0. 5%,甘露醇13%，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸7mmol/L，慶大霉素 0. 2mg/L,四環(huán)素0. 2mg/L,氨芐4mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用300目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+22%的蔗糖溶液上，lOOOr/min條件下離心lOmin，取出中間部分的萵苣原生質體；將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)。計數(shù)結果為 1. 287Χ105 個。實施例6:
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗100 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒25s，0. 1%升汞滅菌6 min,無菌水沖洗5次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖35g/L和瓊脂7g/L，pH值為 5. 8，溫度 20士 1°C，光照 25001x，時間 16 h/d，培養(yǎng) 25d ；
C、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理3小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH6.0的酶液中，溫度25V、轉速60rpm黑暗條件下震蕩14小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1. 5%,離析酶0. 8%,甘露醇9%，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸5mmol/L，慶大霉素 0. 3mg/L,四環(huán)素0. 3mg/L,氨芐4mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用300目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+21%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心6min，取出中間部分的萵苣原生質體；
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)，計數(shù)結果為 0. 83Χ105 個。實施例7:
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗60min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒25s，0. 1%升汞滅菌6min，無菌水沖洗4次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖30g/L和瓊脂8g/L，pH值為 5.8，溫度20士11，光照 255011，時間 16 h/d，培養(yǎng) 30d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理2. 5小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH6.2的酶液中，溫度25°C、轉速 60rpm黑暗條件下震蕩11小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶2%，離析酶0. 2%,甘露醇13%，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸5mmol/L，慶大霉素0. Img/ L,四環(huán)素0. lmg/L,氨芐4mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用400目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+20%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心5min，取出中間部分的萵苣原生質體；
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)，計數(shù)結果為 1. 487X 105 個。實施例8:
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗80 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒60s，0. 1%升汞滅菌8min，無菌水沖洗6次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖28g/L和瓊脂7g/L，pH值為 5.8，溫度20士11，光照 265011，時間 16 h/d，培養(yǎng) 25d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理4小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.85的酶液中，溫度25°C、轉速75rpm黑暗條件下震蕩16小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶2%，離析酶0. 5%,甘露醇9%，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸5mmol/L，慶大霉素0. Img/ L,四環(huán)素0. lmg/L,氨芐4. 5mg/L混合均勻；
e、將步驟d中的葉片組織，用300目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+21%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心lOmin，取出中間部分的萵苣原生質體；
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)。計數(shù)結果為 1. 17Χ105 個。實施例9:
a取萵苣種子，用自來水流動沖洗40 min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒10s，0. 1%升汞滅菌2min，無菌水沖洗4次；
b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS、蔗糖28g/L和瓊脂7g/L，pH值為 5.8，溫度20士11，光照 285011，時間 16 h/d，培養(yǎng) 35d;
c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎以后浸入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在25°C黑暗條件下，處理4小時；
d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片Ig置于pH5.8的酶液中，溫度25°C、轉速 60rpm黑暗條件下震蕩12小時進行酶解，酶液成分為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶2%，離析酶0. 8%,甘露醇11%，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸5mmol/L，慶大霉素0. Img/ L,四環(huán)素 0. lmg/L,氨芐 4mg/L ；
e、將步驟d中的葉片組織，用500目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體， 棄去上清液，加入原生質體清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液(CPW)+25%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心9min，取出中間部分的萵苣原生質體；
將步驟e中分離純化的萵苣原生質體進行檢測取ΙΟΟμΙ放于Iml的離心管中用于鏡檢，首先使用奧林巴斯顯微鏡，在40倍物鏡下觀察原生質體的得率，再通過酚藏花紅進行染色、制片，在同樣的倍數(shù)下觀察活細胞的情況，用血球計數(shù)板對原生質體計數(shù)，計數(shù)結果為 2. 147X 105 個。
權利要求
1.一種萵苣原生質體的提取方法，其特征在于按下列步驟進行a、取萵苣種子，用自來水流動沖洗40-120min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒10-60s，用0. 1%升汞滅菌2-10 min，再用無菌水沖洗4_6次；b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS，溫度20士 1 °C，光照2500-3000 lx，時間16 h/d，培養(yǎng)時間15-35d ；C、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎后浸入原生質體清洗液+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25°C黑暗條件下，處理1-4小時；d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片置于pH5.4-6. 2的酶液中，溫度20-28°C， 轉速40-80rpm，黑暗條件下震蕩12-16小時進行酶解；e、將步驟d中的葉片組織，用300-500目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體，棄去上清液，加入原生質體清洗液+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液+15-25%的蔗糖溶液上， 1000r/min條件下離心5-lOmin，即可得到處于中間部分的萵苣原生質體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中的誘導培養(yǎng)基中含有蔗糖 25-35g/L 和瓊脂 6-8g/L，pH 值為 5. 8。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d中所述酶液為將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1_2%，離析酶0. 2-0. 8%,甘露醇9-13%，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸 3-7mmol/L,慶大霉素 0. 1-0. 5mg/L,四環(huán)素 0. 1-0. 5mg/L,氨芐 3_5mg/L 混合均勻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種萵苣原生質體的提取方法，該方法由萵苣無菌苗的培養(yǎng)、原生質體的質壁分離、原生質體的酶解以及原生質體的純化四個步驟完成。該方法以提高萵苣原生質體的活力，簡單易于操作，分離材料易于得到，酶解的方法簡單，去除細胞壁條件溫和，分離的原生質體得率高，活性強，易于萵苣原生質體的培養(yǎng)和植株再生，為原生質體融合奠定了基礎。另外原生質體的超低溫保存對于有優(yōu)良性狀的種質資源的保存也有極其重要的價值。
文檔編號C12N5/04GK102433294SQ20111037570
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權日2011年11月23日
發(fā)明者劉敏, 努爾波拉提, 寧慧霞, 徐琴, 王卉, 王曉軍, 郝秀英 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所