專利名稱：一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及病原微生物的診斷方法，具體涉及一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增診斷方法。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織(WHO)將結(jié)核病與艾滋病、瘧疾列為二十一世紀(jì)人類需要攻克的三大傳染性疾病之一。目前中國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，由于流動(dòng)人口數(shù)量增加，公共衛(wèi)生資源不足、公眾重視度不夠，約有5. 5億人遭到感染，每年約13萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐藥肺結(jié)核病疫情嚴(yán)峻，每年新發(fā)耐多藥肺結(jié)核患者數(shù)約為12萬(wàn)，廣泛耐藥肺結(jié)核患者9000例。相關(guān)研究顯示，每個(gè)肺結(jié)核患者一生可以傳染 1(Γ15人，防治耐多藥肺結(jié)核，最好的辦法是盡早發(fā)現(xiàn)、盡早治療，但耐藥結(jié)核病的檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求較高，很多基層衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)無(wú)法開(kāi)展，即便在能夠檢測(cè)的部分地市或更高的衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)，也需要至少2個(gè)月的時(shí)間才能確診一例病例。如果耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病患者的數(shù)量得不到有效控制，疾病的發(fā)病和死亡率將成倍增長(zhǎng)。結(jié)核耐藥性快速診斷方法對(duì)結(jié)核病的防治具有重要價(jià)值，目前我國(guó)在結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)上已有幾項(xiàng)專利，如結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒及其制備方法 (200410083826. 5)、檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因突變的方法和試劑盒(200610037592) 等，以上方法存在操作繁瑣，所需設(shè)備昂貴等不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一組用于快速診斷耐利福平結(jié)核分枝桿菌的特異性引物， 及一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法。本診斷方法方便快捷、用肉眼即可判斷，價(jià)格低廉，適于推廣應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變位點(diǎn)的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在6(T65°C下，6(Γ90分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，并根據(jù)顯色劑顯示的顏色來(lái)區(qū)分對(duì)利福平敏感結(jié)核桿菌和耐利福平結(jié)核桿菌。用于快速診斷耐利福平結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，包括
內(nèi)引物 1 :5，-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3，(SEQ ID No. 1)； 內(nèi)引物 2 :5，-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3，(SEQ ID No. 3)； 夕卜弓I物 2 :5，-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3，(SEQ ID No. 4)?！N耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法，包括如下步驟
(1)模板DNA的制備提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有結(jié)核分枝桿菌的樣品或分離的結(jié)核分枝桿菌；
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液12. 5μ1，DNA聚合酶0. 5 μ ，模板DNA 2 5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20 μ 1 的密封液，將上述反應(yīng)管于63 65°C反應(yīng)6(T90min ；
所述引物混合液含有上述4條特異性引物(SEQ ID No.廣4)，其中，內(nèi)引物1的濃度為 4 8 pmol/μ 、內(nèi)引物2的濃度為4 8 pmol/μ 、外引物1的濃度為1 pmol/μ 、外引物2的濃度為1 pmol/μ ；
所述反應(yīng)液含有 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine, 四者的體積比為7 9 5 :2 4 :9 11 ；
(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入廣2μ1顯色劑STOR GREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，IOmMdNTP 10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液150mM MgSO4 :5mM Betaine (體積比)=8 :5 :3 :10。優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8UM。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的鑒定方法方便快捷，能在較短的時(shí)間內(nèi)診斷出耐利福平結(jié)核分枝桿菌，且不需要昂貴的儀器設(shè)備；靈敏度高，最低可檢測(cè)出100個(gè)菌/ml ； 特異性好，本發(fā)明根據(jù)rpoB基因序列設(shè)計(jì)4條特異性引物，與目的基因的6個(gè)區(qū)域結(jié)合，具有較高的特異性。本發(fā)明對(duì)于利福平敏感結(jié)核桿菌和耐利福平結(jié)核桿菌的診斷與臨床用藥具有較高的參考價(jià)值，適于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變位點(diǎn)的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物，序列分別如下
內(nèi)引物 1 :5，-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3，(SEQ ID No. 1)； 內(nèi)引物 2 :5，-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3，(SEQ ID No. 3)； 夕卜弓I物 2 :5，-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3，(SEQ ID No. 4)。采用上述4條特異性引物診斷耐利福平結(jié)核分枝桿菌，包括如下步驟
(1)模板DNA的制備提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有結(jié)核分枝桿菌的樣品或分離的結(jié)核分枝桿菌；
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液 12. 5μ1，DNA聚合酶0. 5 μ ，模板DNA 2 5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20 μ 1 的密封液，將上述反應(yīng)管于63 65°C反應(yīng)6(T90min ；
所述引物混合液含有上述4條特異性引物(SEQ ID No.廣4)，其中，內(nèi)引物1的濃度為 4 8 pmol/μ 、內(nèi)引物2的濃度為4 8 pmol/μ 、外引物1的濃度為1 pmol/μ 、外引物2的濃度為1 pmol/μ ；
所述反應(yīng)液含有 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine, 四者的體積比為7 9 5 :2 4 :9 11 ；
(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入廣2μ1顯色劑STORGREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，IOmMdNTP 10 X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液150mM MgSO4 :5mMBetaine (體積比)=8 :5 :3 :10。優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8υ/μ1。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。實(shí)施例1
環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的準(zhǔn)備
(1)反應(yīng)液10mMdNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine，四者的體積比為8 5 3 10 ；
(2)引物液包括4ρπιο1/μ1內(nèi)引物1、4ρπιο1/μ1內(nèi)引物2、1pmol/μ 外引物1、1 pmol/ μι外引物2，四條引物序列分別為
內(nèi)引物 1 :5，-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3，(SEQ ID No. 1)； 內(nèi)引物 2 :5，-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3，(SEQ ID No. 2)； 外引物 1 :5，-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3，(SEQ ID No. 3)； 外引物 2 :5’ -GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3，(SEQ ID No. 4)；
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8UM ；
(4)顯色劑熒光染料IXSTORGreen I。用上述反應(yīng)體系按以下方法對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌和耐利福平結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行診斷。本實(shí)施例的待檢樣品是已鑒定為結(jié)核分枝桿菌患者的痰液，當(dāng)然，也可以是已鑒定為結(jié)核分枝桿菌患者的支氣管灌洗液及其它樣品，或者分離的結(jié)核分枝桿菌。1、模板DNA提取
1)將3ml的標(biāo)本置于室溫；
2)在標(biāo)本中加入2倍痰樣體積的4%的NaOH ；
3)每隔aiiin渦旋振蕩15s，處理15min，然后吸取Iml加入帶旋蓋的離心管中；
4)12000r/min 離心 15min，去上清液；
5)加入0. 9%的NaCl lml，洗滌，12000r/min離心15min，去上清液；
6)加入ΙΟΟμΙ的純化水；
7)100°C煮 20min，然后冰浴 IOmin ；
8)離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。2、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在200 ul PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液12. 5μ1， ΝΑ聚合酶 μ ，模板DNA 4μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20 μ 1 的密封液，將上述反應(yīng)管放入63 °C水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)60min后取出反應(yīng)管。3、結(jié)果判定在上述反應(yīng)管中加入1μ 1 IXSYBR Green I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。本實(shí)施例中，PCR管顯橙色，表明待檢樣品所感染的結(jié)核分枝桿菌為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。將本實(shí)施例樣品中分離得到的結(jié)核分枝桿菌接種于含有利福平藥物的改良羅氏培養(yǎng)基上，對(duì)照組為不含利福平藥物的培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)施例的LAMP檢測(cè)結(jié)果相一致。實(shí)施例2
環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的準(zhǔn)備(1)反應(yīng)液:10mMdNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine，四者的體積比為9 5 4 11 ；
(2)引物液包括8ρπιο1/μ1內(nèi)引物1、8ρπιο1/μ1內(nèi)引物2、1pmol/μ 外引物1、1 pmol/ μι外引物2，四條引物的序列與實(shí)施例1相同；
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8UM ；
(4)顯色劑熒光染料IXSTORGreen I。用上述反應(yīng)體系按以下方法對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌和耐利福平結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行診斷。本實(shí)施例的待檢樣品是已鑒定為結(jié)核分枝桿菌患者的支氣管灌洗液。1、模板DNA提取
1)取2ml的待檢樣品置于室溫；
2)加入1倍樣品體積的4%的NaOH ；
3)每隔aiiin渦旋振蕩15s，處理15min，然后吸取Iml加入帶旋蓋的離心管中；
4)12000r/min 離心 15min，去上清液；
5)加入0. 9%的NaCl lml，洗滌，12000r/min離心15min，去上清液；
6)加入ΙΟΟμΙ的純化水；
7)100°C煮 20min，然后冰浴 IOmin ；
8)離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。2、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在200 ul PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液12. 5μ1， ΝΑ聚合酶 μ ，模板DNA 4μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20 μ 1 的密封液，將上述反應(yīng)管放入63 °C水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)60min后取出反應(yīng)管。3、結(jié)果判定在上述反應(yīng)管中加入2μ 1 IXSYBR Green I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。本實(shí)施例中，PCR管顯綠色，表明待檢樣品所感染的結(jié)核分枝桿菌為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌。將本實(shí)施例樣品中分離得到的結(jié)核分枝桿菌接種于含有利福平藥物的改良羅氏培養(yǎng)基上，對(duì)照組為不含利福平藥物的培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)6周，觀察結(jié)果，。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)施例的LAMP檢測(cè)結(jié)果相一致。
權(quán)利要求
1.用于快速診斷耐利福平結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，其特征在于，包括內(nèi)引物 1 :5，-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3，(SEQ ID No. 1)；內(nèi)引物 2 :5，-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3，(SEQ ID No. 2)；外引物 1 :5，-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3，(SEQ ID No. 3)；夕卜弓I物 2 :5，-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3，(SEQ ID No. 4)。
2.一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在60 65°C，等溫?cái)U(kuò)增 60^90分鐘，具體包括如下步驟(1)模板DNA的制備提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有結(jié)核分枝桿菌的樣品或分離的結(jié)核分枝桿菌；(2)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在200μ1PCR管配制反應(yīng)體系引物混合物 μ ，反應(yīng)液 12. 5μ1，DNA聚合酶0. 5 μ ，模板DNA 2 5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ1，然后加入20 μ 1 的密封液，將上述反應(yīng)管于63 65°C反應(yīng)6(T90min ；所述引物混合液含有權(quán)利要求1所述的4條特異性引物，其中，內(nèi)引物1的濃度為4、 pmol/μ 、內(nèi)引物2的濃度為4 8 pmol/μ 、外引物1的濃度為1 pmol/μ 、外引物2的濃度為 1 pmol/μ ；所述反應(yīng)液含有 IOmM dNTP、10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液、150mM MgSO4, 5mM Betaine, 四者的體積比為7 9 5 :2 4 :9 11 ；(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入廣2μ1顯色劑STORGREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法，其特征在于，所述反應(yīng)液中，IOmM dNTP 10XThermoPol 反應(yīng)緩沖液150mM MgSO4 :5mM Betaine(體積比)=8 5 3 :10。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法，其特征在于，所述 DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8υ/μ1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法。其原理是根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變位點(diǎn)的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物，采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63~65°C對(duì)樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到109~1010個(gè)拷貝，通過(guò)加入SYBRGreenI觀察顏色變化來(lái)判斷結(jié)果。本發(fā)明方法具有方便快捷，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷與臨床用藥具有較高的參考價(jià)值，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102304574SQ20111024636
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者葉宇鑫, 周琳, 唐大運(yùn), 常彥磊, 石磊, 鐘球, 陳濤 申請(qǐng)人:廣東省結(jié)核病控制中心, 廣州迪澳生物科技有限公司