嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法，具體地公開(kāi)了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變?yōu)門yr。本發(fā)明還公開(kāi)了該酶的制備方法，本發(fā)明的制備嘌呤核苷磷酸化酶具有產(chǎn)量高且熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼該嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嘌呤核苷憐酸化酶(purine nucleoside phosphorylase),簡(jiǎn)稱PNP,是嘌呤補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶之一，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、寄生蟲(chóng)和微生物中。按照嘌呤核苷磷酸化酶的蛋白結(jié)構(gòu)可分為兩類:低分子量的同源三聚體類和高分子量的同源六聚體類。其中哺乳動(dòng)物和部分微生物(例如鼠傷寒沙門氏菌salmonella typhimurium,嗜熱古菌芝田硫化葉菌Sulfolobus solfataricus等)的嘌呤核苷磷酸化酶屬于同源三聚體類,其分子量約為80~IOOkDa,每個(gè)亞基的分子量為30~32kDa，通常此類嘌呤核苷磷酸化酶只能以鳥(niǎo)嘌呤核苷和肌苷作為底物。而同源六聚體類的嘌呤核苷磷酸化酶，底物專一性不強(qiáng)，既可接受鳥(niǎo)嘌呤核苷和肌苷作為底物，也可以腺嘌呤核苷作為底物。其分子量約為150kDa，亞基分子量為25kDa左右。
[0003]由于PNP特殊的生物活性，使得其在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了較大的應(yīng)用:①應(yīng)用于核苷類藥物的合成，大量研究表明，核苷類(核苷及其類似物)具有廣泛的抗腫瘤抗病毒的效果。②應(yīng)用于腫瘤靶向治療；③應(yīng)用于無(wú)機(jī)磷和ATPase酶活力等的定量測(cè)定。
[0004]鑒于PNP的廣泛應(yīng)用前景，近年來(lái)，關(guān)于PNP的基因工程研究越來(lái)越多，但多以大腸桿菌PNP和嗜熱菌PNP為主。而本發(fā)明選取克隆假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的PNP，簡(jiǎn)稱為PiPNP，其相對(duì)于其他菌屬的PNP有著一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)，即該酶在低溫(小于400C )下的即有較高的催化效率，研究發(fā)現(xiàn)，在體外，催化低濃度或高濃度的肌苷反應(yīng)時(shí)，PiPNP的最適溫度為30— 35°C或50— 60°C，明顯低于其他菌屬的PNP (例如大腸桿菌PNP催化低濃度或高濃度的肌苷反應(yīng)最適溫度分別為50°C或60-70°C)，這就使得在常規(guī)反應(yīng)溫度下(37°C )，PiPNP使用較少的量就可獲得較高的催化效率。但PiPNP相較于其他菌屬的PNP也存在其缺陷——溫度穩(wěn)定性較低，將PiPNP保溫30min，在37-42°C時(shí)酶活發(fā)生急劇變化，50°C完全失活，EcPNP在50-55°C發(fā)生急劇變化，65°C時(shí)完全喪失失活。
[0005]另外，據(jù)已報(bào)道的各方面研究，重組菌發(fā)酵生產(chǎn)的PNP產(chǎn)量仍較低，多為100~200U/ml，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)而言，仍不能達(dá)到很好的效果，產(chǎn)量有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)過(guò)分子改造并具有較高熱穩(wěn)定性的嘌呤核苷磷酸化酶，以及高產(chǎn)量的制備該嘌呤核苷磷酸化酶的方法。
[0007]本發(fā)明第一方面提供了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變?yōu)門yr0
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一種或多種特性:
[0009](a)比酶活≥30U/mg,較佳地為≥45U/mg ；[0010](b)儲(chǔ)存在堿性環(huán)境中；
[0011](C)失活溫度<60°C ;
[0012](d)在O — 55°C，保存時(shí)間汕。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的最適PH值為7.0-9.0，較佳地為7.5-8.5，更佳地為8.0。
[0014]在另一優(yōu)選例中，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本發(fā)明第二方面提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼第一方面所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一個(gè)或多個(gè)密碼子被替換為大腸桿菌相對(duì)應(yīng)的偏愛(ài)密碼子。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一個(gè)或多個(gè)密碼子被替換為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG 和 CTG。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0019]本發(fā)明第三方面提供了一種載體，所述載體含有第二方面所述的多核苷酸。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述載體為表達(dá)載體,更佳地為適合在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體。
[0021]本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包含第三方面所述的載體或基因組中整合有第二方面所述的多核苷酸。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明第五方面提供一種第一方面所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，包括以下步驟:
[0025](a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶；
[0026](b)分離所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0028]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)之前，所述方法還包括以下步驟:
[0029](I)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0030](2)將所述多核苷酸序列中對(duì)應(yīng)于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變?yōu)榫幋aTyr的密碼子，并且任選地，將所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一個(gè)或多個(gè)密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為大腸桿菌相對(duì)應(yīng)的偏愛(ài)密碼子，從而制得編碼第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0031](3)將上一步驟制得的所述多核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而制得第四方面所述的宿主細(xì)胞。
[0032]在另一優(yōu)選例中，步驟(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述野生型或野生型的酶是來(lái)自假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷憐酸化酶。
[0034]在另一優(yōu)選例中，將第97位Asp的密碼子GAC突變?yōu)榫幋aTyr的密碼子TAT。
[0035]在另一優(yōu)選例中，將所述密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為CGA、CTG、CTG, ATC, CTG 和 CTG。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述方法獲得的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的表達(dá)活性> 300U/ml，較佳地為 350 - 450U/ml。
[0037]本發(fā)明第六方面提供了一種改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，所述方法包括步驟:
[0038](I)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0039](2)將所述多核苷酸序列中對(duì)應(yīng)于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變?yōu)榫幋aTyr的密碼子，從而制得編碼突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0040](3)表達(dá)上一步驟制得的所述多核苷酸序列，從而制得突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述方法用于提高嘌呤核苷磷酸化酶的穩(wěn)定性。
[0042]在另一優(yōu)選例中，步驟(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0043]本發(fā)明第七方面提供了一種第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷進(jìn)行磷酸解反應(yīng)；或用作對(duì)肌苷進(jìn)行磷酸解反應(yīng)的催化劑。
[0044]本發(fā)明第八方面提供了一種催化反應(yīng)，包括步驟:在第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶或第四方面所述的宿主細(xì)胞存在下，對(duì)肌苷進(jìn)行酶催化反應(yīng)(磷酸解反應(yīng))，生成次黃嘌呤。
[0045]本發(fā)明第九方面提供了一種酶制劑，所述的酶制劑含有第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0046]在另一優(yōu)選例中,所述的酶制劑為固定化酶。
[0047]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]圖1 為 PNP (O) -pET-28a (+)的質(zhì)粒圖譜。
[0049]圖2A為PCR擴(kuò)增的目的條帶電泳圖。
[0050]圖2B為PNP(0)-pET_28a(+)篩選陽(yáng)性克隆電泳圖
[0051]圖3為pMD19-T載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0052]圖4為密碼子優(yōu)化的工程菌PNP (O) -pET-28a (+) -BL21與未優(yōu)化的工程菌PNP-pET-28a (+) -BL21 發(fā)酵液 SDS-PAGE 圖。
[0053]圖5為密碼子優(yōu)化的工程菌PNP (O) -pET-28a (+) -BL21與未優(yōu)化的工程菌PNP-pET-28a (+) -BL21的分泌表達(dá)產(chǎn)量對(duì)比數(shù)據(jù)圖。
[0054]圖6為將Ile87的密碼子改為ATT與改為ATC的工程菌之間表達(dá)活性的對(duì)比數(shù)據(jù)圖。
[0055]圖7為PiPNP與rPiPNP的酶保留活力隨溫度變化圖。
[0056]圖8為PiPNP與rPiPNP的酶保留活力隨時(shí)間變化圖。【具體實(shí)施方式】
[0057]發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將來(lái)自假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷磷酸化酶PNP基因序列中編碼Asp97的密碼子GAC改為編碼Tyr的密碼子TAT，所制得的突變酶具有明顯提高的熱穩(wěn)定性。此外，通過(guò)將PNP基因序列中分別編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA改為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG后，經(jīng)過(guò)基因工程制備方法可進(jìn)一步顯著提高PNP的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0058]如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
[0059]本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0060]本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼本發(fā)明酶的功能。
[0061]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”指的是在與模板配對(duì)，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一條鏈充分互補(bǔ)才能開(kāi)始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個(gè)3’端與模板互補(bǔ)的引物的5’端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補(bǔ)。只要有足夠長(zhǎng)的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。
[0062]本發(fā)明的酶的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0063]一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0064]此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0065]應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段 。
[0066]本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述酶的方法。
[0067]通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟:
[0068](1).用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0069](2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
[0070](3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化嘌呤核苷磷酸化酶。
[0071]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明酶的編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0072]此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0073]包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0074]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如畢赤酵母、釀酒酵母細(xì)胞；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CH0、NS0,C0S7、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。相應(yīng)地，也可以將來(lái)源于假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列中分別編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子替換為上述宿主細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子。
[0075]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0076]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質(zhì)。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0077]在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0078]本發(fā)明包括以下主要優(yōu)點(diǎn):
[0079](I)本發(fā)明的嘌呤核苷磷酸化酶具有較高熱穩(wěn)定性，酶失活溫度可提高至60°C以上，并且在O — 55°C，酶的保存時(shí)間延長(zhǎng)至3h以上。[0080](2)本發(fā)明的嘌呤核苷磷酸化酶熱穩(wěn)定性提高的同時(shí)，還保持較高的酶活性。
[0081](3)本發(fā)明的制備方法極大地提高了嘌呤核苷磷酸化酶的產(chǎn)量，產(chǎn)品的表達(dá)活性可以達(dá)到或超過(guò)400U/mL，這是目前的基因工程制備方法所無(wú)法企及的。從而有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0082]本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何被提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0083]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0084]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0085]本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)材料的來(lái)源如下所示:
[0086]pET_28a (+)購(gòu)于 Novagen 公司
[0087]pMD19_T Simple Vector 購(gòu)于 TaKaRa 公司
[0088]Solution I 購(gòu)于 TaKaRa 公司
[0089]T4DNA連接酶購(gòu)于TaKaRa公司
[0090]10*T4DNA連接酶緩沖液購(gòu)于TaKaRa公司
[0091]胰蛋白胨購(gòu)于上海源聚生物科技有限公司
[0092]酵母粉購(gòu)于安琪酵母股份有限公司
[0093]NaCl購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0094]實(shí)施例1假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)PNP基因序列的優(yōu)化及克隆載體的構(gòu)建
[0095]①基因序列的優(yōu)化
[0096]基因序列的優(yōu)化是將Pseudoalteromonas sp.1590的PNP基因序列(GEN BANKEF222283，SEQ ID N0.3)進(jìn)行了部分分子改造，分為兩項(xiàng):一是將整條序列中的編碼氨基酸的 Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34、Leul45 的密碼子 AGG、CTA、CTA、ATA、CTA、CTA 改為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG、CTG ;二是將97位Asp改造為Tyr，密碼子由GAC改為TAT。優(yōu)化后的基因序列進(jìn)行全基因合成。
[0097] 全基因合成:
[0098]委托上海生工合成。首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得Pseudoalteromonas sp.1590的野生型的PNP基因序列，并第97位氨基酸殘基的密碼子從Asp97改為Tyr。此外，本發(fā)明人為了在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，對(duì)基因序列進(jìn)行了優(yōu)化，其中主要對(duì)六處密碼子替換為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子(即將Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA中的六個(gè)密碼子被替換為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG)。所述序列的全合成采用人工合成法進(jìn)行合成。
[0099]人工合成是將所要合成的寡聚核苷酸鏈的3’ -末端先以3’ -OH與一個(gè)不溶性載體連接，然后依次從3’-5’的方向?qū)⒑塑账釂误w加上去，所使用的核苷酸單體的活性官能團(tuán)都是經(jīng)過(guò)保護(hù)的，在添加到核苷酸鏈上時(shí)，去除3’端的保護(hù)，而后再釋放5’端用以連接下一個(gè)核苷酸單體。
[0100]②引物的設(shè)計(jì)
[0101]根據(jù)上述優(yōu)化后的基因序列和pET_28a ( + )(購(gòu)于Novagen公司)的酶切位點(diǎn),利用Primerf.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì):
[0102]上游引物(引物I) 5，-ctagctagcatgcgaactccgcatatcaatg-3’ (SEQ ID N0.4)
[0103]下游引物(引物2)5，_ccgctcgagttagatagactctaatgcaattttaac_3 (SEQ ID N0.5)
[0104]③基因的擴(kuò)增
[0105]以化學(xué)合成的全基因產(chǎn)物為模板，在DNA Taq酶的催化下進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件分別如表1和表2所示:
[0106]表1反應(yīng)體系
[0107]
【權(quán)利要求】
1.一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變?yōu)門yr。
2.如權(quán)利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一種或多種特性: (a)比酶活≥30U/mg，較佳地為≥45U/mg； (b)儲(chǔ)存在堿性環(huán)境中； (c)失活溫度≥600C ； (d)在O— 55°C，保存時(shí)間≥3h。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求4所述的載體或基因組中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
7.—種權(quán)利要求1所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出權(quán)利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶； (b)分離所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟(a)之前，所述方法還包括以下步驟: (1)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (2)將所述多核苷酸序列中對(duì)應(yīng)于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變?yōu)榫幋aTyr的密碼子，并且任選地，將所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一個(gè)或多個(gè)密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為大腸桿菌相對(duì)應(yīng)的偏愛(ài)密碼子，從而制得編碼權(quán)利要求I所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (3)將上一步驟制得的所述多核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而制得權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞。
9.一種改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (2)將所述多核苷酸序列中對(duì)應(yīng)于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變?yōu)榫幋aTyr的密碼子，從而制得編碼突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (3)表達(dá)上一步驟制得的所述多核苷酸序列，從而制得突變的嘌呤核苷磷酸化酶。
10.一種權(quán)利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷進(jìn)行磷酸解反應(yīng)；或用作對(duì)肌苷進(jìn)行磷酸解反應(yīng)的催化劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103468656SQ201310451323
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】李子樵, 沈露 申請(qǐng)人:上海藍(lán)怡科技有限公司