專利名稱：大豆轉錄活性蛋白GmPHD5及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種大豆轉錄活性蛋白GmPHD5及其編碼基因與應用。
背景技術：
環(huán)境中物理、化學因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對植物的生長發(fā)育具有重要影響，嚴重時會造成農作物大規(guī)模減產，因此培育耐逆性高的作物是種植業(yè)的主要目標之一。目前，應用基因工程技術進行育種已經成為提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細胞具有多條途徑應答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉錄因子起著調控耐逆相關效應基因表達的作用?，F(xiàn)已在植物中發(fā)現(xiàn)了多類與植物耐逆性相關的轉錄因子，例如:EREBP/AP2中的DREB類，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)類具有轉錄活性的蛋白廣泛存在于動植物以及細菌、病毒蛋白中，比如哺乳動物的CBP類蛋白、人的INGl家族、酵母Yng2p蛋白、病毒MIRl蛋白。PHD類蛋白結構域是C4HC3類的鋅指結構，其功能主要為以下幾類:(I)作為乙?；蛉ヒ阴；竻⑴c染色質相關的轉錄調控；(2)作為E3泛素連接酶參與蛋白降解；(3)作為PIPs受體感知PIPs信號參與染色質相關的轉錄調控。在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了 PHD類蛋白，植物中該類蛋白的功能研究尚少。
大豆是我國五大作物之一，弄清其耐非生物脅迫分子機理，進而為提高其耐逆性提供基礎，具有重要的理論及現(xiàn)實意義。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆轉錄活性蛋白GmPHD5及其編碼基因與應用。
本發(fā)明所提供蛋白，名稱為GmPHD5,來源于大豆屬大豆(Glycine max(L.)),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。
其中，序列表中的序列2由252個氨基酸殘基組成。
上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白GmPHD5的編碼基因GmPHD5也屬于本發(fā)明的保護范圍。
該基因可為如下⑴或⑵或⑶的DNA分子:
(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子;
(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90% 、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
所述嚴格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5MNaPOJP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC，0.1% SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1% SDS 和 I X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。
其中，序列表中的序列I由759個脫氧核苷酸組成，本序列為GmPHD5基因的讀碼框，編碼具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列的蛋白質。
含有本發(fā)明基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述重組載體具體為將蛋白GmPHD5的編碼基因插入pBIN438載體的BamHI和KpnI識別位點間得到的重組載體；
本發(fā)明還保護了擴增上述蛋白GmPHD5的編碼基因全長或其任意片段的引物對。
上述引物對可為擴增GmPHD5的所有引物對，具體可為如下⑴或(II):
(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對；
(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對。
上述蛋白、基因、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應用是本發(fā)明保護的范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
本發(fā)明提供的方法，是將上述蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。
在該方法中，所述蛋白的編碼基因通過所述重組載體導入所述目的植物中；
在該方法中，所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性；
在該方法中，所述耐旱性體現(xiàn)在增加根長、提高發(fā)芽率和/或提高存活率；
在該方法中，所述耐鹽性體現(xiàn)在提高存活率；
在該方法中，所述目的植`物為雙子葉或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或豆科植物。在本發(fā)明的一個實施例中為擬南芥。
所述轉基因植物理解為不僅包含將所述基因轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。將所述基因導入目的植物，會使所述蛋白質目的植物中合成，進而是目的植物的耐逆性性狀得到改良。
所述基因可先進行如下修飾，再導入宿主中，以達到更好的表達效果:
I)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60% ；
2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；
3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調節(jié)、發(fā)育調節(jié)、化學調節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
4)與適合的轉錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接。
5)引入增強子序列，如內含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。
在實際操作中，也可以將本發(fā)明基因進行細胞靶向定位?？衫帽绢I域現(xiàn)有的技術實現(xiàn)。例如，將來源于靶向細胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導入植物細胞中，就可定位了。
攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
本發(fā)明的實驗證明，GmPHD5的表達在耐逆性大豆品種晉豆23中受高鹽、干旱和低溫誘導，也受植物激素脫落酸ABA的誘導。已知ABA與植物非生物脅迫應答相關，因此GmPHD5可能與植物對非生物逆境應答的調控相關。之后將GmPHD5基因經農桿菌介導，導入模式植物擬南芥中，獲得了過量表達GmPHD5基因的植株，轉基因植株與對照相比，其耐鹽和耐旱性均有顯著提高，GmPHD5基因能夠顯著提高植物的耐鹽、耐旱性。說明GmPHD5參與植物對非生物脅迫應答的調控。
本發(fā)明對于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價值，可用于農牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對提高農作物產量具有重要意義。并且從分子生物學角度證明了 PDH家族中的一些成員確實參與植物對非生物脅 迫應答的調控，其表達與植物的耐非生物脅迫呈正相關。
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為GmPHD5基因在高鹽、低溫、干旱及ABA (脫落酸)處理時的轉錄特征
圖2為植物表達載體pBIN438-GmPHD5的示意圖
圖3為GmPHD5過表達轉基因植株的分子鑒定
圖4為GmPHD5過表達植株的耐鹽性鑒定
圖5為GmPHD5過表達植株和對照在鹽脅迫下的發(fā)芽率比較
圖6為GmPHD5過表達植株與對照的耐鹽性鑒定
圖7為GmPHD5過表達植株與對照在鹽脅迫下的根長比較
圖8為GmPHD5過表達植株和對照在干旱脅迫下的存活率比較具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，數(shù)據(jù)為三次重復實驗的平均值或平均值土標準差。
大豆晉豆23(JD23)及旱敏鹽敏品種灰布支(HBZ)記載在Wei W，Huang J,Hao YJ,Zou HF，Wang HW,Zhao JY,Liu XY，Zhang WK,Ma B,Zhang JS and Chen SY (2009)SoybeanGmPHD-Type Transcription Regulators Improve Stress Tolerance in TransgenicArabidopsis Plants.PLoS ONE，4 (9)，e7209.公眾獲得山西農科院經濟作物所同意后可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得；
pBIN438載體(雙元表達載體)由方榮祥院士惠賜。記載于李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲轉基因煙草的研究[J].中國科學(B輯)，1994，24 (3):276-282.，公眾經方榮祥院士同意后可以從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。
實施例1、大豆GmPHD5及其編碼基因的`篩選及其cDNA的克隆
1、大豆GmPHD5及其編碼基因的獲得
以大豆抗旱品種晉豆23(JD23)和旱敏感品種灰布織(HBZ，由山西農科院經作所劉學義研究員提供)為材料，通過cDNA-AFLP的方法篩選得到60余個差異表達基因，其中有一個296bp片段，該片段經BLAST大豆EST數(shù)據(jù)庫表明其為包含PHD結構域的鋅指蛋白，在比對中發(fā)現(xiàn)在多個物種的旱、鹽cDNA庫中有該基因的同源序列。經在大豆EST數(shù)據(jù)庫中比對得到6個該家族成員，分別命名為GmPHDl-6。其中基因GmPHD5具有序列表中序列I的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由252個氨基酸殘基組成。
根據(jù)GmPHD5基因序列設計引物:
GmPHD5 sense:5 ‘-ATGGAAGGAGTACCGCACCCAATA-3 ’(序列 3)，
GmPHD5 antisense:5 ‘-TCAAACTCTAACCCTCTTGTTACT-3’(序列 4)
應用RT-PCR方法，從大豆總RNA中擴增GmPHD5基因。取晉豆23 (JD23)葉片，置于液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入無水乙醇進行沉淀，最后將沉淀溶于水中得到總RNA。取5 μ g總RNA用反轉錄試劑盒(Promega公司)按試劑盒的方法進行反轉錄，以得到的cDNA片段為模板進行PCR擴增反應。20 μ I PCR反應體系為:1μ I 一鏈。0嫩(0.05 48)、1“1 引物(20μΜ)、2μ I IOXPCR 緩沖液、0.4 μ IdNTP(IOmM)和IU Taq DNA聚合酶，用超純水補足20 μ 1，液面覆蓋液體石蠟油。反應在ΡΕ9600 型 PCR 儀上進行，其程序為 94°C變性 5min ;再 94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin,共30-32個循環(huán)；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。得到約750bp的PCR產物，該PCR產物經回收后序列分析，結果表明該PCR產物具有序列表中序列I的核苷酸序列，即得到基因GmPHD5，編碼蛋白命名為GmPHD5，其氨基酸序列為序列表中的序列2。
將PCR產物克隆于pMD18_T質粒的多克隆位點，得到重組載體pMDGmPHD5，經測序，該載體為將序列表中的序列I插入PMD18-T質粒的多克隆位點得到的載體。
2、GmPHD5基因在非生物脅迫下的表達特征
對大豆耐旱耐鹽品種晉豆23(JD23)及旱敏鹽敏品種灰布支(HBZ)進行干旱、NaCl、ΑΒΑ、冷害處理，用于分析大豆GmPHD5在非生物脅迫和脫落酸(ABA)處理下的轉錄特征。將晉豆23和灰布支的種子種在盆中，生長2星期后，對幼苗分別進行下述脅迫處理:
干旱處理:將大豆幼苗從土中取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，分別在光照條件下干旱培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。
鹽處理:將大丑幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。
ABA處理:大豆幼苗的根系置于100 μ M ABA中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。
低溫處理:將小麥幼苗置于0°C培養(yǎng)箱中，分別在光照培養(yǎng)O小時、I小時、3小時、6小時和12小時后取樣。
總RNA的提取同上述I。應用Real Time PCR分析GmPHD5基因在上述處理時的轉錄特征，所用引物同上述I。以大豆beta-tubulin為內參，內參的引物為:
GmTubRL-1: TGGCCGCTACCTCACTGCCT
GmTubRL-2: TCGTCCATGCCTTCCCCGGT
結果如圖1所示，在高鹽脅迫下，兩種大豆中的GmPHD5基因均受到脅迫的誘導，前期灰布支中轉錄較高，而12小時時，晉豆23中的轉錄明顯升高。干旱脅迫下，灰布支中GmPHD5轉錄在脅迫3小時時上升，至6小時回落，12小時再上升，而在晉豆23中，脅迫I至3小時，下降至6小時時明顯升高，12小時升至最高。在兩種大豆中GmPHD5轉錄均不受低溫誘導。ABA處理下的轉錄，在灰布支中不受誘導，而在晉豆23中GmPHD5受到強烈誘導。上升結果表明GmPHD5可能參與植物對非生物脅迫的應答反應。
實施例2、GmPHD5蛋白的功能鑒定
一、轉GmPHD5基因擬南芥的獲得
1、重組表達載體pBIN438-GmPHD5的構建
提取大豆抗旱品種晉豆23 (JD23)的RNA，反轉錄得到cDNA，以G5BamH I和G5KpnI作為引物進行PCR擴增 ，得到756bpPCR產物，用限制性內切酶BamH I和Kpn I雙酶切得到的PCR產物，回收酶切產物，將該酶切產物與經過同樣酶切植物表達載體pBIN438得到的載體骨架連接，得到連接產物。將連接產物轉入大腸桿菌中，得到轉化子。提取轉化子的質粒，送去測序，該質粒為將序列表中的序列I自5’末端第1-759位核苷酸插入pBIN438的BamHI和Kpn I酶切位點之間得到的載體，將該載體命名為pBIN438-GmPHD5，且序列表中的序列I自5’末端第1-756位核苷酸位于CaMV 35S啟動子之后。重組表達載體pBIN438-GmPHD5部分結構示意圖如圖2所示。
G5 BamH 1:GAAGGATCCATGGAAGGAGTACCGCACCC (序列 5)
G5 Kpn 1:GAAGGTACCAACTCTAACCCTCTTGTTAC (序列 6)
2、轉GmPHD5基因植株的獲得和鑒定
I)重組農桿菌的獲得
將上述I得到的重組表達載體pBIN438-GmPHD5，通過電擊法導入轉化農桿菌 GV3101(Tang ff, Sederoff R, Whetten R., Regeneration of transgenic loblollypine (Pinus taeda L.) from zygotic embryos transformed with Agrobacteriumtumefaciens, 20010ct ；213 (6):981-9,公眾可以從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。)，得到重組農桿菌。
提取重組農桿菌的質粒，送去測序，結果為該質粒為pBIN438-GmPHD5，將含有該質粒的重組農桿菌命名為GV3101/pBIN438-GmPHD5。
通過用抽真空法將GV3101/pBIN438-GmPHD5轉入野生型哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0, Clough-SJ, Bent-AF.Floral dip:a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16:6，735-743，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得，以下簡稱野生型擬南芥。)，具體操作為:將野生型擬南芥Col-O的花浸泡于轉化液(MS0.0llg, Sucrose 0.25g, Silwet 0.5 μ I,重蒸水稀釋至 5ml, ρΗ5.8)中 10 秒，取出后放入MS培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)8小時，獲得Ttl代轉化種子，將其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培養(yǎng)基上，獲得29株Ttl代轉GmPHD5擬南芥。
提取Ttl代轉GmPHD5擬南芥的總RNA進行RT-PCR鑒定分析，以野生型擬南芥為對照。
引物如下:
5， -ATGGAAGGAGTACCGCACCCAATA-3’
5， -TCAAACTCTAACCCTCTTGTTACT-3，。
結果表明，得到PCR產物為756bp的為陽性Ttl代轉GmPHD5擬南芥，即為GmPHD5基因的表達，可以看出，在29株Ttl代轉GmPHD5擬南芥中，有19株為陽性Ttl代轉GmPHD5擬南芥，而野生型擬南芥均沒有檢測出目的基因的表達。
將分子鑒定陽性的Ttl代轉GmPHD5擬南芥單株收種子，各單株種子分別播種，用卡那霉素繼續(xù)篩選以觀察T1代的分離情況，如此重復直至T3代獲得遺傳穩(wěn)定的轉基因株系，共獲得13個穩(wěn)定遺傳的T3代轉GmPHD5擬南芥。
T0代表示轉基因當代植株，T1代表示Ttl代自交產生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株。
選擇穩(wěn)定遺傳的T3代轉GmPHD5擬南芥株系中GmPHD5表達高、低有區(qū)別的4個株系，G5-9、G5-11、G5-21和G5-24再進行RT-PCR驗證，方法同上，以野生型擬南芥為對照，結果如圖3所示，該4株轉GmPHD5基因的T3代植株中，GmPHD5基因均有不同程度的表達，而野生型擬南芥則未能檢出表達。
以相同的方法將空載體PBIN438轉入野生型擬南芥中，得到轉空載體擬南芥，提取總RNA進行RT-PCR鑒定分析，結果未得到目的片段，說明得到了轉空載體擬南芥，同樣播種處理，得到T3代轉空載體擬南芥。
二、轉GmPHD5擬南芥的功能研究
在正常條件下，從幼苗期開始觀察轉GmPHD5植株與轉空載體對照植株之間的差另O，地上部分不論葉片形狀、葉片大小、抽苔時期和抽苔高度方面，轉GmPHD5植株與轉空載體對照植株并沒有明顯差別。
1、耐鹽性試驗:
將野生型擬南芥(對照)、T3代轉空載體擬南芥和T3代的轉GmPHD5擬南芥的4個轉基因株系(G5-9、G5-11、G5-21和G5-24)同時播種在含有0、50、100和150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，23-240C，光照16小時/天，4天，統(tǒng)計發(fā)芽率。實驗共設三次重復，每次重復中，所測試的各株系植株分別為15株。
結果如圖4所示，可以看出，在未脅迫和50mM NaCl脅迫下，T3代的轉GmPHD5擬南芥的發(fā)芽率略高于野生型擬南芥(對照)，但差別不顯著，在IOOmM和150mM NaCl脅迫下，不同株系的發(fā)芽率有明顯差異，具體如圖5所示:
野生型擬南芥(對照，WT)和T3代的轉GmPHD5擬南芥株系G5-9、G5-11、G5-21及G5-24在IOOmMNaCl脅迫下的發(fā)芽率依次為67±5 %、79±7 %、69±5 %、84±7 %和81±9%，而在150mM NaCl處理后的發(fā)芽率分別為46±5%、65±3%、60±2%、62±5%和60 ± 5 %。
除了 G5-11在IOOmM NaCl脅迫下外，所有脅迫下過表達GmPHD5植株(T3代的轉GmPHD5擬南芥株系)的發(fā)芽率均顯著或極顯著高于對照(野生型擬南芥)。
進一步用垂直板培養(yǎng)基根長分析各轉基因株系與對照的耐鹽性，具體如下:將野生型擬南芥(對照，WT)、T3代轉空載體擬南芥和T3代的轉GmPHD5擬南芥(G5_9、G5-11、G5-21和G5-24)種子分別種于MS培養(yǎng)基和含有150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基中，春化3天，生長5天，移植到垂直平板培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng)，23-240C，光照16小時/天，10天，觀察根生長狀況。實驗共設三次重復，每次重復中，所測試的各株系植株分別為15株。
結果如圖6所示，在MS培養(yǎng)基中(未處理)，T3代的轉GmPHD5擬南芥和野生型擬南芥(對照，WT)間沒有明顯差異，在含有150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基中，T3代的轉GmPHD5擬南芥的根長相比野生型擬南芥明顯更長。
具體結果如圖7所示，
在MS培養(yǎng)基中(未處理)，各植株根長分別為:對照為5.1cm、G5-9為4.83cm、G5-11 為 5.33cm、G5-21 為 5.74cm 和 G5-24 為 4.81cm,而在含有 150mM NaCl 的 1/2MS 培養(yǎng)基中，T3代的轉GmPHD5擬南芥的根長相比野生型擬南芥明顯更長，分別約為:對照為1.07cm、G5-9 為 2.52cm、G5-11 為 3.58cm、G5-21 為 2.51cm 和 G5-24 為 2.5cm。
野生型擬南芥與T3代轉空載體擬南芥的結果無顯著差異。
2、耐旱性實驗
以培養(yǎng)基中添加甘露醇模擬干旱脅迫。將野生型擬南芥(對照，WT)、T3代轉空載體擬南芥和T3代的轉GmPHD5擬南芥(G5-9、G5-11、G5-21和G5-24)的種子種于1/2MS培養(yǎng)基，春化3天，生長5天后，將幼苗分別移植于含200mM和300mM甘露醇的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，23-24°C，光照16小時/天，10天后，將幼苗移植于蛭石中，恢復澆水一周。實驗共設三次重復，每次重復中，所測試的各株系植株分別為15株。以1/2MS培養(yǎng)基為對照。
統(tǒng)計存活率，結果如圖8所示，在1/2MS培養(yǎng)基里，轉基因植株和野生型對照的存活率無差別，均為100%，而在含有200mM和300mM甘露醇的培養(yǎng)基中有明顯差異。200mM甘露醇下存活率分別為:WT為39%、G5-9為83%、G5-11為89%、G5-21為94%和G5-24為100%，在 300mM 甘露醇下存活率為 WT 為 33%、G5_9 為 50%、G5_11 為 39%、G5_21 為 56%和G5-24為50 %。結果說明除了在300mM甘露醇里G5-11僅比對照略高外，其他條件下，轉基因植株的存活率都顯著高于野生型對照。
野生型擬南芥與T3代轉空載 體擬南芥的結果無顯著差異。
上述實施例說明，GmPHD5參與植物對鹽和旱脅迫的應答，其編碼基因的過量表達可提高轉基因植株的耐鹽、耐旱性。
權利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(1)-(4)中任意一種DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)序列表中序列I自5’末端第1-756位所示的DNA分子； (3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權利要求1所述蛋白的編碼基因插入PBIN438載體中，得到表達權利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對， 所述引物對具體為如下(I)或(II): (I)、所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4 ； (II)、所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列6。
7.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因、權利要求4所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應用。
8.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求1所述蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。
9.如權利要求 8所述的方法，其特征在于:權利要求1所述蛋白的編碼基因通過權利要求5所述重組載體導入所述目的植物中； 所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述耐旱性體現(xiàn)在增加根長、提高發(fā)芽率和/或提高存活率； 所述耐鹽性體現(xiàn)在提高存活率； 所述目的植物為雙子葉或單子葉植物； 所述雙子葉植物具體為擬南芥或豆科植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆轉錄活性蛋白GmPHD5及其編碼基因與應用。該大豆PHD轉錄因子，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。本發(fā)明的實驗證明，該大豆PHD轉錄因子GmPHD5及其編碼基因可用于培育耐逆植物品種，GmPHD5基因能夠顯著提高植物的耐鹽、耐旱性。
文檔編號C12N5/10GK103102402SQ201110360138
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權日2011年11月14日
發(fā)明者陳受宜, 張勁松, 韋偉, 張玉芹, 劉學義, 張萬科, 馬彪, 林晴 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所