一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法
【專利摘要】一種進行高效制備蘆筍近緣野生種羊齒天門冬嫩莖原生質體的制備方法，其具體步驟是：(1)選取長10-15cm的羊齒天門冬嫩筍，剝掉鱗片，剪去頂端鱗片包被的部分，切成2-3cm小段，并用刀片削去表皮；(2)在自來水下輕輕擦洗10min，于無菌操作臺中，通過75％酒精消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗2次，再用10％的次氯酸鈉消毒10min，用無菌蒸餾水沖洗4次，并切成0.1-0.2cm薄片，無菌條件下稱量1.0g置于50mL無菌試管中；(3)在試管中加入適量酶解液，于25℃-28℃遮光的搖床上100rpm進行振蕩酶解；(4)酶解結束后，過濾酶液，除去未被酶解的剩余組織樣品，獲得含有該原生質體的過濾液，并通過離心、洗滌等步驟獲得純化的原生質體。
【專利說明】一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種植物原生質體的高效制備方法，具體是一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬原生質體的制備方法。
【背景技術】
[0002]蘆笑(Asparagus officinalis L.),又名石刁柏，屬天門冬科天門冬屬宿根性多年生草本植物，是一種具有很高營養(yǎng)價值的保健型蔬菜，在國際上享有“世界十大名菜之一”、“蔬菜之王”等美譽。蘆筍起源于歐亞大陸及北非河谷及草原地帶，栽培歷史已逾2500余年。因富含皂甙、蘆丁、硒、植物多糖、游離氨基酸及維生素等多種活性因子，具有很好的減肥、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂和降血糖等功效。目前，蘆筍種植及加工產業(yè)在我國發(fā)展迅速，我國的生產和出口量均占世界第一位，播種面積和出口量超過世界總量的50%，年產值達數百億元。然而，蘆筍栽培種遺傳背景狹窄，但值得可喜的是，蘆筍野生近緣種資源豐富，天門冬屬約含300個種，全球溫帶至熱帶地區(qū)幾乎均有分布，廣泛分布于我國南北各省，其中羊齒天門冬(Asparagus filicinus)是蘆筍近緣野生種中重要的一個種，其為多年生草本，根莖短、簇生、粗壯，呈紡錘形。莖直立、高50-70cm、綠色、圓柱形、下部分枝多、上部節(jié)間較短。葉狀枝5-8枚簇生、扁平、鐮刀狀、綠色有光澤，長3-15mm，寬約0.8-2mm。葉退化為鱗葉狀、極小、膜質。廣泛分布于我國山西、河南、陜西、甘肅、湖南、貴州和云南等地。我們多年研究工作證明，其高抗病蟲害，可作為蘆筍新品種選育的重要野生資源。然而，我們研究發(fā)現常規(guī)條件下其無法與蘆筍進行種間授粉雜交，存在嚴重的種間不親和性，因而急需尋找原生質體融合等新的方法來嘗試解決他們之間的不親和性，以便將野生資源中的優(yōu)良基因和性狀轉移至蘆筍栽培種中去，用于蘆筍新品種選育。鑒于羊齒天門東在拓展蘆筍栽培種遺傳背景狹窄現狀上的重要作用，十分有必要對其進行深入研究，原生質體融合技術將為種間雜交新品種選育和遺傳改良提供極大的方便，而目前國內外尚未見蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體制備體系相關報道，因此本發(fā)明方法將為后續(xù)蘆筍新品種選育和遺傳改良提供重要的基礎，意義十分重要。
【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是:
[0004]提供一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬原生質體的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案及具體操作步驟如下:
[0006](I)選取長10-15cm的興安天門冬嫩筍，剝掉鱗片，剪去頂端鱗片包被的部分，切成2-3cm小段，并用刀片削去表皮；
[0007](2)在自來水下輕輕擦洗IOmin ；
[0008](3)于無菌操作臺中，通過75%酒精消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗2次；
[0009](4)用10%的次氯酸鈉消毒lOmin，用無菌蒸餾水沖洗4次；
[0010](5)用無菌棉布吸干嫩筍表面蒸餾水，將上述嫩筍小段切成0.1-0.2cm薄片，無菌條件下稱量1.0g置于50mL無菌試管中；
[0011](6)在試管中加入IOmL纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶的混合酶液，于25°C -28°C遮光的搖床上IOOrpm進行振蕩酶解，滲透壓穩(wěn)定劑組成成分為:0.1 % MES+0.2 %的CaCl2.2H20+0.8mol / L葡萄糖；所述混合酶液由下列重量配比的物質組成:纖維素酶5g / L、果膠酶3g / L、蝸牛酶5g/L、滲透壓穩(wěn)定劑組成成分為:0.1% MES+0.2%的CaCl2.2H20+0.8mol / L葡萄糖；配置好后用直徑為0.45um的超微微孔濾膜過濾除菌；
[0012](7)酶解結束后，用200目不銹鋼濾網過濾酶液，除去未被酶解的剩余組織樣品，獲得含有該原生質體的過濾液，濾液于溫度4°C、轉速3000-4000r / min、離心分離5-10min,使原生質體沉淀；棄上清液，用濃度0.8mol / L的蔗糖溶液洗滌1_2次，保留沉降的原生質體；原生質體純化采用KMG溶液(改進的KM培養(yǎng)基，其中葡萄糖濃度為0.75mol /L)和蔗糖密度離心法，在離心管中加入0.8mol / L的蔗糖8mL，并于管壁小心加入KMG溶液2mL,溫度4°C下3000-4000r / min離心5_10min,收集懸浮于兩液相之間的鹿糖溶液頂部形成的原生質體帶；稀釋至一定體積后進行計數，測定原生質體產量。
[0013]本發(fā)明效果是:
[0014]1.制備工藝簡單，易操作；
[0015]2.本發(fā)明所述方法制備的羊齒天門冬原生質體大小均一，形態(tài)近似圓形，原生質體制備數較高。本發(fā)明選用經過酒精和次氯酸鈉消毒處理后的羊齒天門冬新鮮嫩筍制備原生質體，為獲得較高的原生質體產量提供了基礎。不同的水解酶、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時間等對植物細胞壁的酶解及原生質體的形成非常重要。本發(fā)明選用0.1% MES+0.2%的CaC12-2H20+0.8mol / L葡萄糖作為滲透壓穩(wěn)定劑，水解酶由纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶按一定比例混合而成，酶解時間為4.0h，這些均為高效制備原生質體提供了重要基礎。
[0016]本發(fā)明所述方 法易于操作，對設備要求低，能夠克服污染，與傳統的機械法相比，能獲得高產量的羊齒天門冬嫩筍原生質體，采用田間嫩莖作為原生質體分離材料，取材方便，省去組培擴繁時間，同時酶解時間短，有效提高了原生質體制備的效率。本發(fā)明為羊齒天門冬原生質體的制備提供了一種具有實際意義操作方法，為進一步的采用原生質體融合、遺傳轉化、植株再生、克服種間雜交障礙的蘆筍新品種選育等研究提供了重要的技術儲備。
【具體實施方式】
[0017]一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬原生質體的制備方法提供了適合高效制備近緣野生種羊齒天門冬原生質體的方法。
[0018]實例一:選取長10-15cm的興安天門冬嫩筍，剝掉鱗片，剪去頂端鱗片包被的部分,切成2-3cm小段,并用刀片削去表皮。在自來水下輕輕擦洗IOmin,于無菌操作臺中,通過75%酒精消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗2次；用10%的次氯酸鈉消毒lOmin，用無菌蒸餾水沖洗4次。用無菌棉布吸干嫩筍表面蒸餾水，將上述嫩筍小段切成0.1-0.2cm薄片，無菌條件下稱量1.0g置于50mL無菌試管中；在試管中加入10mL3g / L纖維素酶、Ig / L果膠酶和5g / L蝸牛酶的混合酶液(pH5.8)，于25°C遮光的搖床上IOOrpm進行振蕩酶解2.5h，采用0.1 % MES+0.CaCl2.2H20+0.8mol / L葡萄糖做滲透壓穩(wěn)定劑，可得到濃度為
2.2 X IO6個/ mL原生質體懸液。[0019]實例二:選取長10-15cm的興安天門冬嫩筍，剝掉鱗片，剪去頂端鱗片包被的部分,切成2-3cm小段,并用刀片削去表皮。在自來水下輕輕擦洗IOmin,于無菌操作臺中,通過75%酒精消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗2次；用10%的次氯酸鈉消毒lOmin，用無菌蒸餾水沖洗4次。用無菌棉布吸干嫩筍表面蒸餾水，將上述嫩筍小段切成0.1-0.2cm薄片，無菌條件下稱量1.0g置于50mL無菌試管中；在試管中加入10mL5g / L纖維素酶、3g / L果膠酶和5g / L蝸牛酶的混合酶液(pH5.8)，于28°C遮光的搖床上IOOrpm進行振蕩酶解4.0h,采用0.1 % MES+0.CaCl2.2H20+0.8mol / L葡萄糖做滲透壓穩(wěn)定劑，可得到濃度為
4.1 X IO6個/ mL原塵 質體懸液。
【權利要求】
1.一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法，其特征在于包括下列操作步驟: (1)選取長10-15cm的羊齒天門冬嫩筍，剝掉鱗片，剪去頂端鱗片包被的部分，切成2-3cm小段，并用刀片削去表皮； (2)在自來水下輕輕擦洗IOmin； (3)于無菌操作臺中， 通過75%酒精消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗2次； (4)用10%的次氯酸鈉消毒lOmin，用無菌蒸餾水沖洗4次； (5)用無菌棉布吸干嫩筍表面蒸餾水，將上述嫩筍小段切成0.1-0.2cm薄片，無菌條件下稱量1.0g置于50mL無菌試管中； (6)在試管中加入IOmL纖維素酶、果膠酶和蝸牛酶的混合酶液，于25°C -28 °C遮光的搖床上IOOrpm進行振蕩酶解，滲透壓穩(wěn)定劑組成成分為:0.1 % MES+0.2 %的CaCl2.2Η20+0.8mol / L葡萄糖，配置好后用直徑為0.45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌；所述混合酶液由下列重量配比的物質組成:纖維素酶5g / L、果膠酶3g / L、蝸牛酶5g / L、滲透壓穩(wěn)定劑； (7)酶解結束后，用200目不銹鋼濾網過濾酶液，除去未被酶解的剩余組織樣品，獲得含有該原生質體的過濾液，濾液于溫度4°C、轉速3000-4000r / min、離心分離5_10min,使原生質體沉淀；棄上清液，用濃度0.8mol / L的蔗糖溶液洗滌1-2次，保留沉降的原生質體；原生質體純化采用KMG溶液和蔗糖密度離心法，在離心管中加入0.8mol / L的蔗糖8ml，并于管壁小心加入KMG溶液2ml，溫度4°C下3000_4000r / min離心5-10min，收集懸浮于兩液相之間的蔗糖溶液頂部形成的原生質體帶；稀釋至一定體積后進行計數，測定原生質體產量。
2.根據權利要求1所述的一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法，其特征在于:步驟(6)的酶解條件為酶液pH值為5.8，溫度保持25V _28°C，遮光的搖床上IOOrpm進行振蕩酶解，混和酶液組成為纖維素酶5g / L、果膠酶3g / L、蝸牛酶5g / L，滲透壓穩(wěn)定劑為0.1% MES+0.2%的CaCl2.2H20+0.8mol / L葡萄糖，酶解時間4.0h。
3.根據權利要求1所述的一種蘆筍近緣野生種羊齒天門冬的原生質體的制備方法，其特征在于:所述KMG溶液為改進的KM培養(yǎng)基，其中葡萄糖濃度為0.75mol / L。
【文檔編號】C12N5/04GK103468631SQ201310379690
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月20日 優(yōu)先權日:2013年8月20日
【發(fā)明者】張岳平, 陳光宇, 羅紹春, 周勁松, 湯泳萍, 黃燕萍, 謝啟鑫, 趙萍 申請人:江西省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所