專利名稱：以調(diào)節(jié)化學(xué)發(fā)光為手段分析被分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用標(biāo)記了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的材料而進(jìn)行的分析物質(zhì)的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種在較寬范圍內(nèi)，通過減少化學(xué)發(fā)光的數(shù)量而進(jìn)行的分析試驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
在所有的針對實(shí)驗(yàn)中的被分析物的分析方法中，溶液都被探針標(biāo)記了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。通過測量化學(xué)發(fā)光的數(shù)量，該方法被廣泛地用于高靈敏地確定被分析物質(zhì)的量。該方法用于合適數(shù)量的被分析物。然而，當(dāng)存在大量的被分析物(例如通過象聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生許多拷貝時)時，化學(xué)發(fā)光的數(shù)量超出了該方法測量裝置的測定極限，使準(zhǔn)確的分析變得不可能了。測量結(jié)果超過分析上限的樣品，通過稀釋試驗(yàn)溶液再次測定。這種工藝非常費(fèi)事。特別地，通過基因擴(kuò)增而擴(kuò)增的樣品，可能因稀釋而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。需要極端小心以避免污染，更進(jìn)一步增加了勞動。為了擴(kuò)寬分析范圍而不需稀釋樣品，除了期待測量裝置的改進(jìn)外別無選擇。
作為發(fā)明人，我們發(fā)現(xiàn)以上超過分析限制范圍的樣品的測定的問題可以通過減少化學(xué)發(fā)光的數(shù)量而加以解決，而不需要諸如稀釋樣品的費(fèi)力操作，也不需要測量裝置的改進(jìn)。這個發(fā)現(xiàn)使我們完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的公開本發(fā)明是一種利用標(biāo)記了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的材料對物質(zhì)進(jìn)行分析的方法，該方法包括降低化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種分析方法，包括添加猝滅劑和/或降低化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針的特定活性。
以上表明，利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的材料進(jìn)行物質(zhì)的分析指的是，比如把含有被分析物的樣品與標(biāo)記了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的材料反應(yīng)，然后測量該共軛物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光的數(shù)量以檢測或測定被分析物。
附圖的簡要說明

圖1表示添加酚紅對血清中HBV模板的定量擴(kuò)增和檢測的影響；圖2表示添加未標(biāo)記的探針對血清中HBV模板的定量擴(kuò)增和檢測的影響。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式(1)通過添加猝滅劑降低化學(xué)發(fā)光的數(shù)量用于本發(fā)明的猝滅劑可以是任何能猝滅化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)。例如，它包括色料和印度油墨(印度油墨滴劑，即度油墨上清液)。色料的例子有結(jié)晶紫，溴酚藍(lán)，胭脂紅酸，氯酚紅，蘇木紫，溴酚紫，溴酚紅，玫紅酸，酚紅，甲酚紅，和異甲酚紅。
色料用作猝滅劑時，在測量化學(xué)發(fā)光時的色料濃度可在0.01-10％，最好在0.01-1％的范圍內(nèi)，盡管它隨著所用色料不同而不同。另一方面，印度油墨用作猝滅劑時，其在測量化學(xué)發(fā)光時的量可以在0.01-50％，最好在1-20％的范圍內(nèi)，依試液的量而定。猝滅劑可以在測量化學(xué)發(fā)光之前的任何時間加入。例如，可以在被分析物與標(biāo)記探針反應(yīng)前或反應(yīng)后加入。
(2)通過降低化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針的特定活性而減少化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。
本發(fā)明中，為了降低標(biāo)記探針的特定活性，將一個未標(biāo)記探針加到標(biāo)記的探針上。未標(biāo)記探針的加入量可以在0.1-105，最好10-103的范圍，相對于標(biāo)記探針的1。
(3)結(jié)合方法(1)和方法(2)本發(fā)明中，猝滅劑的加入和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針的特定活性的降低可以結(jié)合起來。這種結(jié)合使用兩種方法的條件是遵守上述的范圍。
按照本發(fā)明，分析方法的使用確?；瘜W(xué)發(fā)光的數(shù)量能夠被準(zhǔn)確地測量，甚至當(dāng)樣液中被分析物的量大得超過分析的極限范圍時也是如此。舉例來說，從微生物或細(xì)胞的遺傳信息(DNA或RNA)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，可以很容易地檢測或定量測定被分析物。這個辦法可以從將在后面提供的實(shí)施例1-4中得到證實(shí)。
在涉及加入猝滅劑的方法中，不僅正信號而且背景(噪聲)的水平也降低了。這種化學(xué)發(fā)光數(shù)量的降低使得定量地測量強(qiáng)的正信號成為可能，而背景(噪聲)水平的降低使得分辨弱的正信號成為可能。總之，猝滅劑的加入確保了分析高強(qiáng)正信號的樣品又不影響弱的正信號的分辨。這種作用將為以后將要提供的實(shí)施例1-3所證實(shí)。
將本發(fā)明用于減少化學(xué)發(fā)光的數(shù)量，檢測或定量測定超過分析極限范圍的樣品或具有高強(qiáng)正信號水平的樣品。特別地，添加猝滅劑的方法也降低了背景(噪聲)水平。這樣，有高強(qiáng)正信號的樣品可以得到測量而不影響弱的正信號的樣品的分析。因此，本發(fā)明的方法證明是極好的方法，它能擴(kuò)寬分析范圍而不用稀釋樣品或改進(jìn)測量裝置。
實(shí)施例現(xiàn)在參考實(shí)施例更加詳細(xì)地說明本發(fā)明，對于實(shí)施例的說明并不限定本發(fā)明。
〔實(shí)施例1〕方法5μl含有HBV-DNA序列的人血清(Galibert，F(xiàn).，Mandavt，E.，F(xiàn)itioussiF.，Tiollais，P.and Charnay，P.，Nature281,646-650(1979)(每次擴(kuò)增50-5,000份)與20μl堿溶液(pH13)混和，然后在97℃加熱5分鐘。在室溫下，讓混和物涼10分鐘，再用緩沖液中和。加入兩種引物，在室溫下退火。加入DNA和RNA聚合酶后，在37℃進(jìn)行基因擴(kuò)增(用正式出版的日本專利公報號500759/92所述的方法)。擴(kuò)增產(chǎn)物與吖啶酯標(biāo)記的探針在60℃雜交，之后，用HPA方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物(Arnold JR，L.J.，Hammond，P.w.，Wiese，W.A.andNelson，N.C.，Clinical Chemistry 35，1588-1594(1988))。通過測量化學(xué)發(fā)光來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，研究了添加酚紅的影響。酚紅以0.05％的量加入到用于化學(xué)發(fā)光測量的試液中以測量化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。測量結(jié)果與從不含酚紅的試液得到的結(jié)果比較。結(jié)果如圖1所示。
討論如圖1所示，不含酚紅的樣品在大約500GE(基因組當(dāng)量)/AMP時，幾乎達(dá)到了分析極限(飽和值)，在該值以上，化學(xué)發(fā)光的數(shù)量不再呈線性關(guān)系。對于含有酚紅的樣品，化學(xué)發(fā)光的數(shù)量甚至在5000GE/AMP時還保持線性關(guān)系。這意味著添加酚紅使得500GE/AMP或以上的分析變?yōu)榭赡?。與不含酚紅的樣品相比，含酚紅的樣品顯著地降低了背景(噪聲)水平(DNA含量＝0)，這樣就使分析弱的正當(dāng)信號的樣品(大約50GE/AMP)成為可能。換一句話說，酚紅的加入確保能分析強(qiáng)正信號的樣品而不會影響弱的正信號的樣品的測定。
〔實(shí)施例2〕方法在檢測如實(shí)施例1中通過基因擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物時，加入不同量的酚紅以研究添加酚紅的影響。以0.025-0.2％的量，將酚紅加入到用于化學(xué)發(fā)光測量的試液中以測量化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。測量結(jié)果與用不含酚紅的試液得到的結(jié)果比較。結(jié)果如表1所示。
表1酚紅對測定化學(xué)發(fā)光數(shù)量的影響

討論如表1所示，正樣的化學(xué)發(fā)光的數(shù)量與負(fù)樣的化學(xué)發(fā)光數(shù)量的減少依賴于所添加的酚紅的量。這些發(fā)現(xiàn)表明，在很寬的酚紅濃度范圍內(nèi)，本發(fā)明方法都是可行的。
〔實(shí)施例3〕方法以與實(shí)施例2同樣的方式進(jìn)行試驗(yàn)，除了用商業(yè)上可得到的印度油墨代替酚紅之外。
向用于化學(xué)發(fā)光測量的試液中加入1.25％-10％體積的印度油墨，測量化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。結(jié)果如表2所示，與不含印度油墨的試液的測量結(jié)果比較。
表2印度油墨對測定化學(xué)發(fā)光數(shù)量的影響

討論如表2所示，正樣的化學(xué)發(fā)光的數(shù)量與負(fù)樣的化學(xué)發(fā)光(背景)數(shù)量的減少依賴于所添加的印度油墨的數(shù)量。這些發(fā)現(xiàn)證明本發(fā)明方法可在很寬的印度油墨濃度范圍內(nèi)使用。
方法與實(shí)施例1中同樣的方式進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物與吖啶酯標(biāo)記的探針在60℃下雜交，同時加入不同數(shù)量的未標(biāo)記探針。相對于標(biāo)記探針的1，未標(biāo)記探針的量為10-1000。雜交后，樣品中化學(xué)發(fā)光的數(shù)量用HPA方法測量。結(jié)果如圖2所示，與不含未標(biāo)記探針的試液的測量結(jié)果比較。
討論如圖2所示，不含未標(biāo)記探針的樣品在500-5000GE/AMP時幾乎達(dá)到分析極限(飽和值)，高于該值，化學(xué)發(fā)光的數(shù)值不再呈線性。相反，含有未標(biāo)記探針的樣品，表現(xiàn)出化學(xué)發(fā)光的數(shù)量的減少依賴于添加的未標(biāo)記探針的數(shù)量。當(dāng)添加的未標(biāo)記探針的量與標(biāo)記探針的量的相對值為100(未標(biāo)記探針)1(標(biāo)記探針)或更高時，甚至在大約500,000GE/AMP時，分析都是可能的。這樣，添加未標(biāo)記探針使得分析500-500,000 GE/AMP或更高值變得可能。
權(quán)利要求
1.一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的材料對被分析物進(jìn)行分析的方法，包括減少化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。
2.權(quán)利要求1所述的分析方法，包括添加猝滅劑和/或降低化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針的特定活性。
3.權(quán)利要求1所述的分析方法，包括添加一種猝滅劑。
4.權(quán)利要求1所述的分析方法，包括降低一種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針的特定活性。
5.權(quán)利要求3所述的分析方法，其中色料和/或印度油墨用作猝滅劑。
6.權(quán)利要求4所述的分析方法，其中把未標(biāo)記的探針加到化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針上以降低其特定活性。
全文摘要
一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的材料對被分析物進(jìn)行分析的方法,包括添加猝滅劑和/或降低化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的探針的特定活性,從而減少化學(xué)發(fā)光的數(shù)量。
文檔編號G01N21/76GK1172530SQ96191746
公開日1998年2月4日 申請日期1996年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月2日
發(fā)明者逵保宏, 上參鄉(xiāng)慶一, 大光男 申請人:中外制藥株式會社