專利名稱：一種內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組藥物蛋白的純化方法，更具體地講，涉及一種利用內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白通過非色譜方法純化重組蛋白藥物的方法。
背景技術(shù)：
90年代以來，基因重組技術(shù)得到很大的發(fā)展，特別是近年來隨著對蛋白質(zhì)研究和生產(chǎn)的需要，基因重組技術(shù)突飛猛進，出現(xiàn)了很多基因工程產(chǎn)品，深刻的影響著我們?nèi)祟愖陨砑捌洵h(huán)境。而作為基因技術(shù)的下游工程中的基因重組蛋白的分離純化技術(shù)越來越顯示出其重要性。基因工程產(chǎn)品分離純化的成本約占其全部成本的60% 80%，因此對于蛋白質(zhì)高效制備新技術(shù)和新策略的研究變的極其緊迫與重要。在現(xiàn)代蛋白質(zhì)的分離純化中，層析技術(shù)運用的最廣泛。離子交換層析、凝膠層析、 疏水層析和親和層析是人們用的最多的層析方法，其中親和層析對于重組蛋白的分離純化應該是目前應用最廣泛的一種簡單的分離方法，即將與相應配基的特異性結(jié)合的親和標簽融合到重組蛋白上進行表達，這樣目的蛋白就能專一的與結(jié)合有配基的介質(zhì)進行吸附?；谶@種專一的結(jié)合作用，單步的純化步驟就可以很容易有效的分離和純化出我們需要的目的蛋白。這樣的分離方法結(jié)合效率高、分離速度快、特異性高，分離得到的蛋白純度也高。親和層析按配基不同可分為金屬螯合介質(zhì)、小配體親和介質(zhì)、抗體親和介質(zhì)、顏料親和介質(zhì)、 外源凝集素親和介質(zhì)，目前用的最好最廣泛的是金屬螯合介質(zhì)。但是，用這種傳統(tǒng)的親和標簽的方法仍然有兩個較大的不足。第一，標簽必須要除去。標簽的除去一般用酶解法，即在構(gòu)建重組DNA時在標簽和目的蛋白間引入酶切位點，表達后再用相應的酶將標簽除去。這種方法雖然有效，但蛋白酶的價格昂貴不適合用于大規(guī)模的應用。另外，由于非特性的剪切或是剪切不完全會引起目的產(chǎn)品的大量損失，而且在最后還要多一步蛋白和標簽的除去步驟。基于這些原因，最后我們得到的蛋白是很少的。第二，樹脂和分離設備的價格昂貴，這就使得整個成本的提高，使得大規(guī)?；厥蘸图兓鞍踪|(zhì)顯得仍然很昂貴和困難。特別地，在醫(yī)藥和酶工業(yè)方面要求更高，它們要求制備出的是高純度高活性藥物蛋白，為了滿足日益增長的需要，蛋白分離純化的方法就必須從高效、可靠、穩(wěn)定、低成本方面進行研究?；谶@些原因，避免最后親和標簽酶的處理和昂貴的親和樹脂的分離方法在重組蛋白的快速高效制備方面具有很大意義。本發(fā)明就針對上述這兩點，開發(fā)出一種無需酶也無需昂貴介質(zhì)的純化方法。類彈性蛋白(Elastin-like polypeptides (ELPs))是一類人工合成的生物大分子.由五肽重復序列單元VPGXG(Val-Pr0-Gly-Xaa-Gly，Xaa可以是除了 Pro以外的任意一種氨基酸，來源于哺乳動物的彈性蛋白序列VPGVG)組成。EUs具有溫度依賴性，即它存在一個相變溫度，我們稱之為反轉(zhuǎn)相變溫度(Tt，inverse transition temperature)，EUs的相變一般就發(fā)生在2 3°C的范圍內(nèi)，低于Tt，ELPs是一個單體且高度可溶，然而，當溫度高于Tt時，ELPs會沉淀而不可溶。Tt的高低與ELPs鏈的長度、鏈的組成、Xaa的種類、緩沖液體系以及鹽溶度有關(guān)。比如，當鏈長，鹽濃度高時，Tt溫度就低。由于EUs具有很好的生物相容性，并且已證明ELPs的融合蛋白也具有與ELPs相似的性質(zhì)，所以基于ELPs的生物相容性和依賴溫度的相變的性質(zhì)，ELPs可以作為分離重組蛋白一種很好的工具。內(nèi)含肽(intein)是存在于前體蛋白中的一段序列，在前體蛋白轉(zhuǎn)化為成熟蛋白質(zhì)的過程中，依靠自我剪切作用從前體蛋白中釋放出來，同時將兩端的蛋白質(zhì)外顯肽 (extein)連接在一起，該過程即蛋白質(zhì)剪接過程。內(nèi)含肽以其獨特的蛋白質(zhì)自剪切功能而被廣泛應用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的一個新成員，人Survivin 基因位于第17號染色體的q25帶上，Survivin的主要功能是抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞的增殖，并參與細胞有絲分裂的調(diào)控。Survivin在絕大多數(shù)的腫瘤細胞中都有高表達， 而在成人中除胸腺、睪丸、分泌期子宮內(nèi)膜、神經(jīng)干細胞外，正常組織中均無表達。在對絕大多數(shù)實體瘤(乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、組織肉瘤等)進行研究后發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達水平可以提供有關(guān)腫瘤的預后信息。目前以Survivin作為靶點的腫瘤治療、診斷及預后判斷研究成為抗腫瘤研究中一個熱點。本實驗室成功構(gòu)建了以Survivin為藥靶的促癌細胞凋亡的重組蛋白藥物TAT-Survivin (T34A)(參見文獻Ma Xingyuan, et al.，Journal of Biotechnology, 2006,123 :367-378)，而此蛋白在制備過程中通常是以包涵體的形式表達出來，蛋白的基本純化工藝也是傳統(tǒng)的包涵體變性復性和層析方法，在此純化過程中包涵體的復性是個難題，由于復性的不完全，造成藥物活性的損失。除此之外，層析法所用的介質(zhì)成本高，處理量小。1971年R)lkman提出“腫瘤生長依賴血管生成”的重要概念以來，眾多學者進行了大量的有關(guān)腫瘤血管生成的研究。研究表明，正常組織血管中很少表達VEGF，而常見的實體瘤均有VEGF的過量表達。VEGF通過增加血管通透性，引導內(nèi)皮細胞表達整合素和蛋白酶激活因子，溶解基底膜，促進內(nèi)皮細胞分裂、遷移，在腫瘤血管生成過程中起著關(guān)鍵作用。1993 年Kim首次報道抗VEGF單克隆抗體(單抗)抑制荷瘤鼠的腫瘤生長，隨后又發(fā)現(xiàn)其抑制轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。但由于鼠源單抗在人體內(nèi)易誘發(fā)人抗鼠抗體(HAMA)免疫反應，使其臨床應用嚴重受限?；蚬こ碳夹g(shù)對抗體的改造(即抗體基因重組)可降低其免疫源性，抗體工程也因此成為國內(nèi)外研究熱點。單鏈抗體(ScFv)以其分子量小，穿透力強，免疫源性低，易于大量生產(chǎn)等優(yōu)點，得到了較為廣泛的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種無需親和介質(zhì)和標簽切除酶的、利用內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組藥物蛋白的方法。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案一種內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將待分離蛋白的基因、內(nèi)含肽和類彈性蛋白EUs連接到原核表達載體 PET-32a(+)上，構(gòu)成融合表達載體PET-ELPs-intein-待分離蛋白基因；(2)步驟⑴中構(gòu)建好的表達載體熱沖擊轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5 α菌株，然后將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子亞克隆進大腸桿菌BL21表達菌株中，用IPTG和低溫進行誘導表達；
(4)測定蛋白的相變溫度Tt ；(5)用ITC循環(huán)方法純化重組蛋白和切除ELPs標簽。所述待分離蛋白優(yōu)選為重組藥物蛋白TAT-Survivin (T34A)或者TAT-Anti-VEGF 單鏈抗體。步驟O)中的誘導條件為將轉(zhuǎn)化子接種到LB培養(yǎng)基中，200rmp，37°C培養(yǎng)，直至 OD600 = 0 . 5 0. 8時，加入IPTG至終濃度為ImM/L后放入18°C，150rmp,培養(yǎng)24h。步驟(3)中菌體收集條件為4°C，3000rmp，離心IOmin收集菌體，菌體用Tris緩沖液洗滌一次，離心后收集菌體置-20°C中凍存?zhèn)溆?。步驟(4)中相變溫度的測定過程為取超聲上清液，加入0. 5M NaCl,以2°C為溫度梯度從15°C到40°C測定重組蛋白上清液的OD6qq,當OD值減少到原來的一半時，該溫度即為相變溫度Tt。步驟(5)中ELPs標簽的切除條件為用Cleaving bufferl8°C溫育相變后沉淀下來的蛋白 16 小時；Cleaving buffer 配方為pH6. 4 的 Tris 緩沖液，40mMBis_Tris，0. 5mM EDTA0步驟(5)中ITC循環(huán)的次數(shù)為3次。本發(fā)明的有益效果在于利用內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化系統(tǒng)來純化重組蛋白，由于ELPs的溫度依賴性自我凝集和intein的自我切割功能，將二者結(jié)合，就構(gòu)成了一種不需要傳統(tǒng)分離方法中所需要的昂貴的樹脂和切除標簽所需要的酶，此方法操作簡便， 快速，高效而且試用成本低。


圖1為重組質(zhì)粒構(gòu)建流程示意圖。圖2為重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖3為PCR擴增的TAT-Survivin(TiMA)和TAT-Anti-VEGF基因瓊脂糖電泳圖，其中條帶 1 :Marker ；1 4 目的條帶，左為 TAT-Survivin，右為 TAT-Anti-VEGF。圖4為TAT-Survivin(T34A)蛋白電泳圖，其中條帶1 全菌液；2 菌體超聲后沉淀；3 菌體超聲后上清；4 :cleaving buffer 22°C溫育IMi后；5 :ITC3次后最后得到的目的蛋白 TAT-Survivin (T34A) ；6 =Marker0圖5為TAT-Anti-VEGF(ScFv)蛋白電泳圖，其中條帶1 全菌液；2 菌體超聲后沉淀；3 菌體超聲后上清；4 :cleaving buffer 22°C溫育IMi后；5 :ITC3次后最后得到的目的蛋白 TAT-Anti-VEGF 單鏈抗體；6 =Marker0圖6為重組蛋白TAT-Survivin (T34A)對2種細胞抑制率的MTT法檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實施例一內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化系統(tǒng)純化重組蛋白TAT-Survivin (T34A) 和 TAT-Anti-VEGF 單鏈抗體(ScFv)。一、PCR 擴增 TAT-Survivin (T34A)/TAT-Anti-VEGF 單鏈抗體基因。根據(jù)本實驗室構(gòu)建的pRest-TAT-Survivin(T34A)、PET28a_Anti-VEGF 單鏈抗體
5和PET-ELP-intein (獲贈于美國杜克大學的Dr. Wood)質(zhì)粒的序列，設計了以下引物用于上述基因的擴增。其序列見下表1。所用的引物由華大基因公司合成。表1本實驗中所用的引物
引物名稱引物序列(primer sequence 5'-3')酶切位點(RE sit)Surl5- GATTGTACACAACATGTACGCTCGTAAAG -3Hind IIISur25- ATAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAGCT-3Bsr GlVel5-ATTGTACACAACATGTACGCTCGTAAAGCTCGTCG TCAAGCACGTCGCATGGAAGTTCA-3Hind IIIVe25-GTAAGCTTTCATTTGATTTCAACTTTGGTACCCTGA CCGAAGGTCCACGGAACGGTAGA-3Bsr Gl利用分子生物學實驗技術(shù)，具體方法見《分子克隆》進行。按照下列技術(shù)路線及方法進行構(gòu)建。圖1為質(zhì)粒構(gòu)建示意路程圖，最后構(gòu)建好的表達載體如圖2所示。圖 3 為 PCR 擴增的 TAT-Survivin (T34A)和 TAT-Anti-VEGF 基因。通過菌液 PCR 和華大公司的測序結(jié)果比對分析，正確構(gòu)建了融合表達質(zhì)粒PET-ELP-intein-TAT-Survivi η (Τ34Α)和 PET-ELP-intein-TAT-Anti-VEGF。二、表達并制備 ELP-intein-TAT-Survivin(T34A)蛋白和 TAT-Anti-VEGF 單鏈抗體。1)將測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5 α (Novagen, USA,實驗室保存)用于質(zhì)粒擴增，大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen, USA,實驗室保存)作為質(zhì)粒表達的宿主菌。2)重組蛋白在大腸桿菌中的誘導表達。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌表達菌株BL21感受態(tài)中，37°C過夜培養(yǎng)出單菌落后，挑單菌于5ml LB (含amp)培養(yǎng)基中37°C，180rmp,過夜培養(yǎng)。取5ml菌液于200ml TB培養(yǎng)基中37°C，180rmp培養(yǎng)，至0D600 = 0. 7左右加入IPTG(終溶度ImM/L)后，轉(zhuǎn)入 180C，120rmp,培養(yǎng)Mh。24h后離心收集菌體,離心條件,3000rmp,4°C，15min。收集的菌體用Tris緩沖液洗滌一次后置于4°C保存待用。三、利用ITC 循環(huán)純化 TAT-Survivin (T34A)蛋白 /TAT-Anti-VEGF 單鏈抗體。1)菌體超聲破碎。將收獲的菌體用超聲裂解液裂解重懸后，進行超聲破碎，超聲破碎條件為150w。 超3s停5s，99次循環(huán)，冰浴。超聲完成后離心收集上清，離心條件12000rmp，4°C，lanin。2)相變溫度(Tt)的測定。取超聲上清液，加入0. 5M NaCl,以2°C為溫度梯度從15°C到40°C測定重組蛋白上清液的0D·，但OD值將少到原來的一半時，改溫度即為箱變溫度Tt。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)在NaCl 為0. 5M時37°C時，目的蛋白可以很好的沉下來。3) ITC純化重組蛋白。將收集到的上清加入Nacl (終溶度為0. 5M)，震蕩混勻后放入37°C水浴鍋，溫育IOmin, IOmin后離心收集沉淀，離心條件12000rmp，37°C，lOmin。收集后的沉淀中加入冰的Cleaving buffer,震蕩混勻，放入水浴鍋中進行ELP-intein標簽的自切割，自切割條件22°C水浴，16h。16h后至水浴鍋中取出，加入NaCl (終溶度為0. 5M)，進行ITC沉淀，ITC 沉淀條件37°C水浴，lOmin，沉淀完全后離心收上清，離心條件12000rmp，37°C，lOmin，離心后的上清即為目的蛋白。4) SDS-PAGE蛋白電泳鑒定。電泳緩沖液參照《分子克隆》(第2版相關(guān)章節(jié))。蛋白電泳系統(tǒng)30%丙烯酰胺四丙烯酰胺，N, N’ -亞甲雙丙烯酰胺lg，溶解于水中，定容至100ml，置于棕色瓶中 4°C 保存；IXSDS 凝膠加樣緩沖液50mmol/L Tris-HCl (pH6. 8), lOOmmol/LDTT, 2 % SDS, 0. 溴酚藍，10%甘油；TriS-HCl-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0. 1%SDS。電泳圖如圖4和圖5所示。四、純化后TAT-Survivin(T34A)蛋白的活性檢測。1)細胞凍存。計劃凍存的細胞進入對數(shù)生長期時，在凍存前一天提前換培養(yǎng)液。凍存時先用 0. 25%胰蛋白酶消化單層細胞，收集在EP管中，離心，棄上清，即去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)基，加入預先配制的凍存液，維持細胞終密度為5X107cellS/ml。無菌凍存管中加凍存液lml。對凍存管進行封口，然后直接凍存。凍存程序為4°C保存30min，-20°C保存 30min, -80°C過夜保存，然后迅速投入_196°C液氮罐長期保存。2)細胞復蘇。從冰庫中取出凍存管后用酒精消毒，用移液器吸出細胞凍存液，慢慢滴入10倍體積的新鮮1640培養(yǎng)基中，使凍存液中1640逐漸從細胞中滲出，混勻后低速離心，棄上清液， 再用新鮮1640培養(yǎng)基重復洗一次。培養(yǎng)基稀釋成106cells/ml的懸液后接種于無菌培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)，5% CO2，飽和濕度，24小時后換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)。3)細胞傳代。肺癌細胞系A549培養(yǎng)于含10%的FBS的1640培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細胞長到90%左右時，棄掉舊培養(yǎng)液后加入PBS洗滌一遍，以去掉殘留培養(yǎng)基中的血清，加0. 25%胰酶，輕輕搖動細胞瓶使胰酶布滿細胞平底，計時，用胰酶消化 lmin，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，待細胞質(zhì)收縮且細胞間隙變大后，迅速加入含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶消化。吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液并輕輕吹打瓶壁細胞，使細胞完全從瓶壁脫落且形成單細胞懸液為止，按1傳3比例傳代。4) MTT 檢測法。取對數(shù)生長期的AM9/HCT116細胞，取對數(shù)生長期的AM9/HCT116細胞，胰酶消化后，加入適量含10%新生牛血清的新鮮1640培養(yǎng)基。顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)， 然后再加細胞培養(yǎng)基將細胞稀釋成lX105cellS/ml懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μ 1 (邊緣孔用無菌PBS填充)。同時設置調(diào)零孔(培養(yǎng)基+MTT+ 二甲基亞砜)，對照孔(細胞+相同濃度的藥物溶解介質(zhì)+培養(yǎng)液+MTT+二甲基亞砜)。5% C02，37°C孵育， 當細胞待細胞長到50% 60%匯聚時，小心吸去舊的培養(yǎng)基，分別加入200 μ 1含重組蛋白TATm-Survivin (Τ34Α)的新鮮培養(yǎng)基，每種蛋白終濃度梯度依次為0、36. 7,49. 0,65. 4、 87. 2、116. 2,155,206. 6,274. 66 μ g/ml，另設調(diào)零孔、只加含有10%小牛血清培養(yǎng)基將的對照空、加20 μ 1對應緩沖液的對照孔，每個處理6個復孔；。5% C02，37°C分別孵育Mh、 48h、72h小時，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0. 5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ 1/孔，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀測定其A495值。圖6為重組蛋白TAT-Survivin (T34A)對2種細胞抑制率的MTT法檢測結(jié)果。5)蛋白藥物對癌細胞抑制率與半數(shù)致死率(IC5tl)。以藥物濃度為橫坐標軸，抑制率為縱坐標，通過計算重組蛋白作用后的細胞存活率來反映細胞的增殖情況，并計算藥物對細胞作用24h的半抑制濃度(IC50)，計算結(jié)果如下表2所示。表2 :24h時重組蛋白TAT-Survivin (T34A)對A549和HCT116的半數(shù)抑制濃度。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將待分離蛋白的基因、內(nèi)含肽和類彈性蛋白EUs連接到原核表達載體PET-32a(+) 上，構(gòu)成融合表達載體PET-ELPs-intein-待分離蛋白基因；(2)步驟(1)中構(gòu)建好的表達載體熱沖擊轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α菌株，然后將鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子亞克隆進大腸桿菌BL21表達菌株中，用IPTG和低溫進行誘導表達；(3)收集步驟(2)獲得的菌體，超聲破碎，離心去除細胞碎片，收集得到上清細胞裂解液，置于4°C冰箱備用；(4)測定蛋白的相變溫度Tt;(5)用ITC循環(huán)方法純化重組蛋白和切除EUs標簽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，所述待分離蛋白為重組藥物蛋白TAT-Survivin(T34A)或者TAT-Anti-VEGF單鏈抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟O)中的誘導條件為將轉(zhuǎn)化子接種到LB培養(yǎng)基中，200rmp，37°C培養(yǎng)，直至0D_ =0. 5 0. 8時，加入IPTG至終濃度為ImM/L后放入18°C，150rmp,培養(yǎng)24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟⑶中菌體收集條件為4°C，3000rmp，離心IOmin收集菌體，菌體用Tris緩沖液洗滌一次，離心后收集菌體置-20°C中凍存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟(4)中相變溫度的測定過程為取超聲上清液，加入0. 5MNaCl，以2°C為溫度梯度從 15°C到40°C測定重組蛋白上清液的0D_，當OD值減少到原來的一半時，該溫度即為相變溫度Tt。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟(5)中EUs標簽的切除條件為用Cleaving bufferl8°C溫育相變后沉淀下來的蛋白 16 小時；Cleaving buffer 配方為PH6. 4 的 Tris 緩沖液，40mM Bis-Tris, 0. 5mM EDTA0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白純化重組蛋白的方法，其特征在于，步驟(5)中ITC循環(huán)的次數(shù)為3次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用內(nèi)含肽介導的類彈性蛋白(ELPs)純化重組藥物蛋白的方法。本方法基于類彈性蛋白(ELPs)的溫度依賴的相變特性和內(nèi)含肽的標簽自切割功能，利用二者的結(jié)合開發(fā)出一種無需親和介質(zhì)和標簽切除酶的方法，此方法操作簡單，成本低廉，具有極好的應用前景。
文檔編號C12N15/70GK102373234SQ20111023677
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者唐莉莉, 夏鴻西, 石磊, 馬興元 申請人:華東理工大學