專利名稱：利用天然油體重構(gòu)法制備固定化脂肪酶用于生產(chǎn)生物柴油的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以基因工程的方法表達(dá)脂肪酶，并使用天然油體作為固定化酶基質(zhì)以制備固定化脂肪酶來生產(chǎn)生物柴油的方法。
背景技術(shù)：
1.生物酶法制備生物柴油的概況
生物酶法制備生物柴油是利用脂肪酶的酯化和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)活性，催化油脂和醇反應(yīng)生成生物柴油。與物理法和化學(xué)法相比，用脂肪酶作催化劑制備生物柴油，具有應(yīng)用范圍廣、原料選擇性較低、催化效率高、反應(yīng)條件溫和及對環(huán)境友好、醇用量少、后處理簡單、無污染物排放、副產(chǎn)物甘油較易分離等優(yōu)點。目前，天然的脂肪酶作為催化劑來生產(chǎn)生物柴油存在著一定的局限性，主要有 (1)脂肪酶對低鏈醇的轉(zhuǎn)化率較低，致使脂肪酶用量過大、反應(yīng)周期過長，脂肪酶的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)活性有待進(jìn)一步提高；( 短鏈醇特別是甲醇對脂肪酶有一定的毒性，酶的使用壽命縮短，生產(chǎn)成本過高，脂肪酶的甲醇耐受性也必須進(jìn)一步改善。正是這些因素制約著酶法生產(chǎn)生物柴油的大規(guī)模應(yīng)用。固定化酶是在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)利用。將游離脂肪酶固定在載體上催化反應(yīng)合成所需要的產(chǎn)物，使昂貴的脂肪酶得以重復(fù)使用，降低了反應(yīng)的成本。且固定化酶具有可以回收，重復(fù)使用，穩(wěn)定性高，產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點。因此，固定化脂肪酶應(yīng)用前景被普遍看好。2.脂肪酶的固定化方法
當(dāng)前固定化脂肪酶的方法很多，可概括為物理法、化學(xué)法及生物法。由于載體材料、制備方法及固定酶的來源等不同，導(dǎo)致制備固定化酶的難易程度、固定效果、酶的穩(wěn)定性等也有所不同。物理方法，包括吸附法和包埋法。吸附法是通過物理吸附將酶固定于纖維載體的一種固定化方法。物理吸附法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結(jié)構(gòu)變化少的優(yōu)點，另外，吸附過程可以同時達(dá)到純化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生。因而酶活力損失較少，若能找到適當(dāng)?shù)妮d體，這是很好的方法。包埋法是將酶物理包埋于多聚物內(nèi)以達(dá)到固定化的目的。包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，因此酶活回收率較高。但是在包埋時發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)，酶容易失活，必須巧妙設(shè)計反應(yīng)條件，使之化學(xué)反應(yīng)時不至于破壞酶的活性部位和活性中心。北京化工大學(xué)研究者將自有菌株發(fā)酵提取的脂肪酶(Candida sp. 99-12 用硅藻固定，采用酯化法直接將脂肪酸與甲醇反應(yīng)，油酸和甲醇摩爾比為1 1.4，反應(yīng)過程中加入硅膠作吸水劑，反應(yīng)Mh，酯化率可達(dá)92%。^mi Watanabe等人運用固定的假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶催化豆油與甲醇反應(yīng)中獲得了 93. 8%的轉(zhuǎn)酯率，并且其固定化酶循環(huán)25次之后活性沒有發(fā)生任何改變。官春云等用硅藻土對實驗室篩選得到的成團(tuán)腸桿菌脂肪酶干燥酶粉進(jìn)行固定化，轉(zhuǎn)酯率達(dá)到91. 03%。
化學(xué)法主要是采用共價結(jié)合法。該方法是通過酶分子之間或酶蛋白分子的功能團(tuán)與載體表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間以共價鍵相互連接，形成固定化酶。羅文等以多孔玻璃為載體，采用共價法對假絲酵母99-125脂肪酶進(jìn)行了固定，并以所制備的固定化酶為催化劑， 在溫水體系中利用菜籽油合成生物柴油，采用3次流加甲醇的方式在石油醚中合成生物柴油，每一批次反應(yīng)后過濾出固定化酶，用叔丁醇清洗后繼續(xù)進(jìn)行下一批次的反應(yīng)，固定化酶連續(xù)反應(yīng)13批(每批30 h)后，生物柴油反應(yīng)轉(zhuǎn)化率仍維持在70%以上。固定化脂肪酶的半衰期在390 h以上。生物法是采用分子生物學(xué)手段將目的基因克隆表達(dá)并將表達(dá)蛋白進(jìn)行固定從而制備固定化酶的方法。當(dāng)前生物法制備固定化脂肪酶主要是采用全細(xì)胞固定法。全細(xì)胞固定化法是將產(chǎn)脂肪酶的微生物直接固定到支持物上，從而制備全細(xì)胞催化劑，這種方法比固定化酶更為簡便、經(jīng)濟(jì)，而且固定化過程可在批量化發(fā)酵時同步完成，不僅省去了分離純化的過程，而且又避免在提取，純化過程中酶的損失。根據(jù)全細(xì)胞催化劑的發(fā)展歷程和固定方法的差異，主要分為真菌全細(xì)胞催化劑、酵母全細(xì)胞催化劑、大腸桿菌全細(xì)胞催化劑三種。kizaburo Shiraga等將稻根霉菌脂肪酶固定到釀酒酵母菌表面，與游離脂肪酶相比， 所得固定化脂肪酶催化軟脂酸和η-戊醇(0.2 %水存在)的轉(zhuǎn)酯活性得到了巨大的提高。 Hama等將根霉菌lihizopus oryzae細(xì)胞固定在聚氨酯泡沫體BSI3s中，在一個20L的填充床生物反應(yīng)器中進(jìn)行間歇培養(yǎng)。流速為25L / h時在第一個生產(chǎn)周期甲酯含量超過90%，第 10個周期后可以達(dá)到80%。Kazuhiro等將根霉菌Iihizopus oryzae固定在聚氨酯泡沫體顆粒上，采用分3次加入甲醇的方式，當(dāng)反應(yīng)體系中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的水時，甲酯得率可以高達(dá)90%。經(jīng)過6次回用，胞內(nèi)脂肪酶的活性并沒有明顯的下降。同時還發(fā)現(xiàn)利用不同的脂肪酸作為碳源，全細(xì)胞催化劑的催化活性和穩(wěn)定性也不同，不飽和脂肪酸有利于提高細(xì)胞膜的通透性，使酶催化活性提高，而飽和脂肪酸有利于提高細(xì)胞的剛性，使酶穩(wěn)定性提高。Matsumoto等構(gòu)建了能大量表達(dá)米根霉脂肪酶(lihizopus oryzae lipase)的酵母菌株MT821，其胞內(nèi)脂肪酶的活性達(dá)到474. 5 IU / L0用預(yù)先經(jīng)凍融或風(fēng)干方法增強(qiáng)了滲透性的酵母細(xì)胞來催化大豆油合成脂肪酸甲酯，在37°C時以逐步添加甲醇的方式反應(yīng)165h， 最后反應(yīng)液中脂肪酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到71%。該法省去了分離和外部固定化的步驟。3.現(xiàn)有生物柴油生產(chǎn)中脂肪酶固定化方法的評價及發(fā)展趨勢
雖然固定化酶法制備生物柴油具有條件溫和、醇用量小、產(chǎn)品易于收集、無污染排放等優(yōu)點，是一種很有潛力的綠色生產(chǎn)方法。但目前實際生產(chǎn)中仍未廣泛使用，主要是由于在生物柴油的生產(chǎn)中他們都存在著一些嚴(yán)峻的缺陷物理法制備固定化脂肪酶具有操作簡單、 成本較低的優(yōu)點，但達(dá)不到純化的目的，而且包埋法只適用于分子量比較小的底物和產(chǎn)物的酶催化反應(yīng)；化學(xué)法生產(chǎn)的固定化脂肪酶具有結(jié)合牢固、不易脫落、可連續(xù)使用時間較長等優(yōu)點，但在固定過程中不可避免地會導(dǎo)致酶部分活性位點的損失，從而降低酶的活力。 反應(yīng)條件苛刻、操作復(fù)雜、酶活回收率低，甚至酶的底物專一性有時也會發(fā)生變化，并且在操作過程中常常會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致活性中心受到破壞，其重復(fù)性不高，從而不適于生物柴油的生產(chǎn)。此外，因為必須對脂肪酶進(jìn)行一定的分離提純才能獲得較高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生產(chǎn)成本依然較高，限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。全細(xì)胞固定化脂肪酶操作簡單、成本低，但是存在一個最大的問題是目的蛋白(脂肪酶)的量無法得到充分的提高。
綜上分析固定化脂肪酶生產(chǎn)生物柴油今后的研究重點，仍然在于尋找更好的固定化材料和固定化方法，進(jìn)一步改善固定化酶的相對活力、熱穩(wěn)定性、低碳醇耐受性和催化底物適用范圍等性能。入背景技術(shù)描述段落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是利用天然油體重構(gòu)法同步純化和固定化脂肪酶，該發(fā)明提供了一種全新的脂肪酶固定化技術(shù)可用于生產(chǎn)生物柴油，解決了當(dāng)前酶法生產(chǎn)生物柴油過程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺點。本發(fā)明的特征在于該方法步驟如下利用天然油體崩解后能自發(fā)重構(gòu)的特點，以油脂植物總mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，采用PCR法獲得的40(Tl000bp的油體蛋白基因，標(biāo)記為0。以根據(jù)文獻(xiàn)《廉價油脂青睞型脂肪酶產(chǎn)生菌株的篩選及其鑒定》的方法獲得的產(chǎn)脂肪酶微生物基因組為模板采用PCR法獲得信號肽缺失的脂肪酶及其伴侶蛋白基因的ORF序列，標(biāo)記為Lipd25AB。利用《分子克隆實驗指南3》上基因工程的方法構(gòu)建油體蛋白和脂肪酶及其伴侶蛋白表達(dá)載體PET32 (a+)-0-Lipd25AB。將該原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E. coli BL2KDE3)中，獲得用于表達(dá)融合蛋白(油體蛋白-脂肪酶)的工程菌株E. coli BL21(DE3) -0-Lipd25AB。將誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌株與天然油體按比例混合后超聲處理，利用油體蛋白的特異疏水性使融合蛋白錨定到新組成的油體半單位膜上，形成含有脂肪酶的重構(gòu)油體即固定化脂肪酶。利用所制備的固定化脂肪酶催化動植物油脂的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)獲得生物柴油。所述的脂肪酶是用天然油體重構(gòu)技術(shù)固定的脂肪酶，用于制備生物柴油。所述的天然植物油體來源于油脂植物種子如麻瘋樹種子、油菜籽、擬南芥種子、 大豆、花生、棉籽、棕櫚、椰子等天然油體。所述的天然油體與含表達(dá)載體的大腸桿菌合并混勻進(jìn)行超聲波處理條件為功率 20%- %;破碎時間5-10min，將超聲處理后的混合物于10 000 g離心10 min，收集上層白色物質(zhì)，即為天然油體固定化脂肪酶。所獲得的油體蛋白基因大小在40(Tl000bp。脂肪酶基因來源可為根據(jù)文獻(xiàn)《廉價油脂青睞型脂肪酶產(chǎn)生菌株的篩選及其鑒定》的方法獲得的產(chǎn)脂肪酶的不同微生物。所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)包括將收集的天然油體固定化脂肪酶加入到含有脂溶性有機(jī)溶劑、動植物油脂的密閉容器中，然后加入低元醇及水后放于相應(yīng)溫度的搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，每隔一段時間再加入相應(yīng)量的低元醇，連續(xù)多次，轉(zhuǎn)酯后獲得相應(yīng)的脂肪酸酯即為生物柴油。所述的油脂是一種或多種選自麻瘋樹種子油、菜籽油、豬油、大豆油、花生油、棉籽油、棕櫚油、椰子油、食用廢油、皂角或酸化油等的動植物油脂。所述的低元醇為甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，可以一次或多次加入。所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)參數(shù)為溫度15 - 45°C，搖床轉(zhuǎn)速70 - 200 r/min，每隔5_10 h 再加入相應(yīng)量的低元醇，連續(xù)3-5次。本發(fā)明采用天然油體重構(gòu)技術(shù)來固定化脂肪酶達(dá)到了同步固定及高效純化的目的，簡化了制備固定化酶的工藝；其次，天然油體固定化酶用于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后經(jīng)過簡單的處理或自然崩解，其主要成分(油脂)可以作為生物柴油生產(chǎn)底物循環(huán)利用，不僅達(dá)到了資源的充分利用而且有利于環(huán)保；再次，本發(fā)明首次采用天然油體作為固定化酶的基本材料，不僅成本低廉，而且顯著提高了脂肪酶的穩(wěn)定性以及對低元醇的耐受能力。
權(quán)利要求
1.一種使用天然油體作為固定化酶基質(zhì)以制備固定化脂肪酶來生產(chǎn)生物柴油的方法， 其特征在于該方法步驟如下利用天然油體崩解后能自發(fā)重構(gòu)的特點，以油脂植物總mRNA 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，采用PCR法獲得的40(Tl000bp的油體蛋白基因，標(biāo)記為0 ；以根據(jù)文獻(xiàn)《廉價油脂青睞型脂肪酶產(chǎn)生菌株的篩選及其鑒定》的方法獲得的產(chǎn)脂肪酶微生物基因組為模板采用PCR法獲得信號肽缺失的脂肪酶及其伴侶蛋白基因的ORF序列，標(biāo)記為Lipd25AB ；利用《分子克隆實驗指南3》上基因工程的方法構(gòu)建油體蛋白和脂肪酶及其伴侶蛋白表達(dá)載體pET32(a+)-0-Lipd25AB ；將該原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌Ε. coli BL21(DE3)中，獲得用于表達(dá)融合蛋白(油體蛋白-脂肪酶)的工程菌株Ε. coli BL21(DE3) -0-Lipd25AB;將誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌株與天然油體按比例混合后解構(gòu)處理，利用油體蛋白的特異疏水性使融合蛋白錨定到新組成的油體半單位膜上，形成含有脂肪酶的重構(gòu)油體即固定化脂肪酶；利用所制備的固定化脂肪酶催化動植物油脂的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)獲得生物柴油。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的脂肪酶是用天然油體重構(gòu)技術(shù)固定的脂肪酶，用于制備生物柴油。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的天然植物油體來源于油脂植物種子如麻瘋樹種子、油菜籽、擬南芥種子、大豆、花生、棉籽、棕櫚、椰子等天然油體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，所獲得的油體蛋白基因來源于油脂植物如麻瘋樹、油菜、擬南芥、大豆、花生、棉籽、棕櫚、椰子等，大小在40(Tl000bp。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，脂肪酶基因來源可為根據(jù)文獻(xiàn)《廉價油脂青睞型脂肪酶產(chǎn)生菌株的篩選及其鑒定》的方法獲得產(chǎn)轉(zhuǎn)酯酶活脂肪酶的不同微生物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其轉(zhuǎn)酯反應(yīng)包括將收集的天然油體固定化脂肪酶加入到含有親脂性有機(jī)溶劑、動植物油脂的密閉容器中，然后加入低元醇及水后放于相應(yīng)溫度的搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，每隔一段時間再加入相應(yīng)量的低元醇，連續(xù)多次，轉(zhuǎn)酯后獲得相應(yīng)的脂肪酸酯即為生物柴油。
7.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，其特征在于所述的油脂是一種或多種選自麻瘋樹種子油、菜籽油、豬油、大豆油、花生油、棉籽油、棕櫚油、椰子油、食用廢油、皂角或酸化油等的動植物油脂。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，其特征在于所述的親脂性有機(jī)溶劑可以為正己烷/ 石油醚/叔丁醇/乙醚等。
9.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，其特征在于所述的低元醇為甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，可以一次或多次加入。
10.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，其特征在于所述的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)參數(shù)為溫度15-45°C，搖床轉(zhuǎn)速70 - 200 r/min，每隔5-10 h再加入相應(yīng)量的低元醇，連續(xù)3_5次。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用天然油體重構(gòu)法同步純化和固定化脂肪酶的方法，該方法是利用天然油體崩解后能自發(fā)重構(gòu)的特點，將表達(dá)有融合蛋白脂肪酶油體蛋白的大腸桿菌與天然油體按比例混合后超聲處理，利用油體蛋白的特異疏水性使融合蛋白錨定到新組成的油體半單位膜上，形成含有脂肪酶的重構(gòu)油體，從而達(dá)到脂肪酶純化和固定化同步完成的目的。該發(fā)明提供了一種全新的可用于生產(chǎn)生物柴油的脂肪酶固定化技術(shù)，解決了當(dāng)前酶法生產(chǎn)生物柴油過程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺點，制備工藝簡單；本發(fā)明首次采用天然油體作為固定化酶的基質(zhì)，成本低廉、底物適應(yīng)性廣泛，并顯著提高脂肪酶的穩(wěn)定性以及對低元醇的耐受能力。
文檔編號C12P7/64GK102321693SQ20111028311
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者張樹軍, 白方文, 白林含 申請人:四川大學(xué)