專利名稱：以MyD88TIR二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種以MyD88 TIR 二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型及應用，以實現(xiàn)活細胞原位的、基于熒光信號變化的MyD88 二聚化抑制物的高通量篩選。
背景技術：
IL-IR類受體和Toll-like受體(TLRs)共屬于同一超家族，IL-1R亞家族包括 IL-I β和IL-18的受體及其它成員，介導急性和慢性炎癥反應。Toll-like受體亞家族有 10個成員，識別病源微生物或其代謝產物(如內毒素LPS)，介導天然免疫。當IL-IR類受體和 Toll-like 受體與配體結合后，其胞內的 TIR(Toll/IL-lreceptor homologous region) 結構域發(fā)生構象改變，招募存在于胞漿內的也含有TIR結構域的接頭蛋白分子，這一過程對信號向胞內的傳遞至關重要。0，Neill LA :The interleukin-lreceptor/Toll-like receptor superfamily 10 years of progress. Immunol Rev 2008, 226 10-18.接頭蛋白分子主要包括 MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88) > Mal (MyD88-adaptor-like), ik ^ TIRAP> TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β )、TRAM(trif-related adaptor molecule)、SARM(sterile α andHEAT-Armadillo motifs)[2.0' Neill LA, Bowie AG :The family of five TIR-domain—containing adaptors in Toll—like receptor signal1ing. Nat Rev Immunol 2007,7(5) :353_364.3. Watters TM,Kenny EF,0' Neill LA !Structure,function and regulation of the Toll/IL-lreceptor adaptor proteins. Immunol Cell Biol 2007,85(6) :411_419·], 不同的接頭蛋白決定了不同的信號轉導途徑-MyD88依賴信號途徑和MyD88非依賴途徑。接頭蛋白分子家族中第一個被鑒定的是MyD88，最初發(fā)現(xiàn)為骨髓分化時表達的蛋白[4. Lord ΚΑ, Hoffman-Liebermann B, Li ebermann DA :Nucleotide sequence and expression of a cDNA encoding MyD88, a novel myeloid differentiation primary response gene induced by IL6. Oncogene 1990,5(7) :1095_1097.]，故而得名。對 MyD88 依賴的信號傳導機制目前為止研究的最為成熟，在胞外信號配體刺激下，MyD88可通過自身 C末端的TIR結構域相互作用發(fā)生二聚化，并且MyD88的TIR結構域和受體復合物的TIR結構域也發(fā)生同源性蛋白-蛋白相互作用。MyD88分子N末端的死亡結構域(Dead Domain, DD結構域)再與IRAK家族DD結構域發(fā)生同源性相互作用，形成信號轉導復合物，向下傳遞活化信號，上調轉錄因子AP-I和NF-k B的活性，誘導致炎細胞因子，如IL-1、IL_6、IL-8、 IL-12和TNF- α等基因的表達。接頭蛋白MyD88是信號轉導通路中的關鍵蛋白，其TIR結構域介導的MyD88的二聚化是其被招募到受體的胞漿尾部的前提條件[5. Takeda K5Akira S TLR signaling pathways. Semin Immuno 12004，16 (1) :3_9· ]。MyD88 作為一種重要的接頭蛋白，一方面?zhèn)鬟f了 TLRs介導的先天免疫信號，另一方面也參與了 IL-18受體介導的非感染性炎癥信號的傳遞。類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA) [6. Leung BP, Culshaw S,Gracie JA,Hunter D, Canetti CA, Campbell C,Cunha F,Liew FY, McInnes IB :A rolefor IL-18 in neutrophil activation. JImmunol 2001,167(5) :2879_2886·]、系統(tǒng)性紅斑狼疫(Systmetic Lupus) [7. Favilli F，Anzilotti C，Martinelli L，Quattroni P，De Martino S，Pratesi F，Neumann D，Beermann S，Novick D，Dinarello CA et al :IL_18 activity in systemic lupus erythematosus. Ann N Y Acad Sci2009，1173 :301_309· ]、I 型糖尿病(Type I Diabetes) [8. Rothe H，Jenkins NAiCopeland NGiKolb H :Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF，which is located near Idd2. J Clin Invest 1997,99(3) :469_474·]及動脈粥狀硬化(Atherosclerosis)[9. Kleemann R，Zadelaar S，Kooistra T :Cytokines and atherosclerosis :a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res 2008， 79(3) :360-376.]等慢性炎癥和自身免疫性疾病的炎性放大過程都與MyD88依賴的信號通路相關。目前很多研究根據(jù)MyDSSTIR結構域氨基酸序列設計合成的TIR結構類似物導入哺乳動物細胞，這些結構類似物競爭性地占據(jù)了 MyDSSTIR 二聚化的位點，從而抑制了 MyD88依賴的IL-I β和IL-18的促炎效應[11. Davis CN, Mann E, Behrens MM, Gaidarova S, Rebek Μ, Rebek J, Jr., Bartfai T :MyD88-dependent arid—independent signaling by IL-I in neurons probed by bifunctional Toll/IL-1 receptor domain/BB-loop mimetics. Proc Natl Acad Sci USA 2006,103(8) :2953_2958. 12. Loiarro M, Sette C, Gallo G, Ciacci A, Fanto N, Mastroianni D, Carminati P, Ruggiero V:Peptide-mediated interference of TIR domain dimerization in MyD88 inhibits interleukin-l-dependent activation of NF-{kappa}B. J Biol Chem 2005,280(16) 15809-15814.13. Loiarro M, Capolunghi F, Fanto N, Gallo G, Campo S, Arseni B, Carsetti R, Carminati P, De Santis R, Ruggiero V et al :Pivotal Advance inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAKI and IRAK4by a novel peptidomimetic compound. J Leukoc Biol 2007,82 (4) :801-810.]。有些這樣的工作就其所研究的有效抑制MyD88 二聚化的具體化合物進行了專利申報。FRET技術是一種檢測生物大分子間是否存在直接相互作用的實驗手段[10. Mahajan NP, Linder K, Berry G, Gordon Gff, Heim R, Herman B :Bcl-2and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and fluorescence resonance energy transfer. Nat Biotechnoll998,16(6) :547_552·],近年來，F(xiàn)RET技術常常被用來設計精巧的藥物篩選模型，例如，熒光蛋白供體-受體對(如 CFP-YFP)可被構建成融合蛋白質粒，中間由一段短肽(caspse酶的作用位點L/DEVD)連接， 這種質粒轉染哺乳動物細胞表達后，caspase酶如果活化，CFP和YFP分離，F(xiàn)RET不能實現(xiàn)， caspase酶活性如被抑制，F(xiàn)RET可以實現(xiàn)，從而可以進行caspase抑制劑的篩選[14. Xu X, Gerard AL, Huang BC, Anderson DC, Payan DG, Luo Y -Detection of programmed cell death using fluorescence energy transfer. Nucleic Acids Res 1998，26(8) :2034-2035.15. He L,ffu X, Meylan F, Olson DP, Simone J, Hewgill D, Siegel R, Lipsky PE:Monitoring caspase activity in living cells using fluorescent proteins and flow cytometry. Am J Pathol 2004,164(6) : 1901—1913. 16. Jones J, Heim R，Hare E，Stack J, Pollok BA :Development and application of a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening. J Biomol Screen 2000,5(5) :307_318.]。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于利用熒光共振能量轉移(Fluorescence Re Energy Transfer, FRET)技術，提供一種以MyD88TIR 二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型；因為MyD88被招募到膜受體胞漿尾部是IL-18受體等活化后信號傳遞通路的第一個信號事件，阻斷這一環(huán)節(jié)就抑制了信號在胞內的繼續(xù)發(fā)散和向下傳遞，又因為MyDSSTIR的二聚化是MyD88 與膜受體結合的前提，所以，MyDSSTIR 二聚化的抑制可考慮作為上述慢性非感染性炎癥和自身免疫性疾病治療一個有效靶點；模型的建立將利于MyD88信號通路參與的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物篩選，也會為MyD88信號傳遞相關的基礎研究提供便利的科研工具；我們向細胞內同時轉染兩個質粒熒光蛋白供體為GFP-MyD88TIR，熒光蛋白受體為 RFP-MyD88TIR,建立兩種熒光蛋白雙陽性穩(wěn)定表達的細胞株，即可獲得以MyD88TIR 二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型，要篩查的抑制劑作用靶點是MyD88分子的二聚化。本發(fā)明的另一個目的在于，利用所構建的以MyDSSTIR 二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型，進行活細胞原位熒光信號分析，可以快速得到有效抑制MyDSSTIR 二聚化，進而影響MyD88依賴的信號通路以及最終的生物學效應的化合物；即針對MyD88 二聚化過程的阻斷，建立一種基于細胞培養(yǎng)的、高通量的篩選模型，利用這一模型可以對商品化的小分子庫或自行制備的天然產物組分進行廣泛的篩選，篩查出未知的阻斷MyD88 二聚化的抑制物。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的以MyD88 TIR 二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型，是依賴于一種被稱為熒光共振能量轉移(Fluorescence Re Energy Transfer, FRET) 的分子細胞生物學技術，建立活細胞原位的、基于熒光信號變化的MyD88 TIR 二聚化阻斷的檢測模型；其特征在于可以外源轉染一對目的蛋白基因，二者分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP(或CFP/YFP)融合。這樣，兩種生物大分子的距離足夠近，即小于lOnm，為兩種分子直接相互作用的距離時，在熒光供體的激發(fā)光照射下可以產生熒光受體的發(fā)射光信號；其具體步驟如下首先構建綠色熒光蛋白與MyD88 TIR的融合蛋白真核表達質粒(以下簡稱GFP-MyD88 TIR)和紅色熒光蛋白與MyD88 TIR的融合蛋白真核表達質粒(以下簡稱RFP-MyD88 TIR)；再將二者共同轉染哺乳動物細胞即HeLa，建立兩種熒光蛋白雙陽性穩(wěn)定表達的細胞株。如果培養(yǎng)條件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍光)照射下GFP_MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光會有一部分作為 RFP-MyD88 TIR的激發(fā)光被吸收，進而發(fā)出紅色熒光，綠熒光減弱，即FRET發(fā)生；而如果培養(yǎng)條件中有小分子抑制物存在的話，MyDSSTIR無法發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍光)照射下GFP-MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光不會轉移給RFP_MyD88 TIR,無紅色熒光發(fā)出，細胞產生正常的綠色熒光。原核表達質粒轉化大腸桿菌并純化獲得重組蛋白，進行體外蛋白質-蛋白質相互作用的驗證分析當培養(yǎng)細胞中FRET現(xiàn)象被某種添加的化合物阻斷了，尚不能得出是這種
5化合物直接阻斷了 MyDSSTIR的二聚化結論，因為這種化合物可能引發(fā)了某種細胞內信號級聯(lián)，間接地影響了 MyD88TIR的二聚化；因此利用一個His_MyD88 TIR和GST_MyD88 TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗證在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認為有效阻斷MyD88 二聚化的化合物，如果化合物能直接阻斷MyD88TIR的二聚化，則His_MyD88 TIR體外條件下不能正常結合GST-MyD88 TIR,進行His_MyD88 TIR的Pull-down產物的 western blot分析，不能檢測到GST抗體識別的信號；如果化合物不能直接阻斷MyD88 二聚化，His-MyD88 TIR體外條件下能夠正常結合GST_MyD88 TIR，進行His_MyD88TIR的 Pull-down產物的western blot分析，則可以檢測到GST抗體識別的信號；經此驗證模型， 確切的MyDSSTIR 二聚化抑制劑就可得以判定。實驗材料與方法(1)試劑與抗體細胞轉染用脂質體Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。GST多克隆抗體、 MyD88多克隆抗體購于Santa Cruz公司。谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子(GST-S印harose 4B)購于Amersham公司。Ni-NTA珠子購于Qiagen公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗購于 Sigma公司。其他分析純化學試劑來自于北京化工廠、生化試劑來自于Amresco公司或BBI 公司。(2)細胞培養(yǎng)HeLa細胞購于上海細胞研究所，培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，并添加10%的雙抗(即，青霉素100U/ml、100ug/ml鏈霉素)。培養(yǎng)箱內空氣保證濕度和5%的CO2含量。(3)質粒構建MyDSSTIR結構域片斷通過以人源cDNA為模板進行PCR擴增獲得，PCR產物長度 bp。引物設計參照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫信息(NCBI登錄號NM_002468)。將外源片斷利用限制酶位點Hind III和BamH I插入pEGFP-Cl載體(購于美國BDBioscience公司)，構建綠色熒光蛋白GFP-MyD88TIR融合蛋白表達重組子；將外源片斷利用限制酶位點Hind III和BamH I插入pVisionRFP-C載體(購于美國BioVision公司)，構建紅色熒光蛋白RFP_MyD88TIR 融合蛋白表達重組子。將外源片斷利用限制酶位點BamH I和EcoR I插入到pEGX_6p-l原核表達載體(購于美國GE Healthcare公司)以及利用限制酶位點BamH I和Xho I插入到 pET-28a原核表達載體(購于德國Merck公司)，轉化大腸桿菌BL21，可獲得GST_MyD88TIR 融合重組蛋白和His-MyD88 TIR融合重組蛋白。質粒構建及大腸桿菌轉化等方法按常規(guī)分子克隆技術進行。(4)GFP及其融合蛋白質粒、RFP及其融合蛋白質粒的轉染及熒光顯微術接種5X IO4個細胞于48孔培養(yǎng)板的每孔，無抗生素培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。轉染利用Invitroge公司的轉染試劑Lipofectamine 2000，按說明書操作進行。每種質粒的用量為0. 5μ g。轉染4-6小時后更換含抗生素和10%血清的IMDM培養(yǎng)基。次日，在倒置熒光顯微鏡(Nikon TE 2000U)的488nm及510nm激發(fā)光下觀察各組轉染細胞的熒光情況。(5)重組蛋白的表達純化原核表達質粒轉化大腸桿菌BL21，接種于IOOmL含卡鈉霉素的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)3小時。加入200 μ 1 0. 5Mol IPTG繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時，誘導表達。
His-MyD88 TIR的純化離心收集菌體后800 μ 1緩沖液A (IOmMol Tris-HCl (pH8. 0),500mMol NaCl，10% 甘油，0· 1% Tween-20, IOmMol 咪唑，0· 1% β -巰基乙醇，10 μ Mol ZnSO4與ImMol PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加)重懸，超聲10秒，間歇10秒，共3分鐘，功率300W。加入終濃度為的Triton-XlOO混勻，13000rpm, 10min，4°C離心。轉移上清到新的EP管中，加入Ni-NTA珠子，4°C搖2-3小時。離心純化His重組蛋白。緩沖液A洗珠子 3-5 次，再用緩沖液 E(20mMol HEPES_K0HpH(7. 5)，20 % 甘油，IOOmMol NaCl, IOmMol 咪唑，ImMol EDTA, ImMol DTT, 10 μ Mol ZnSO4 與 ImMol PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加)洗珠子 3 次。純化的結合于Ni-NTA珠上的His重組蛋白可用于Pull-down實驗。GST-MyD88 TIR 的純化誘導表達后的菌體通過離心獲得，加入800 μ 1細菌裂解液(20mMHEPES(pH7. 5)， 120mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA, ImM PMSF)，重懸，超聲10秒，間歇10秒，超聲6次，功率 300W。加入終濃度為0. 5%的NP-40混勻，13000rpm，10min，4°C離心。轉移上清到新的EP 管中，加入50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子在4°C搖床上搖動1-2小時。離心純化GST重組蛋白。先用含有0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次，再用不含0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次。純化的結合于谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠上的GST重組蛋白可用于Pull-down實驗。(6)重組蛋白體外相互作用分析首先，將GST融合蛋白從瓊脂糖珠上洗脫。取0. 1 μ g GST-MyD88-TIR離心吸去上清，加入等體積的谷氨酰胺洗脫緩沖液(IOmMol還原型谷胱甘肽，50mMol Tris-HCl (ρΗ8· 0))，冰上漩渦振蕩30分鐘，離心后吸上清至500 μ 1 GBT buffer,再加入 1 μ g封閉后的His融合蛋白Ni-NTA珠，4°C搖床上搖動2_3個小時。GBT緩沖液洗2次，緩沖液A洗一次，緩沖液E洗一次，每次于冰上搖動約5分鐘。離心后加入20 μ 1上樣緩沖液， 沸水煮5min，免疫印記檢測GST融合蛋白。本發(fā)明的積極效果是當抑制物存在，MyDSSTIR 二聚化不能實現(xiàn)時，F(xiàn)RET效率受到嚴重影響，提示了依賴雙陽性表達GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的細胞株，檢測不同化合物對于熒光FRET效率的影響，可以建立MyD88 TIR 二聚化抑制藥物的篩選模型。此外， 我們構建了原核表達質粒，利用純化的His-MyD88 TIR與GST_MyD88 TIR體外結合分析，可以進一步確定抑制物是否直接阻斷了 MyD88 TIR的相互作用。結合真核細胞的熒光FRET 阻斷結果和原核表達的重組蛋白相互作用分析，可確定MyD88 TIR 二聚化的抑制物。根據(jù)以上所述技術方法，本發(fā)明的技術方案可以實現(xiàn)，結合高通量篩選儀，可以建立一種基于細胞培養(yǎng)的、活細胞原位熒光信號變化的、高通量的篩選模型，利用這一模型可以對商品化的小分子庫或自行制備的天然產物組分進行廣泛的篩選，篩查出未知的阻斷MyD88 TIR 二聚化的抑制物。


圖IHeLa細胞轉染不同質粒組合，MyD88 TIR 二聚化可引起GFP_MyD88 TIR和 RFP-MyD88 TIR熒光共振能力轉移圖2示意MyD88 TIR 二聚化實現(xiàn)時能夠介導綠色熒光蛋白(GFP)發(fā)射的熒光能夠將能量轉移給紅色熒光蛋白(RFP)。
圖3示意MyD88 TIR 二聚化受抑制時GFP發(fā)射的熒光無法實現(xiàn)能量向RFP進行的轉移圖4非變性緩沖液中，MyD88 TIR可以介導GST_MyD88 TIR和His_MyD88 TIR在體外的結合，GST的免疫印記(western blot)信號陽性圖5示意體外緩沖液中有抑制物存在時，固定于珠子上的His-MyD88 TIR無法將 GST-MyD88 TIR結合下來，Western blot將檢測不到GST信號圖6示意體外緩沖液中不存在抑制性成分時，固定于珠子上的His-MyD88 TIR可以將GST-MyD88 TIR結合下來，Western blot將檢測到GST信號
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描述實施例1 轉染哺乳動物細胞的GFP_MyD88 TIR和RFP_MyD88 TIR可以發(fā)生熒光共振能量轉移我們按圖1中所示的組合，將構建好的GFP-MyD88 TIR, RFP_MyD88 TIR, GFP, RFP 質粒共轉染到HeLa細胞中。在488nm激發(fā)光下，共轉染GFP-MyD88 TIR和RFP_MyD88TIR融合蛋白的細胞(左側照片)發(fā)出昏暗的綠色熒光，甚至有些細胞還發(fā)出橘黃色的光。證明了 GFP發(fā)出的綠色熒光應為MyDSSTIR的二聚化將能量傳遞給RFP，實現(xiàn)了 FRET。而對照組共轉染GFP-MyD88 TIR融合蛋白和空載RFP的質粒(中間照片)，或反之，共轉染空載GFP和 RFP-MyD88 TIR融合蛋白的質粒(右側照片)，488nm激發(fā)光下觀察，細胞顯示明亮的綠色熒光。說明共轉染GFP-MyD88 TIR和RFP或共轉染GFP和RFP_MyD88 TIR的細胞因為無法形成MyD88 TIR的二聚化，熒光共振能量轉移無法發(fā)生，證明了一旦MyD88 TIR的二聚化受影響，488nm激發(fā)光下GFP發(fā)射的綠色熒光無法將能量轉移給RFP。(分別轉染GFP_MyD88 TIR和RFP或者是GFP和RFP_MyD88 TIR的細胞在488nm激發(fā)光下發(fā)出正常的明亮綠色熒光，證明了 GFP和GFP-MyD88 TIR綠色熒光的有效性；所有轉染RFP或者RFP_MyD88 TIR的細胞在510nm激發(fā)光下能過發(fā)出正常的紅色熒光，進一步證明了 RFP或者RFP_MyD88 TIR 紅色熒光的有效性。)我們完成的圖1所示的實驗結果提示，可以利用FRET技術建立一個活細胞培養(yǎng)的、基于熒光信號變化的篩選模型將GFP-MyD88 TIR和RFP_MyD88 TIR共轉染哺乳動物細胞(如HeLa)，建立穩(wěn)定雙表達陽性的細胞株。如圖2和圖3所示，如果細胞中不存在MyD88 TIR 二聚化抑制物時，F(xiàn)RET能夠發(fā)生，而當抑制物存在時，F(xiàn)RET受到影響。實施例2 :His-MyD88 TIR重組蛋白可以與GST-MD88 TIR重組蛋白體外相互作用上述實施例1所述活細胞原位熒光模型尚存在一個問題當培養(yǎng)細胞中FRET現(xiàn)象被某種添加的化合物阻斷了，我們尚不能得出結論，是這種化合物直接阻斷了MyD88 TIR的二聚化，還是這種化合物引發(fā)了某種細胞內信號級聯(lián)，間接地影響了 MyD88 TIR的二聚化。 針對這一問題，我們可以利用一個His-MyD88 TIR和GST_MyD88 TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗證。為此，我們又構建了原核表達融合蛋白GST_MyD88 TIR和His_MyD88 TIR的質粒， 轉化大腸桿菌后誘導蛋白表達(重組融合蛋白可以被MyD88抗體免疫印記特異識別，證明 MyD88 TIR的正確表達)。如圖4所示，經純化的結合與Ni-TNA珠上的His_MyD88 TIR重
8組蛋白與純化的洗脫后的GST-MyD88 TIR重組蛋白或GST重組蛋白進行孵育，Ni-NTA瓊脂糖珠結合下來的蛋白進行蛋白電泳和抗GST免疫印記分析，結果顯示，GST-MyD88 TIR可以被Ni-NTA瓊脂糖珠結合下來(左側泳道)，GST蛋白(右側泳道)卻不能，說明了是MyD88 TIR 二聚化介導了 GST-MyD88 TIR和His_MyD88 TIR融合蛋白的體外結合我們完成的圖4所示的實驗提示了，利用重組蛋白，進行體外蛋白質-蛋白質相互作用的驗證分析具有可行性在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認為有效阻斷MyD88 二聚化的化合物。圖5示意體外非變性條件下，如果有抑制物存在時，His-MyDSS TIR無法憑借MyD88 TIR的二聚化將GST_MyD88 TIR結合下來，結合物(Pull-down產物)做 western blot分析檢測不到GST的免疫印記信號；圖6則示意無抑制物存在時，His_MyD88 TIR可以憑借MyD88 TIR的二聚化將GST_MyD88 TIR結合下來，結合物(Pull-down產物) 做western blot分析可以檢測到GST的免疫印記信號。以上兩實施例說明，經活細胞熒光篩選模型篩選，再經體外重組蛋白驗證模型驗證，確切的MyD88 TIR 二聚化抑制劑就可以被確定下來。實驗材料與方法(1)試劑與抗體細胞轉染用脂質體Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。GST多克隆抗體、 MyD88多克隆抗體購于Santa Cruz公司。谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子(GST-S印harose 4B)購于Amersham公司。Ni-NTA珠子購于Qiagen公司。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗購于 Sigma公司。其他分析純化學試劑來自于北京化工廠、生化試劑來自于Amresco公司或BBI 公司。(2)細胞培養(yǎng)HeLa細胞購于上海細胞研究所，培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，并添加10%的雙抗(即，青霉素100U/ml、100ug/ml鏈霉素)。培養(yǎng)箱內空氣保證濕度和5%的CO2含量。(3)質粒構建MyD88 TIR結構域片斷通過以人源cDNA為模板進行PCR擴增獲得，PCR產物長度 bp。引物設計參照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫信息(NCBI登錄號NM_002468)。將外源片斷利用限制酶位點Hind III和BamH I插入pEGFP-Cl載體(購于美國BDBioscience公司)， 構建綠色熒光蛋白GFP-MyDSSTIR融合蛋白表達重組子；將外源片斷利用限制酶位點Hind III和BamH I插入pVisionRFP-C載體(購于美國BioVision公司)，構建紅色熒光蛋白 RFP-MyD88TIR融合蛋白表達重組子。將外源片斷利用限制酶位點BamH I和EcoR I插入到 pEGX-6p-l原核表達載體(購于美國GE Healthcare公司)以及利用限制酶位點BamH I和 Xho I插入到pET-28a原核表達載體(購于德國Merck公司)，轉化大腸桿菌BL21，可獲得 GST-MyD88 TIR融合重組蛋白和His_MyD88 TIR融合重組蛋白。質粒構建及大腸桿菌轉化等方法按常規(guī)分子克隆技術進行。(4)GFP及其融合蛋白質粒、RFP及其融合蛋白質粒的轉染及熒光顯微術接種5X IO4個細胞于48孔培養(yǎng)板的每孔，無抗生素培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。轉染利用Invitroge公司的轉染試劑Lipofectamine 2000，按說明書操作進行。每種質粒的用量為0. 5μ g。轉染4-6小時后更換含抗生素和10%血清的IMDM培養(yǎng)基。次日，在倒置熒光顯微鏡(Nikon TE 2000U)的488nm及510nm激發(fā)光下觀察各組轉染細胞的熒光情況。(5)重組蛋白的表達純化原核表達質粒轉化大腸桿菌BL21，接種于IOOmL含卡鈉霉素的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)3小時。加入200 μ 1 0. 5Mol IPTG繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時，誘導表達。His-MyD88 TIR的純化離心收集菌體后800 μ 1緩沖液A (IOmMol Tris-HCl (pH8. 0),500mMol NaCl，10% 甘油，0· 1% Tween-20, IOmMol 咪唑，0· 1% β -巰基乙醇，10 μ Mol ZnSO4與ImMol PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加)重懸，超聲10秒，間歇10秒，共3分鐘，功率300W。加入終濃度為的Triton-XlOO混勻，13000rpm, 10min，4°C離心。轉移上清到新的EP管中，加入Ni-NTA珠子，4°C搖2-3小時。離心純化His重組蛋白。緩沖液A洗珠子 3-5 次，再用緩沖液 E(20mMol HEPES_K0HpH(7. 5)，20 % 甘油，IOOmMol NaCl, IOmMol 咪唑，ImMol EDTA, ImMol DTT, 10 μ Mol ZnSO4 與 ImMol PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加)洗珠子 3 次。純化的結合于Ni-NTA珠上的His重組蛋白可用于Pull-down實驗。GST-MyD88 TIR 的純化誘導表達后的菌體通過離心獲得，加入800 μ 1細菌裂解液(20mMHEPES(pH7. 5)， 120mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA, ImM PMSF)，重懸，超聲10秒，間歇10秒，超聲6次，功率 300W。加入終濃度為0. 5%的NP-40混勻，13000rpm，10min，4°C離心。轉移上清到新的EP 管中，加入50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子在4°C搖床上搖動1-2小時。離心純化GST重組蛋白。先用含有0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次，再用不含0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次。純化的結合于谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠上的GST重組蛋白可用于Pull-down實驗。(6)重組蛋白體外相互作用分析首先，將GST融合蛋白從瓊脂糖珠上洗脫。取0. 1 μ g GST-MyD88-TIR離心吸去上清，加入等體積的谷氨酰胺洗脫緩沖液(IOmMol還原型谷胱甘肽，50mMTriS-HCl(pH8. 0))， 冰上漩渦振蕩30分鐘，離心后吸上清至500 μ 1 GBT buffer,再加入1 μ g封閉后的His融合蛋白Ni-NTA珠，4°C搖床上搖動2-3個小時。GBT緩沖液洗2次，緩沖液A洗一次，緩沖液 E洗一次，每次于冰上搖動約5分鐘。離心后加入20 μ 1上樣緩沖液，沸水煮5min，免疫印記檢測GST融合蛋白。依據(jù)上述妨術原理IU及實施例的實驗結果，IHriau各It型的建立禾π#用方法i羊細描述如下(1)構建綠色熒光蛋白與MyD88TIR的融合蛋白真核表達質粒(GFP_MyD88 TIR) 和紅色熒光蛋白與MyD88TIR的融合蛋白真核表達質粒(RFP_MyD88 TIR)，共轉染HeLa細胞，建立和篩選表達強度適當?shù)?、雙陽性穩(wěn)定表達GFP-MyD88 TIR和RFP_MyD88 TIR(或 CFP-MyD88 TIR 和 YFP_MyD88 TIR)細胞株。(2)獲得上述細胞株后，將商品化購得的小分子庫或自行制備的天然產物不同成分等被篩物加入到培養(yǎng)基中，結合高通量篩選設備和相應的計算機函數(shù)運算，可以實現(xiàn)高通量的、活細胞原位的MyD88 二聚化抑制劑的篩選。(3)在上述篩選過程中，對熒光FRET有影響的化合物進一步進行實施例2所描述的體外重組蛋白質(His-MyD88 TIR和GST_MyD88 TIR)相互作用驗證，確認對MyD88 TIR 二聚化抑制的有效性及特異性。
權利要求
1.以MyDSSTIR二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型，其特征在于可以將MyD88分子的TIR結構域(以下稱MyD88 TIR)分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP (或 CFP/YFP)構建融合蛋白質粒，轉染哺乳動物細胞，建立雙陽性表達的細胞株。如兩種生物大分子(熒光供體分子和熒光受體分子)的距離足夠近，即小于lOnm，為兩蛋白分子直接相互作用的距離，在熒光供體的激發(fā)光照射下可以產生熒光受體的發(fā)射光信號，即發(fā)生熒光共振能量轉移(FRET)；如果熒光供體分子和熒光受體分子的結合受到阻礙，則FRET受到影響。其具體步驟如下首先構建綠色熒光蛋白與MyDSSTIR的融合蛋白真核表達質粒(以下簡稱GFP-MyD88 TIR)和紅色熒光蛋白與MyD88 TIR的融合蛋白真核表達質粒(以下簡稱RFP-MyD88 TIR)；再將二者共同轉染哺乳動物細胞(如HeLa)，并建立雙陽性表達的細胞株。如果培養(yǎng)條件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍光) 照射下GFP-MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光會有一部分作為RFP_MyD88 TIR的激發(fā)光被吸收， 進而發(fā)出紅色熒光，綠熒光減弱，即FRET發(fā)生；而如果培養(yǎng)條件中有小分子抑制物存在的話，MyD88 TIR無法發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍光)照射下GFP_MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光不會轉移給RFP-MyD88 TIR，無紅色熒光發(fā)出，產生正常的綠色熒光。細胞培養(yǎng)和藥物篩選可結合高通量篩選儀及熒光值的相關函數(shù)運算；對于上述基于熒光信號變化的篩選模型認定陽性(即，對FRET有影響)的化合物， 還需利用原核表達并純化的重組蛋白，進行體外蛋白質-蛋白質相互作用的驗證分析當培養(yǎng)細胞中FRET現(xiàn)象被某種添加的化合物阻斷了，尚不能得出是這種化合物直接阻斷了 MyD88 TIR的二聚化結論，還是這種化合物引發(fā)了某種細胞內信號級聯(lián)，間接地影響了 MyD88 TIR的二聚化；因此利用一個His_MyD88TIR和GST_MyD88 TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗證；具體步驟如下在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認為有效阻斷MyD88 TIR 二聚化的化合物，如果化合物能直接阻斷MyD88 TIR的二聚化，則His_MyD88 TIR體外條件下不能正常結合GST-MyD88 TIR，進行His_MyD88 TIR結合物(Pull-down產物)的 western blot分析，不能檢測到GST抗體識別的信號；如果化合物不能直接阻斷MyD88 TIR 二聚化，His-MyD88 TIR體外條件下能夠正常結合GST_MyD88 TIR，進行His_MyD88 TIR結合物(Pull-down產物)的western blot分析，則可以檢測到GST抗體識別的信號；經此驗證模型，確切的MyD88 TIR 二聚化抑制劑就可得以判定。
2.&MyD88 TIR 二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型用于對商品化的小分子庫、自行制備的天然產物組分或各種化學合成物、修飾物進行廣泛的篩選，從中獲得有效的MyD88 二聚化的抑制性化合物，參與對MyD88信號通路依賴的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物蹄選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以MyD88TIR二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型及應用，其特征在于將MyD88TIR分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP構建融合蛋白質粒，轉染哺乳動物細胞，建立雙陽性表達的細胞株。可以檢測到FRET現(xiàn)象；當培養(yǎng)基中存在MyD88TIR二聚化抑制物時，提示了依賴雙陽性表達GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的細胞株，經體外結合分析，可以進一步確定抑制物是否直接阻斷了TIR的相互作用。結合真核細胞的熒光FRET阻斷結果和原核表達的重組蛋白相互作用分析，可確定MyD88TIR二聚化的抑制物。利用該模型可以對商品化的小分子庫、自行制備的天然產物組分或各種化學合成物、修飾物進行廣泛的篩選，從中獲得有效的MyD88二聚化的抑制性化合物，參與對MyD88信號通路依賴的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物篩選。
文檔編號C12Q1/02GK102321586SQ20111023631
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權日2011年8月17日
發(fā)明者巴雪青, 曾憲錄 申請人:東北師范大學