專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化制備(s)-環(huán)氧氯丙烷的方法及菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-環(huán)氧氯丙烷的方法，以及該方法中所用的菌株。背景技術(shù)：
手性環(huán)氧氯丙烷是一種重要的有機(jī)合成關(guān)鍵中間體，用以制備多種高光學(xué)純度藥物中間體，如芳氧丙醇胺類藥物、環(huán)戊酮的衍生物、抗真菌藥(S)-霉康靈、阿伐他汀、L-肉堿等。
手性環(huán)氧氯丙烷的制備方法有化學(xué)法和生物法。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法生產(chǎn)手性環(huán)氧氯丙烷因其反應(yīng)劇烈、耗能大、設(shè)備貴、對(duì)映體過(guò)量值(e. e值)和得率低等缺點(diǎn)已基本被舍棄；新型化學(xué)合成法雖然在e. e值和得率上都取得重大成就，但仍然面臨污染大，設(shè)備貴等缺點(diǎn)。
生物催化轉(zhuǎn)化合成手性環(huán)氧氯丙烷選擇性較好，且環(huán)境友好，其途徑主要有(1) 單加氧酶催化的烯烴直接不對(duì)稱環(huán)化；( 鹵醇脫鹵酶催化的鄰氯醇脫鹵反應(yīng)；C3)親核試劑介導(dǎo)，鹵醇脫鹵酶催化的外消旋環(huán)氧氯丙烷的非水解型動(dòng)力學(xué)拆分；(4)環(huán)氧化物水解酶催化的外消旋環(huán)氧氯丙烷的水解型動(dòng)力學(xué)拆分。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-環(huán)氧氯丙烷的方法，該方法微生物催化選擇性好，副產(chǎn)物利用率高且環(huán)境友好。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
—種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-環(huán)氧氯丙烷的方法，所述方法包括以外消旋環(huán)氧氯丙烷為底物，以黑曲霉CCTCC NO =M 2010275發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，在有機(jī)溶劑中進(jìn)行選擇性催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)常規(guī)分離純化獲得所述(S)-環(huán)氧氯丙烷；所述的有機(jī)溶劑為下列之一環(huán)己烷、正己烷或庚烷。
所述選擇性催化反應(yīng)優(yōu)選在20 40°C、pH5 9的條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間10 20h。
優(yōu)選的，在有機(jī)溶劑中，所述外消旋環(huán)氧氯丙烷初始濃度為2 20g/L，所述含酶菌體細(xì)胞添加量以菌體干重計(jì)為0. 5 5g/L。
所述含酶菌體細(xì)胞可直接以濕菌體或發(fā)酵液形式作為催化劑參與反應(yīng)，也可經(jīng)固定化之后參與反應(yīng)；優(yōu)選的，所述含酶菌體細(xì)胞經(jīng)固定化后作為生物催化劑。
優(yōu)選的，所述含酶菌體細(xì)胞經(jīng)固定化后參與反應(yīng)時(shí)，所述固定化的方法如下將經(jīng)黑曲霉CCTCC NO =M 2010275發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體與無(wú)菌水按質(zhì)量比1 10 20混合， 獲得菌懸液；將菌懸液以體積比1 1 3加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 6%的海藻酸鈉水溶液中，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液逐滴滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5 1. 5%氯化鈣水溶液中，得到的固定化懸浮液，20 30°C固化5 15h，獲得含有含酶菌體細(xì)胞的固定化細(xì)胞顆粒，經(jīng)過(guò)濾、淋洗后作為生物催化劑。
優(yōu)選的，所述分離純化方法如下將應(yīng)液在45 95°C下減壓蒸餾，收集45 55°C 餾分即為產(chǎn)物(S)-環(huán)氧氯丙烷，收集85 95°C餾分為副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇。
所述副產(chǎn)物可經(jīng)后處理循環(huán)使用，所述后處理方法如下將(R)-3_氯-1，2-丙二醇與有機(jī)酸溶液按摩爾比1 0. 1 0. 5混合，通入干燥的氯化氫氣體，在100 130°C下鹵化反應(yīng)10 20h，得到(R，S)-1,3- 二氯-2-丙醇和(R，S) -2，3- 二氯丙醇混合物，將混合物與PH 8. 0 10. 0的堿溶液按摩爾比0. 5 0. 8 1混合，在55 75°C下反應(yīng)5 20分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，回收用于循環(huán)制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；所述有機(jī)酸溶液為下列之一醋酸、乳酸、甲苯磺酸或草酸；所述堿溶液為下列之一氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液或碳酸鈉水溶液。
述的固定化細(xì)胞顆粒直徑為0.5 2mm。
具體的，所述的(S)-環(huán)氧氯丙烷的制備方法推薦按照以下步驟進(jìn)行
(1)斜面培養(yǎng)將黑曲霉菌株ZJB-09173接種至斜面培養(yǎng)基，25 35°C下培養(yǎng) 5 10d，獲得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基的終濃度組成為馬鈴薯100 300g/L、葡萄糖 10 30g/L、瓊脂15 25g/L，溶劑為水，用lmol/L的HCl溶液或lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH至5. 0 7. 0 ；121°C滅菌20min，冷卻制斜面；
(2)種子培養(yǎng)從步驟(1)獲得的菌體斜面取一接種環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，25 350C，120 250r/min搖床培養(yǎng)18 45h，獲得種子液；所述的種子培養(yǎng)基的終濃度組成為葡萄糖10 30g/L、酵母提取粉10 30g/L、蛋白胨5 20g/L、KH2PO4 0. 2 1. 2g/ L、K2HPO4 0. 4 1. 2g/L、MgSO4 · 7H200. 2 1. Og/L，溶劑為水，用 1. Omol/L 的 HCl 溶液或 1. Omol/L NaOH 溶液將 pH 調(diào)至 5. 0 7. 0 ；121°C 滅菌 20min ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟( 獲得的種子液以1 15% (ν/ν)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25 35°C，100 300r/min搖床培養(yǎng)72 120h，獲得發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為淀粉2 20g/L、豆餅粉0. 5 15g/L、KH2PO4 0. 2 1. 2g/L、K2HPO4 0. 4 1. 2g/L、MgSO4 · 7Η20 0· 2 1. Og/L，溶劑為水，用 1. 0mol/L 的 HCl 溶液或 1. 0mol/L NaOH 溶液將PH調(diào)至5. 0 7. 0 ；
(4)細(xì)胞固定化將步驟(3)獲得的發(fā)酵液3000 IOOOOrpm離心5 20min，棄去上清液，收集菌體，將菌體與無(wú)菌水按質(zhì)量比1 10 20混合，制成菌懸液，將菌懸液以體積比1 1 3與質(zhì)量濃度3 6%海藻酸鈉水溶液混合，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液5mLz注射器針頭逐滴滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 1.5%氯化鈣水溶液中， 得到的固定化懸浮液，20 30°C固化5 15h，獲得含有菌體的固定化細(xì)胞顆粒，所述固定化細(xì)胞顆粒用無(wú)菌紗布過(guò)濾，再用無(wú)菌水淋洗，獲得的固定化細(xì)胞顆粒作為生物催化劑；
(5)生物催化用無(wú)菌量筒量取步驟(4)制備的固定化細(xì)胞顆粒1 1. 8L，裝入固定床生物反應(yīng)器，制成固定化細(xì)胞顆粒床層，在20 40°C、pH5 9條件下，將濃度5 15g/L的(R，幻-環(huán)氧氯丙烷的有機(jī)溶劑溶液以5 15mL/min的流速流經(jīng)固定化細(xì)胞顆粒床層，循環(huán)反應(yīng)10 20h，獲得反應(yīng)液；所述的固定床生物反應(yīng)器容積為2. 0L，高徑比為 5:1;
(6)分離純化將步驟(5)獲得的反應(yīng)液45 95°C減壓蒸餾，收集45 55°C餾分即為產(chǎn)物(S)-環(huán)氧氯丙烷，收集85 95°C餾分為副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇；
(7)副產(chǎn)物回收利用將步驟(6)所獲得的副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇與有機(jī)酸按摩爾比1 0.1 0.5混合，通入干燥氯化氫氣體，在100 130°C下鹵化反應(yīng)10 20h，獲得(R，S)-1，3-二氯-2-丙醇和(R，S)-2，3-二氯丙醇混合物；將混合物與堿溶液按摩爾比0.5 0.8 1混合，在55 75°C下反應(yīng)5 20分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷， 用于步驟( 生物催化制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；所述副產(chǎn)物回收制備的(R，幻-環(huán)氧氯丙烷與固定化細(xì)胞顆粒床層的質(zhì)量比為3 10 1。
在拆分消旋環(huán)氧氯丙烷生產(chǎn)手性環(huán)氧氯丙烷的時(shí)，會(huì)產(chǎn)生等摩爾的副產(chǎn)物 3-氯-1，2-二丙醇。本發(fā)明采用生物催化反應(yīng)與產(chǎn)物分離相互耦合技術(shù)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)手性環(huán)氧氯丙烷。具有得率高、生產(chǎn)效率高、連續(xù)化生產(chǎn)、副產(chǎn)物回收利用等特點(diǎn)，可適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明還涉及一株反應(yīng)過(guò)程中用到的新菌株——黑曲霉(Aspergillus niger) ZJB09173，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)=CCTCC NO =M 2010275，保藏日期:2010 年 10 月 24 日。
本發(fā)明所述的黑曲霉(Aspergillus niger)ZJB-09173菌落特征為菌落的顏色由淺黃色逐漸變深黃色，在中間深黃色菌圈中可看到棕色孢子，整個(gè)菌落不透明，邊緣粗糙但較整齊，表面較干燥。顯微鏡(10X40)觀察，菌絲發(fā)達(dá)，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細(xì)胞長(zhǎng)出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子，分生孢子頭球形。
本發(fā)明所述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)ZJB-09173菌株來(lái)源土壤。
本發(fā)明產(chǎn)物( -環(huán)氧氯丙烷可用氣相色譜(HP-5極性色譜柱)檢測(cè)純度。
本發(fā)明產(chǎn)物(S)-環(huán)氧氯丙烷對(duì)映體過(guò)剩值(ee.)用手性氣相色譜(手性毛細(xì)管柱BGB-175)測(cè)定。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在1)步驟簡(jiǎn)單，污染低，環(huán)境友好；2)固定化細(xì)胞顆粒作為生物催化劑具有高度的對(duì)映體選擇性，保證了(S)-環(huán)氧氯丙烷的高光學(xué)純度；幻副產(chǎn)物的循環(huán)拆分和生物催化劑的循環(huán)使用，大大降低了原料成本和生產(chǎn)成本。

圖1為本發(fā)明工藝路線示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1
(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，用1. Omol/L的 HCl或1. Omol/L NaOH溶液將pH調(diào)到7. 0。121°C滅菌20min后，冷卻制斜面，將保藏在4°C 冰箱中的黑曲霉CCTCC NO =M 2010275菌株接種至斜面培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，獲得菌體斜面；
(2)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、酵母提取粉15g/L、蛋白胨15g/L、NaH2PCM · 2H20 1. Og/L,用 1. Omol/L 的 HCl 或 1. Omol/L NaOH 溶液將 pH 調(diào)到 7. O。裝液量為250mL三角瓶裝液50mL。121°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接步驟(1)獲得的斜面種子， 180r/min搖床，30°C培養(yǎng)M小時(shí)，作為種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基淀粉 10g/L、豆餅粉 10g/L、KH2P04 1. Og/L,K2HPO4 0. 8g/L、 MgSO4 · 7H20 0. 4g/L,用 1. Omol/L 的 HCl 或 1. Omol/L NaOH 溶液將 pH 調(diào)到 7. 0。裝液量為 250mL三角瓶裝液100mL。121°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接(ν/ν)步驟⑵獲得的種子液，180r/min搖床，30°C培養(yǎng)96小時(shí)，作為發(fā)酵酶液。
(4)細(xì)胞固定化將步驟(3)獲得的發(fā)酵液SOOOrpm離心lOmin，棄去上清液收集菌體，將濕菌體與水按質(zhì)量比1 10混合，配成菌懸液，將菌懸液以體積比1 1與3%( / w)海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液用0. 2mm注射器針頭逐滴滴入0. 5% CaCl2水溶液中，25°C固化10小時(shí)，用無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾，再用50mL 無(wú)菌水淋洗，獲得固定化化細(xì)胞顆粒；
(5)生物催化用無(wú)菌量筒量取步驟(4)制備的固定化細(xì)胞顆粒約1. 0L，裝入無(wú)菌的固定床生物反應(yīng)器(S212-S-1L，上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司)，組成固定化細(xì)胞顆粒床層，該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2. 0L，高徑比為5 1，在30°C和pH 7. 0條件下，將10g/L (R， S)-環(huán)氧氯丙烷的環(huán)己烷溶液以lOmL/min流速流經(jīng)固定化細(xì)胞顆粒床層，固定化細(xì)胞顆粒與(R，S)-環(huán)氧氯丙烷的體積比為1 3，循環(huán)反應(yīng)12h，獲得反應(yīng)液；
(6)分離純化將步驟( 獲得的反應(yīng)液，50°C和90°C溫度下減壓蒸餾，分別獲得產(chǎn)物(S)-環(huán)氧氯丙烷和副產(chǎn)物(R) -3-氯-1，2-丙二醇；
(7)副產(chǎn)物回收利用將步驟(6)分離的副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇溶于30ml 冰醋酸，5mL/min流速通入干燥的氯化氫氣體，110°C下鹵化反應(yīng)15h，得到消旋的1，3_ 二氯-2-丙醇和2，3- 二氯丙醇混合物；將混合物與NaOH溶液按摩爾比0. 6 1混合，在65°C 下反應(yīng)15分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，用于步驟(5)開(kāi)始的循環(huán)拆分制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；
連續(xù)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行5批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷，合并各批次的(S)-環(huán)氧氯丙烷餾分，干燥，得到71g(S)_環(huán)氧氯丙烷，其ee. >99%，產(chǎn)率為47%。
實(shí)施例2:
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)CCTCC NO :M 2010275 按實(shí)施例 1 方法產(chǎn)酶培養(yǎng)和離心收集菌體后，將濕菌體與水按質(zhì)量比1 10混合，配成菌懸液，將菌懸液以體積比 1 2與3%海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液用 0. 5mm注射器針頭逐滴滴入0. 5% CaCl2水溶液中，30°C固化10小時(shí)，用無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾， 再用50mL無(wú)菌水淋洗，獲得固定化化細(xì)胞顆粒；
(2)生物催化用無(wú)菌量筒量取制備的固定化細(xì)胞顆粒約1. 5L，裝入無(wú)菌的固定床生物反應(yīng)器(S212-S-1L，上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司)，組成固定化細(xì)胞顆粒床層， 該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2. 0L，高徑比為5 1，在30°C和pH 7. 0條件下，將10g/L(R，S)-環(huán)氧氯丙烷的環(huán)己烷溶液以lOmL/min流速流經(jīng)固定化細(xì)胞顆粒床層，固定化細(xì)胞顆粒與(R， S)-環(huán)氧氯丙烷的體積比為1 3，循環(huán)反應(yīng)12h，獲得反應(yīng)液；
(3)分離純化將獲得的反應(yīng)液，50°C和90°C溫度下減壓蒸餾，分別獲得產(chǎn)物(S)-環(huán)氧氯丙烷和副產(chǎn)物(R) -3-氯-1，2-丙二醇；
(4)副產(chǎn)物回收利用將分離的副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇溶于30ml冰醋酸， 5mL/min流速通入干燥的氯化氫氣體，120°C下鹵化反應(yīng)15h，得到消旋的1，3_ 二氯-2-丙醇和2，3- 二氯丙醇混合物；將混合物與NaOH溶液按摩爾比0. 6 1混合，在65°C下反應(yīng) 15分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，用于步驟O)開(kāi)始的循環(huán)拆分制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；
連續(xù)進(jìn)行6個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行5批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷。合并各批次的(S)-環(huán)氧氯丙烷餾分，按實(shí)施例1進(jìn)行，得到146g(S)-環(huán)氧氯丙烷，其 ee. > 99%，產(chǎn)率為 65%。
實(shí)施例3
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)CCTCC NO :M 2010275 按實(shí)施例 1 方法產(chǎn)酶培養(yǎng)和離心收集菌體后，將濕菌體與水按質(zhì)量比1 15混合，配成菌懸液，將菌懸液以體積比 1 2與5%海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液用 0. 5mm注射器針頭逐滴滴入1 % CaCl2水溶液中，30°C固化15小時(shí)，用無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾， 再用50mL無(wú)菌水淋洗，獲得固定化化細(xì)胞顆粒；
(2)生物催化用無(wú)菌量筒量取制備的固定化細(xì)胞顆粒約1. 5L，裝入無(wú)菌的固定床生物反應(yīng)器(S212-S-1L，上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司)，組成固定化細(xì)胞顆粒床層，該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2. 0L，高徑比為5 1，在30°C和pH 7. 0條件下，將5g/L (R，S)-環(huán)氧氯丙烷的環(huán)己烷溶液以5mL/min流速流經(jīng)固定化細(xì)胞顆粒床層，固定化細(xì)胞顆粒與(R， S)-環(huán)氧氯丙烷的體積比為1 3，循環(huán)反應(yīng)15h，獲得反應(yīng)液；
(3)分離純化將獲得的反應(yīng)液，50°C和90°C溫度下減壓蒸餾，分別獲得產(chǎn)物 (S)-環(huán)氧氯丙烷和副產(chǎn)物(R) -3-氯-1，2-丙二醇；
(4)副產(chǎn)物回收利用將分離的副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇溶于30ml冰醋酸， 5mL/min流速通入干燥的氯化氫氣體，120°C下鹵化反應(yīng)15h，得到消旋的1，3_ 二氯-2-丙醇和2，3- 二氯丙醇混合物；將混合物與NaOH溶液按摩爾比0. 6 1混合，在65°C下反應(yīng) 15分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，用于步驟O)開(kāi)始的循環(huán)拆分制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；
這樣連續(xù)進(jìn)行9個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行5批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)( -環(huán)氧氯丙烷。合并各批次的(S)-環(huán)氧氯丙烷餾分，按實(shí)施例1進(jìn)行，得到96g(S)-環(huán)氧氯丙烷，其 ee. > 99%，產(chǎn)率為 86%。
實(shí)施例4
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)CCTCC NO :M 2010275 按實(shí)施例 1 方法產(chǎn)酶培養(yǎng)和離心收集菌體后，將濕菌體與水按質(zhì)量比1 20混合，配成菌懸液，將菌懸液以體積比 1 3與6%海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液用 0. 5mm注射器針頭逐滴滴入1 % CaCl2水溶液中，30°C固化15小時(shí)，用無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾， 再用50mL無(wú)菌水淋洗，獲得固定化化細(xì)胞顆粒；
(2)生物催化用無(wú)菌量筒量取制備的固定化細(xì)胞顆粒約1. 8L，裝入無(wú)菌的固定床生物反應(yīng)器(S212-S-1L，上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司)，組成固定化細(xì)胞顆粒床層， 該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2. 0L，高徑比為5 1，在30°C和pH 7. 0條件下，將10g/L(R，S)-環(huán)氧氯丙烷的環(huán)己烷溶液以5mL/min流速流經(jīng)固定化細(xì)胞顆粒床層，固定化細(xì)胞顆粒與(R， S)-環(huán)氧氯丙烷的體積比為1 5，循環(huán)反應(yīng)15h，獲得反應(yīng)液；
(3)分離純化將獲得的反應(yīng)液，50°C和90°C溫度下減壓蒸餾，分別獲得產(chǎn)物 (S)-環(huán)氧氯丙烷和副產(chǎn)物(R) -3-氯-1，2-丙二醇；
(4)副產(chǎn)物回收利用將分離的副產(chǎn)物00-3-氯-1，2-丙二醇溶于60ml冰醋酸， 5mL/min流速通入干燥的氯化氫氣體，120°C下鹵化反應(yīng)20h，得到消旋的1，3_ 二氯-2-丙醇和2，3- 二氯丙醇混合物；將混合物與NaOH溶液按摩爾比0. 6 1混合，在65°C下反應(yīng) 15分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，用于步驟O)開(kāi)始的循環(huán)拆分制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；
連續(xù)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行5批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷。合并各批次的(S)-環(huán)氧氯丙烷餾分，按實(shí)施例1進(jìn)行，得到312g(S)-環(huán)氧氯丙烷，其 ee. > 99%，產(chǎn)率為 69%。
實(shí)施例5
(1)黑曲霉(Aspergillus niger)CCTCC NO :M 2010275 按實(shí)施例 1 方法產(chǎn)酶培養(yǎng)和離心收集菌體后，將濕菌體與水按質(zhì)量比1 15混合，配成菌懸液，將菌懸液以體積比 1 2與5%海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液用 0. 5mm注射器針頭逐滴滴入1 % CaCl2水溶液中，30°C固化15小時(shí)，用無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾， 再用50mL無(wú)菌水淋洗，獲得固定化化細(xì)胞顆粒；
(2)生物催化用無(wú)菌量筒量取制備的固定化細(xì)胞顆粒約1.8L，裝入無(wú)菌的固定床生物反應(yīng)器(S212-S-1L，上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司)，組成固定化細(xì)胞顆粒床層， 該反應(yīng)器的總?cè)莘e為2. 0L，高徑比為5 1，在30°C和pH 7. 0條件下，將15g/L(R，S)-環(huán)氧氯丙烷的環(huán)己烷溶液以15mL/min流速流經(jīng)固定化細(xì)胞顆粒床層，固定化細(xì)胞顆粒與(R， S)-環(huán)氧氯丙烷的體積比為1 5，循環(huán)反應(yīng)15h，獲得反應(yīng)液；
(3)分離純化將獲得的反應(yīng)液，50°C和90°C溫度下減壓蒸餾，分別獲得產(chǎn)物 (S)-環(huán)氧氯丙烷和副產(chǎn)物(R) -3-氯-1，2-丙二醇；
(4)副產(chǎn)物回收利用將分離的副產(chǎn)物(R)-3-氯-1，2-丙二醇溶于30ml冰醋酸， 5mL/min流速通入干燥的氯化氫氣體，120°C下鹵化反應(yīng)15h，得到消旋的1，3_ 二氯-2-丙醇和2，3- 二氯丙醇混合物；將混合物與NaOH溶液按摩爾比0. 6 1混合，在65°C下反應(yīng) 15分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，用于步驟O)開(kāi)始的循環(huán)拆分制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；
連續(xù)進(jìn)行9個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行5批次固定化細(xì)胞生物催化反應(yīng)生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷。合并各批次的(S)-環(huán)氧氯丙烷餾分，按實(shí)施例1進(jìn)行，得到351. 2g(S)_環(huán)氧氯丙烷， 其ee. >90%，產(chǎn)率為52%。
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-環(huán)氧氯丙烷的方法，所述方法包括以外消旋環(huán)氧氯丙烷為底物，以黑曲霉CCTCC NO =M 2010275發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，在有機(jī)溶劑中進(jìn)行選擇性催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化獲得所述(S)-環(huán)氧氯丙烷；所述的有機(jī)溶劑為下列之一環(huán)己烷、正己烷或庚烷。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述選擇性催化反應(yīng)在20 40°C、pH5 9的條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間10 20h。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述外消旋環(huán)氧氯丙烷初始濃度為2 20g/L，所述含酶菌體細(xì)胞添加量以菌體干重計(jì)為0. 5 5g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞經(jīng)固定化后作為生物催化劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述固定化的方法如下將經(jīng)黑曲霉CCTCC NO =M 2010275發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體與無(wú)菌水按質(zhì)量比1 10 20混合，獲得菌懸液； 將菌懸液以體積比1 1 3加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 6%的海藻酸鈉水溶液中，攪拌均勻，獲得含有菌體的海藻酸鈉混合液，將混合液逐滴滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5 1. 5%氯化鈣水溶液中，得到的固定化懸浮液，20 30°C固化5 15h，獲得含有含酶菌體細(xì)胞的固定化細(xì)胞顆粒，經(jīng)過(guò)濾、淋洗后作為生物催化劑。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下將應(yīng)液在45 95°C下減壓蒸餾，收集45 55°C餾分即為產(chǎn)物( -環(huán)氧氯丙烷，收集85 95°C餾分為副產(chǎn)物(R)_3-氯-1，2-丙二醇。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述副產(chǎn)物經(jīng)后處理循環(huán)使用，所述后處理方法如下將(R)-3-氯-1，2-丙二醇與有機(jī)酸溶液按摩爾比1 0. 1 0.5混合，通入干燥的氯化氫氣體，在100 130°C下鹵化反應(yīng)10 20h，得到(R，S)-1，3-二氯-2-丙醇和(R， S) -2，3- 二氯丙醇混合物，將混合物與pH 8. 0 10. 0的堿溶液按摩爾比0. 5 0. 8 1混合，在55 75°C下反應(yīng)5 20分鐘，得到(R，S)-環(huán)氧氯丙烷，回收用于循環(huán)制備(S)-環(huán)氧氯丙烷；所述有機(jī)酸溶液為下列之一醋酸、乳酸、甲苯磺酸或草酸；所述堿溶液為下列之一氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液或碳酸鈉水溶液。
8.黑曲霉(Aspergillusniger) ZJB-09173，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址 中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCC NO =M 2010275，保藏日期2010年10月M 曰。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-環(huán)氧氯丙烷的方法，所述方法包括以外消旋環(huán)氧氯丙烷為底物，以黑曲霉CCTCC NOM2010275發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，在有機(jī)溶劑中進(jìn)行選擇性催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化獲得所述(S)-環(huán)氧氯丙烷；所述的有機(jī)溶劑為下列之一環(huán)己烷、正己烷或庚烷。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在1)本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單，污染低，環(huán)境友好；2)固定化細(xì)胞顆粒作為生物催化劑具有高度的對(duì)映體選擇性，保證了(S)-環(huán)氧氯丙烷的高光學(xué)純度；3)副產(chǎn)物的循環(huán)拆分和生物催化劑的循環(huán)使用，大大降低了原料成本和生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/685GK102533921SQ20111035071
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者胡忠策, 鄒樹(shù)平, 鄭裕國(guó), 金火喜 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)