專利名稱：金麗假交替單胞菌新菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)有益微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金麗假交替單胞菌新菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)作為當(dāng)代一個快速發(fā)展的產(chǎn)業(yè)，在帶來豐富水產(chǎn)食品的同時也創(chuàng)造了數(shù)萬億美元的經(jīng)濟價值。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)的數(shù)據(jù)報告顯示，2006年世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)總產(chǎn)量達到5163萬噸，占2006年世界漁業(yè)總產(chǎn)量的36%。自1970年以來，世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模以平均每年9. 2%的速度增長，而與之形成對比的是，捕撈業(yè)和陸地養(yǎng)殖業(yè)的年平均增長速度分別只有1. 4%和2. 8%。然而在迅速發(fā)展、創(chuàng)造巨大財富的同時，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也面臨著嚴峻的考驗，例如伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化生產(chǎn)、養(yǎng)殖動物產(chǎn)品的商業(yè)化以及行業(yè)內(nèi)部競爭日益激烈的趨勢，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害相繼發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物始終處于養(yǎng)殖環(huán)境中，對養(yǎng)殖水體的組成及環(huán)境相當(dāng)敏感，當(dāng)養(yǎng)殖水體中的病原菌數(shù)量達到一定程度時， 會導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的產(chǎn)生以及養(yǎng)殖環(huán)境的失衡。此外，由于養(yǎng)殖密度過高或者投餌不力而造成“宿主動物-致病菌-環(huán)境”的平衡被打破，最終引發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物一系列疾病的暴發(fā)。針對這一情況，各國養(yǎng)殖者普遍采用了施加抗生素的方法?？股仉m然在一定程度上可抑制或殺死病原菌，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生存率，但是卻會產(chǎn)生很多負面效應(yīng)，因而受到許多專家學(xué)者的質(zhì)疑，Schwarz等針對抗生素在動物中的過量使用和存在的潛在危險做出了具體的論述?？股剡@種化學(xué)治療方法的濫用會增加病原細菌的耐藥性，產(chǎn)生大量耐藥性菌株。20世紀(jì)90年代，許多亞洲國家水產(chǎn)品數(shù)量急劇下滑的主要原因之一就是抗生素的濫用，其中也包括我們國家。中國作為世界上水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最發(fā)達的國家之一，在控制水產(chǎn)養(yǎng)殖病害方面，卻走過不少彎路。由于抗生素的盲目使用及其它多種因素，對蝦病害日益嚴重，導(dǎo)致1993年暴發(fā)性蝦病的大流行，致使我國的對蝦產(chǎn)量減少了 70%，對蝦養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟損失。如今，抗生素對發(fā)光弧菌病(luminescent vibriosis)已沒有任何治療效果。另一方面，抗生素的濫用會破壞和干擾養(yǎng)殖環(huán)境中的正常微生物區(qū)系，導(dǎo)致微生態(tài)平衡失調(diào)。同時，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的濫用也給人類健康帶來了巨大威脅。養(yǎng)殖環(huán)境中已產(chǎn)生抗生素抗性的病原菌質(zhì)粒很有可能轉(zhuǎn)移到一些人類病原菌中，增加人類疾病治療的困難程度；人們不斷食用抗生素殘留的水產(chǎn)品，體內(nèi)抗生素的大量積累也會成為危害健康的一大殺手。因此，許多國家都對抗生素的使用實行了比較嚴格的控制。人們在質(zhì)疑或否定使用抗生素的同時，也在積極尋找更為安全有效的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治方法。有益菌(probiotics)由于其對病原菌良好的抑制能力而受到越來越多的關(guān)注。有益菌作為抗生素的替代品應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖體系中，使水環(huán)境條件得到修復(fù)，病原菌得到控制，養(yǎng)殖動物抗病力得到增強，已逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治的一種生物控制模式。利用自然環(huán)境中的有益菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境進行生物調(diào)節(jié)(microbial intervention),其抑菌范圍寬，針對多種病原菌引起的疾病都有很好的防治效果。當(dāng)前，許多國家已意識到水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用有益微生物和免疫制劑的經(jīng)濟價值及其潛在的社會效益，日益重視有益微生物的研究與開發(fā)，加大了這方面的科技投入。我國863科技攻關(guān)項目中就有針對這一方面的內(nèi)容。因此，有益菌的開發(fā)以及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已成為國內(nèi)外研究熱點，具有廣闊的發(fā)展空間。許多有益菌都能對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原微生物產(chǎn)生拮抗作用，抑制病原菌的生長， 從而達到“以菌治菌”的效果。最初用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的有益菌制劑來自為陸地動物設(shè)計的商品制劑，其中以陸生芽孢桿菌(Bacillus)和乳酸桿菌(Lactobacillus)等的使用最為廣泛。這些制劑在一定程度上能夠抑制病原菌的生長，并促進動物生長。但考慮到水生動物與陸生動物的生存環(huán)境、生長發(fā)育過程和腸道細菌區(qū)系組成存在差異，來自非養(yǎng)殖水體的有益菌制劑可能會對養(yǎng)殖動物造成傷害，或者不能盡快成為優(yōu)勢菌而失去微生態(tài)調(diào)節(jié)的功效。因此，從養(yǎng)殖水體環(huán)境以及養(yǎng)殖動物體表或體內(nèi)分離土著菌來作為潛在有益菌成為國內(nèi)外的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種金麗假交替單胞菌新菌株及其應(yīng)用，即一種能抑制水產(chǎn)病害微生物的有益菌，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的金麗假交替單胞菌(Pseudoalteromonas f lavipulchra)的JGl菌株，已于2011年6月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏號為CGMCC NO. 5009。金麗假交替單胞菌JGl菌株的培養(yǎng)溫度范圍為8°C 37°C，最佳培養(yǎng)溫度為生長的PH值范圍為5. O 12. 0，最適pH值為7. 5 8. 0，使用的培養(yǎng)基為2216E。本發(fā)明的菌株可用來制成用于抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的生長或增強水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫力的菌制劑。上述的菌制劑中包含有金麗假交替單胞菌JGl菌株的活菌。上述的菌制劑為飼料添加劑。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)自JGl菌株的Pfa蛋白，其特征在于1)所述蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ；2)將1)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有1)中蛋白效果，由1)所衍生的蛋白。本發(fā)明還提供一種核苷酸，包括有1)所述的核苷酸，用于編碼氨基酸序列為SEQ ID NO 1的蛋白質(zhì)；2)所述的核苷酸，用于編碼1)中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有1)中蛋白質(zhì)效果的，由1)所衍生的蛋白質(zhì)。上述的核苷酸的序列為SEQ ID NO :2。所述的Pfa抑菌蛋白用作水產(chǎn)飼料添加劑。本發(fā)明的金麗假交替單胞菌JGl菌株，可通過細菌素蛋白、小分子化合物等多種方式達到抑菌效果，能夠抑制多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見病原菌；對斑馬魚、蝦蛄、扇貝、蛤蜊等動物試驗的結(jié)果表明JGl對動物本身沒有毒副作用，其制備的菌制劑能有效的作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的增效劑在實際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。所代謝生產(chǎn)的Pfa蛋白具有明顯的抑菌效果，可用作提高水產(chǎn)動物的免疫制劑。


圖1 本發(fā)明的抑菌蛋白Pfa的篩選電泳圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的菌株進行詳細的描述。一、金麗假交替單胞菌JGl菌株的篩選2006年4月發(fā)明人將取自膠南卓越養(yǎng)殖廠的健康大菱鲆養(yǎng)殖海水的水樣涂布于海洋細菌培養(yǎng)基2216E平板上，培養(yǎng)7d之后觀察發(fā)現(xiàn)黃色單菌落周圍14mm范圍內(nèi)無其他菌株生長，形成明顯的抑菌圈.隨即挑取該單菌落進行繼代培養(yǎng)，直至得到純化菌株， 命名代號為JGl。通過觀察細胞形態(tài)、運動性，進行革蘭氏染色、氧化酶等試驗以及使用API20E試劑條對細菌進行生理生化鑒定。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)，對菌株JGl進行鑒定，并結(jié)合細菌16S rDNA序列確定本發(fā)明篩選的菌株為JGl鑒定為金麗假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas flavipulchra)0二、金麗假交替單胞菌JGl菌株的形態(tài)、理化參數(shù)1、金麗假交替單胞菌JGl菌株的形態(tài)特征菌株JGl在2216E平板上培養(yǎng)M小時的單菌落為圓形、全緣、濕潤、半透明、易挑取，直徑1 2mm，產(chǎn)生橙黃色色素。于4°C放置IOd左右，菌落邊緣開始模糊，發(fā)生泳動現(xiàn)象。2、培養(yǎng)條件本發(fā)明篩選的金麗假交替單胞菌JGl菌株的生長溫度范圍為8°C 37°C，在下菌株能在最短時間內(nèi)達到平臺期JGl菌株的生長pH值范圍為5. O 12. 0，最適pH值為 7. 5 8. 0。培養(yǎng)基可以選用2216E液體或固體培養(yǎng)基，也可以用其它的海洋細菌培養(yǎng)基。3、生化反應(yīng)參數(shù)菌株JGl的生理生化特征如下表，其與殺魚假交替單胞菌的比較也列在下表
權(quán)利要求
1.金麗假交替單胞菌I^seudoalteromonasf Iavipulchra的JGl菌株，其保藏編號為 CGMCC NO. 5009。
2.如權(quán)利要求1所述的JGl菌株，其培養(yǎng)溫度范圍為8°C 37°C。
3.如權(quán)利要求2所述的JGl菌株，其培養(yǎng)溫度為^°C。
4.權(quán)利要求1所述的JGl菌株用于制備抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌生長或增強水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫力的菌制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的菌制劑，其特征在于所述的菌制劑中包含有金麗假交替單胞菌 JGl菌株的活菌。
6.如權(quán)利要求5所述的菌制劑，其特征在于所述菌制劑為飼料添加劑。
7.權(quán)利要求1所述的JGl菌株生產(chǎn)的Pfa蛋白，其特征在于1)所述蛋白的氨基酸序列為SEQID NO 1 ；2)將1)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有1)中蛋白效果，由1)所衍生的蛋白。
8.編碼權(quán)利要求7所述的Pfa蛋白的核苷酸，其特征在于1)所述的核苷酸用于編碼氨基酸序列為SEQID NO 1的蛋白質(zhì)；2)所述的核苷酸，用于編碼1)中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有1) 中蛋白質(zhì)效果的，由1)所衍生的蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQIDNO :2。
10.如權(quán)利要求7所述的Pfa蛋白在制備水產(chǎn)飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金麗假交替單胞菌新菌株及其應(yīng)用，其中金麗假交替單胞菌JG1菌株，其保藏編號為CGMCC NO.5009；JG1菌株代謝生產(chǎn)出Pfa蛋白。本發(fā)明的金麗假交替單胞菌JG1菌株，可通過細菌素蛋白、小分子化合物等多種方式達到抑菌效果，能夠抑制多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見病原菌；對斑馬魚、蝦蛄、扇貝、蛤蜊等動物試驗的結(jié)果表明JG1對動物本身沒有毒副作用，其制備的菌制劑能有效的作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的增效劑在實際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。所代謝生產(chǎn)的Pfa蛋白具有明顯的抑菌效果，可用作提高水產(chǎn)動物的免疫制劑。
文檔編號C12R1/01GK102304484SQ20111023336
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者于敏, 史曉翀, 張曉華, 湯開浩, 金光 申請人:中國海洋大學(xué)