專利名稱：一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種甘藍(lán)型油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記，同時還涉及該分子標(biāo)記在油菜高產(chǎn)育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油菜是最重要的油料和能源作物之一，其脂肪酸碳鏈長度和結(jié)構(gòu)接近化石柴油， 是一種適宜于生產(chǎn)生物柴油的植物油。在當(dāng)前和今后相當(dāng)長的時間內(nèi)，全世界都將面臨食用植物油和化石能源短缺的嚴(yán)峻局面，因此大幅度增加菜籽油供應(yīng)總量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。在城市化規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大耕地面積進(jìn)一步縮小的形式下，持續(xù)提高單位面積產(chǎn)油量(=單產(chǎn)X含油量)是唯一出路。近年來，高含油量品種選育已取得了重大突破，某些代表性品種(如中雙11號等)的含油量已接近甚至超過50%，這已越來越接近油菜種質(zhì)資源的最高含油量，這預(yù)示著高含油量育種即將遭遇瓶頸。與此相反，油菜單產(chǎn)提高的潛力還很大，這具體表現(xiàn)在各國參試油菜品種產(chǎn)量構(gòu)成因子的平均值跟油菜種質(zhì)資源的最高水平相比還有相當(dāng)差距。例如，我國2000-2009年冬油菜四大區(qū)參試油菜品種平均千粒重在4克以下(俞琦英等，2010)，而油菜種質(zhì)資源中的最高千粒重超過了 8克。并且，參試油菜品種千粒重和單株產(chǎn)量的相關(guān)性很高，達(dá)0. 5303。雖然油菜單株產(chǎn)量的三個構(gòu)成因子之間表現(xiàn)不同程度的負(fù)相關(guān)，但其相關(guān)系數(shù)往往不大(Shi et al. 2009)，這表明可以通過提高單個產(chǎn)量構(gòu)成因子(如千粒重)來增加產(chǎn)量(^iang et al. 2007)。雖然傳統(tǒng)育種方法曾經(jīng)為生產(chǎn)提供了許多優(yōu)良油菜品種，但由于育種周期長、選擇效率低，已經(jīng)無法完全滿足當(dāng)前油菜生產(chǎn)的需要。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展， 育種家們對性狀的選擇正在逐漸實(shí)現(xiàn)由表型選擇向基因型選擇的過渡。分子標(biāo)記輔助育種是將分子遺傳學(xué)與傳統(tǒng)的表型選擇有效結(jié)合的一種新的育種手段，其基本原理是在油菜育種過程中直接利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖和共分離的分子標(biāo)記對選擇個體進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域以及全基因組篩選，以達(dá)到提高目標(biāo)性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)的關(guān)鍵是鑒定與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記。近年來，美國等發(fā)達(dá)國家都投入巨資開展這方面的研究工作。伴隨著水稻、玉米、小麥等重要作物農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記的開發(fā)，利用篩選到的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種已漸趨成熟，目標(biāo)性狀也從簡單的單基因質(zhì)量性狀擴(kuò)展到復(fù)雜的多基因數(shù)量性狀。隨著基因組學(xué)和測序技術(shù)的高速發(fā)展， 油菜分子標(biāo)記研究日漸受到關(guān)注，研究的領(lǐng)域涉及種質(zhì)遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、 基因標(biāo)記和定位、品種純度鑒定、配合力預(yù)測、標(biāo)記輔助選擇等多方面，并取得了重要進(jìn)展。 但與發(fā)達(dá)國家相比，我國油菜分子育種研究還有較大差距，主要體現(xiàn)在不能有效地發(fā)掘和利用種質(zhì)資源中的有利基因，缺乏有自主知識產(chǎn)權(quán)及育種價值的基因和標(biāo)記等。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為兩種一種是基于分子雜交技術(shù)，另一種則以PCR技術(shù)為核心。Grodzicker等(1974)創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)標(biāo)記技術(shù)。Botstein 等(1980)首先提出用限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜的設(shè)想，從而開創(chuàng)了利用分子標(biāo)記作為遺傳標(biāo)記的新時代。隨后幾十種基于分子雜交(如RFLP和微陣列技術(shù)等)或PCR(如RAPD，SSR, AFLP, SRAP等)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)陸續(xù)建立，并廣泛應(yīng)用于植物科學(xué)的研究中。大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀(如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等)均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，表型連續(xù)分布且易受環(huán)境條件的影響，因此基于表型選擇的常規(guī)育種方法對復(fù)雜數(shù)量性狀的選擇效果不好，致使育種效率低下，育種周期延長。由于分子標(biāo)記技術(shù)和數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展和結(jié)合，人們已可將復(fù)雜的數(shù)量性狀分解為單個的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(quantitative trait loci，QTL)，然后像研究質(zhì)量性狀一樣對控制數(shù)量性狀的多個基因進(jìn)行研究。QTL定位就是在遺傳分離群體的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記和遺傳圖譜，利用QTL作圖軟件對分離群體的數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定數(shù)量性狀基因在染色體上的位置和效應(yīng)。目前對油菜千粒重的QTL定位研究也有一些報道，但通常檢測出的QTL效應(yīng)值較小且重復(fù)性不好，較難在油菜育種中應(yīng)用。本研究通過QTL定位，旨在篩選到對油菜千粒重具有正向效應(yīng)的QTL，用于油菜產(chǎn)量性狀的標(biāo)記輔助選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供了一種油菜千粒重性狀的主效基因位點(diǎn)。該主效基因位點(diǎn)的效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率都超過已往的報導(dǎo)，對油菜千粒重的調(diào)控起著關(guān)鍵作用，可用作圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記。該標(biāo)記離主效基因位點(diǎn)的遺傳距離很近(< 2cM)且是基于PCR技術(shù)的共顯性SSR標(biāo)記，因而可靠且使用方便，這給今后中雙11號衍生品系的選育提供了極大的便利。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在油菜高產(chǎn)育種中的應(yīng)用。申請人利用該標(biāo)記對育種群體F3代進(jìn)行了輔助選擇，結(jié)果表明攜帶有利標(biāo)記的單株80%以上其千粒重超過群體均值，這表明該標(biāo)記用于輔助選擇是切實(shí)有效的。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)的分離方法，它包括如下步驟 (1)利用油菜測序品種中雙11號和73290雜交，雜種Fl代自交產(chǎn)生F2和F2 3代分離群體。本發(fā)明用到的研究材料由中國農(nóng)科院油料所油菜生物技術(shù)育種課題組提供。(2)采用CTAB法(Doyle et al. 1987)提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括提取液(1. 4M NaCl, IOOmM Tris,pH 8. 0,20mM EDTA, PH 8.0,2% CTAB)、氯仿、異戊醇和無水乙醇；(3)合成油菜公開(http //www. ukcrop. net/Brassica DB)和自主開發(fā)的簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR)禾口單核昔酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)引物，并對親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進(jìn)行判別，篩選多態(tài)性引物。過程中所用到的主要軟件包括 MISA(http//PRrc. ipk-Ratersleben. de/misa/)，BffA(http//bio~bwa. sourceforRe. net/)，SAMtools(http://samtools. sourceforge. net/)和 primer3(http://www. genome, wi. mit. edu/cgi-bin/primer/primer3-www. cgi)等，都是免費(fèi)公幵的；主要試齊Ll包括 Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸銀和碳酸鈉。(4)利用多態(tài)性引物對F2分離群體進(jìn)行分子標(biāo)記分析，獲得基因型數(shù)據(jù)。過程中用到的試劑(Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸銀和碳酸鈉)如上所述；(5)把F2分離群體的基因型數(shù)據(jù)輸入Joinmap3. 0軟件(http://www. kyazma. nl/ index, php/mc. JoinMap)，進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建；(6)F2群體的基因型數(shù)據(jù)(僅限于定位到遺傳圖譜上的標(biāo)記)以及F2和F2:3 群體的千粒重性狀數(shù)據(jù)輸入 WinQTLcart2. 5 軟件(http//statgen. ncsu. edu/qtlcart/ WQTLCart.htm)進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci，QTL)定位，總共檢測到了 8 個控制千粒重的QTL。其中，位于A9連鎖群(對應(yīng)白菜第9染色體)上的QTL在兩個群體中能重復(fù)檢測到，而且效應(yīng)值和貢獻(xiàn)率最大。利用上述技術(shù)措施，申請人最終獲得了油菜千粒重性狀的主效基因位點(diǎn)qTSW. A9,該主效基因位點(diǎn)位于油菜A9染色體，與申請人自主開發(fā)的SSR標(biāo)記BrSF7-181a 緊密連鎖，其引物序列為 BrSF7-181-F :TCGCGAGGAATAGAACGAAT ;BrSF7-181-R GGAACCTTCTCGATGGTTTTT。利用WinQTLCart2. 5軟件分析測得其對油菜千粒重的平均貢獻(xiàn)率為33. 5 %，加性效應(yīng)為0. 31，顯性效應(yīng)為0.沈，近似顯性遺傳。本研究中所用的親本材料為中雙11號和73四0，均由中國農(nóng)科院油料所生物技術(shù)育種課題組技術(shù)人員在王漢中研究員帶領(lǐng)下育成。中雙11號是由中雙9號與高油、長角和大粒品系2F10和沈102經(jīng)復(fù)合雜交、小孢子培養(yǎng)和加倍選育而來；73290由93275(中油雜 4號恢復(fù)系)作母本和中雙2號選株雜交的雜種Fl代進(jìn)行小孢子培養(yǎng)與套袋自交選育而成 (所有權(quán)歸本課題組所有)。一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在油菜高產(chǎn)育種中的應(yīng)用，其步驟是(1)田間種植中選F2代單株自交所產(chǎn)生的F3種子，在定苗前取樣，用CTAB法抽提葉片總DNA，過程中所用到的試劑(提取液、氯仿、異戊醇和無水乙醇)如上所述；(2)利用qTSW. A9位點(diǎn)的分子標(biāo)記BrSF7_181a對兩親本的F3代進(jìn)行基因型鑒定， 并在收獲后進(jìn)行千粒重的考種。結(jié)果表明，通過分子標(biāo)記輔助選擇得到的植株千粒重超過 F2:3家系均值克)的占87.5%，在保留下來的植株中再篩選果多和粒多的單株。通過鑒定上述千粒重主效基因位點(diǎn)來預(yù)測油菜千粒重，可提高油菜高產(chǎn)育種的選擇效率，從而加快育種進(jìn)程。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明首次定位了油菜大粒品種中雙11號中控制千粒重的主效基因位點(diǎn)，可解釋33. 5%的表型方差。在常規(guī)育種方法中，千粒重性狀表型鑒定要等到成熟期考種，費(fèi)時費(fèi)力且選擇效率低下(千粒重表型受環(huán)境影響較大)。通過檢測千粒重性狀主效基因位點(diǎn)，可以在苗期進(jìn)行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。本發(fā)明中千粒重主效基因位點(diǎn)位置明確，主效基因位點(diǎn)的檢測方法方便快速，不受環(huán)境影響。通過檢測與千粒重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，即可預(yù)測千粒重的多少，進(jìn)而準(zhǔn)確快速篩選大粒單株。


圖1為一種中雙11X73290組合F2和F23群體在武漢種植時的千粒重分布圖。
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結(jié)果表明千粒重表型呈正態(tài)分布，且變異范圍很寬，證明千粒重屬于數(shù)量性狀。圖2為一種油菜A9連鎖群示意圖。右半部分指示該連鎖群上的標(biāo)記名稱，左半部分指示每個標(biāo)記對應(yīng)的遺傳圖據(jù)。圖3為一種位于A9連鎖群上的千粒重主效基因位點(diǎn)LOD曲線示意圖。圖中橫坐標(biāo)代表連鎖群，縱坐標(biāo)代表LOD值。圖4為一種利用分子標(biāo)記BrSF7_181a對F3單株進(jìn)行基因型分析和篩選示意圖。圖中1-46為F3單株編號，最后兩個Pl和P2分別代表親本中雙11和73四0。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 油菜千粒重分離群體的構(gòu)建及性狀測定本實(shí)施例中使用油菜測序品種中雙11和另一個遺傳差異大的油菜品種73290雜交構(gòu)建F2和F2:3分離群體。兩親本和兩群體的千粒重表型在成熟期收獲后經(jīng)考種鑒定。 千粒重考種數(shù)據(jù)表明兩群體千粒重均呈正態(tài)分布，證明千粒重性狀的數(shù)量遺傳特征；兩群體的千粒重均呈超親分離，表明大?；蛟陔p親中都有分布(圖1)。實(shí)施例2 葉片總DNA的提取利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下(1)取0. 1克新鮮葉片放入研磨，加700微升提取液研磨，隨即轉(zhuǎn)入1. 5毫升離心管中置于65°C恒溫水浴60分鐘，其間混合2-3次；(2)加等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1, V/V/V)，輕輕顛倒使其充分混勻，在12000rpm離心10分鐘，輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5毫升離心管；加等體積的氯仿異戊醇04 1，V/V)重新抽提一次；(3)加入1毫升_20°C預(yù)冷無水乙醇，置于_20°C冷凍不超過30分鐘讓DNA析出； 12000rpm離心10分鐘讓DNA沉淀，倒掉離心管中乙醇溶液；用75% (V/V)乙醇清洗2_3次， 倒掉浸泡液，打開離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干；(4)加入 TEdOmM Tris, pH 8. 0 ； ImM EDTA，pH 8. 0)溶解 DNA ；用紫外分光光度計測定DNA的濃度，于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆?；?shí)施例3 引物的開發(fā)和合成申請人:利用的SSR引物包括兩類一類是已發(fā)表文章和蕓苔屬數(shù)據(jù)庫中公開的引物序歹0 (http://www. brassica. info/resource/markers/ssr-exchange. php)；另一類是申請人根據(jù)白菜和甘藍(lán)scaffold序列(自行測序所得)開發(fā)的，分別命名為BrSF和BoSF 系列，具體的開發(fā)方法是先利用MISA軟件(http://pgrc. ipk-gatersleben. de/misa)在每個 scaffold 搜索 SSR,然后用 Primer3. 0 軟件(http://www. genome, wi. mit. edu/cgi-bin/ primer/primer3-www. cgi)設(shè)計SSR引物。自主開發(fā)的SNP引物則是通過比對73四0的重測序序列和中雙11的參考基因組序列而來，首先，利用BWA軟件(http://bio-bwa. sourceforge.net/)把73四0的重測序序列定位到中雙11的全基因組參考序列上，然后利用 samtools 軟件(http://samtools.sourceforge.net/)查找 SNP。SNP 檢測采用的是SNAP (single nucleotide amplified polymorphism)方法，即在引物設(shè)計時在 SNP 位點(diǎn)處 引入ー個錯配，在一個親本中導(dǎo)致PCR擴(kuò)增的失敗。申請人已經(jīng)通過生物公司合成了公共 和新開發(fā)的SSR引物各6652對，SNP引物517對。實(shí)施例4 引物多態(tài)性的篩選，其流程如下(1)從親本中各隨機(jī)選擇10株DNA等量混合，作為篩選引物的模板。(2)利用溶解后的引物對親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)，其特征在于所述的主效基因位點(diǎn)為^zT1U禮
2.一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于所述的SSR 分子標(biāo)記 BrSF7-181a 緊密連鎖，其引物為 BrSF7 — 181F :TCGCGAGGAATAGAACGAAT，BrSF7 — 18IR GGAACCTTCTCGATGGTTTTT
3.權(quán)利要求2所述的一種油菜千粒重性狀主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在油菜育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜種子重量性狀主效基因位點(diǎn)及應(yīng)用，步驟包括1)利用油菜測序品種雜交，雜種F1自交構(gòu)建分離群體；2)利用公共和已開發(fā)的SSR和SNP引物對親本DNA進(jìn)行多態(tài)性篩選，通過對F2代分離群體進(jìn)行分子標(biāo)記基因型分析構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；3)通過對F2和F2:3分離群體進(jìn)行田間實(shí)驗和考種獲得種子重量的表型數(shù)據(jù)；4)結(jié)合分離群體的基因型和表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行QTL檢測。獲得了A9連鎖群上控制油菜千粒重的主效基因位點(diǎn)qTSW.A9和分子標(biāo)記BrSF7-181a。通過該標(biāo)記對兩親本衍生的F3代進(jìn)行基因型分析，保留攜帶有利標(biāo)記的單株，考種結(jié)果表明千粒重高于F2:3家系均值的F3單株比例高達(dá)89.5%，因此利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可大大提高高產(chǎn)育種的選擇效率。
文檔編號C12N15/11GK102286492SQ201110236050
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者劉貴華, 華瑋, 師家勤, 王新發(fā), 王漢中, 黃順謀 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所