二次脫鈣制備幾丁聚糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二次脫鈣制備幾丁聚糖的方法法,包括如下步驟:將蟹殼或蝦殼干燥、粉碎;二次脫鈣和脫蛋白;酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。本發(fā)明的酶解工藝與現(xiàn)有技術(shù)制相比,二次脫鈣與脫蛋白,并且第二次脫鈣與脫蛋白在在同一步驟中實(shí)現(xiàn),大大提高生產(chǎn)效率,獲得高純度的幾丁聚糖,減少強(qiáng)酸和強(qiáng)堿用量,耗能低,無污染,更加環(huán)保。同時,脫鈣產(chǎn)物可以回收制成補(bǔ)鈣制劑,可以獲取更高的經(jīng)濟(jì)價值。
【專利說明】二次脫鈣制備幾丁聚糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及幾丁聚糖制備方法,屬于制造領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]甲殼素是一種天然含氮多糖物質(zhì),廣泛存在與無脊椎動物的外殼或角質(zhì)層中,尤其是蝦蟹類的外殼中。甲殼素很容易獲得,可再生,是僅次于纖維素的天然均聚物,但是因分子內(nèi)部有很強(qiáng)的氫鍵作用,溶解性低,應(yīng)用范圍受到限制。
[0003]甲殼素脫乙酰后生成殼聚糖。目前殼聚糖的制備多采用化學(xué)法和酶解法脫乙酰?;瘜W(xué)法脫乙酰反應(yīng)中,影響脫乙酰的因素很多,但是主要影響因素包括:堿液濃度、反應(yīng)溫度和時間。一般來說,提高反應(yīng)溫度和延長反應(yīng)時間均可提高脫乙酰度,但是會導(dǎo)致甲殼素主鏈降解增加,從而影響產(chǎn)品的粘度和分子量。通入氮?dú)饪梢栽谝欢ǔ潭壬蠝p緩主鏈的降解。由于化學(xué)法使用的堿液濃度高,反應(yīng)時間長,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定,環(huán)境污染嚴(yán)重。
[0004]酶解法不會降解主鏈,并且無污染,具有重要的研究開發(fā)價值。影響酶解的因素很多,主要包括PH值和溫度。文獻(xiàn)記載最適宜PH值4-8,最適宜溫度30-70°C (《甲殼酶特性與應(yīng)用研究》萬云洋等《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2003 vol 15 N0.6)。迄今為止發(fā)現(xiàn)的真菌甲殼質(zhì)脫乙酰酶(CDA)都是糖蛋白,且有良好的熱穩(wěn)定性。但是不同來源CDA的存在位置、最適宜PH值(PH4.5-12)、碳水化合物含量、相對分子質(zhì)量及離子影響等有較大的差異。
[0005]迄今報道的CDA基本都來源于真菌。真菌來源的CDA主要作用是自身細(xì)胞壁的合成,最適底物一般為甲殼寡糖,對甲殼質(zhì)的活性較低,不適合用酶法脫乙酰生產(chǎn)殼聚糖。真菌來源的CDA來源廣泛,獲取容易,成本相對較低。因此如何能夠?qū)⒄婢鷣碓吹腃DA用于制備殼聚糖成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種新的幾丁聚糖制備方法,所述的方法能夠較現(xiàn)有技術(shù)更節(jié)能環(huán)保。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種用真菌來源的CDA制備幾丁聚糖的方法,所述的方法能夠解決現(xiàn)有技術(shù)CDA不適于生產(chǎn)幾丁聚糖的技術(shù)難題。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種安全的幾丁聚糖制備方法,所述的方法制得的幾丁聚糖無強(qiáng)酸或強(qiáng)堿殘留,產(chǎn)品更安全。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種具有市場競爭力的幾丁聚糖,所述的產(chǎn)品不因工藝的改進(jìn)而增加生產(chǎn)成本。
[0010]為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
干燥粉碎、檸檬酸酸脫鈣;氫氧化鈉脫蛋白;酶解脫鈣和蛋白;酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。
[0011]本發(fā)明采用制備方法對脫鈣前的蟹殼或蝦殼進(jìn)行預(yù)處理,然后再進(jìn)行脫鈣和脫蛋白。
[0012]為增強(qiáng)脫鈣和脫蛋白效果,本發(fā)明優(yōu)選的將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0mm顆粒,顆粒過小則增加生產(chǎn)成本,顆粒過大效果較差。發(fā)明人經(jīng)過多次試驗及經(jīng)驗,最終確定0.5~1.0mm顆粒范圍達(dá)到脫鈣和成本的最佳性價比。
[0013]本發(fā)明粉碎后的原料加入4-8倍重量體積比的水制成料液,再加入10~15%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入8~15%氫氧化鈉溶液,SO-1OO0C,l-3h,水洗至中性,過濾,留取殘渣。
[0014]本發(fā)明的酶解采用菠蘿蛋白酶較其他蛋白酶具有更好的酶解效果。當(dāng)然,選用其他蛋白酶進(jìn)行酶解也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明工藝中最佳酶解方案是將第一次脫蛋白后的殘渣中加入4-8倍重量體積比的水,再加入菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至5.5~
6.5,40~60°C攪拌I~2h ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0015]酶解殼料所用的蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05~0.2%為佳。
[0016]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣即為甲殼質(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) I~4:2~5,0.2MPa, 30 ~32°C ,48 ~72h,然后 120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0017]所述的可以從公開市場上購得,也可以通過構(gòu)巢曲霉菌發(fā)酵后制得。
[0018]所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法如下:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,30~35°C,PH6.0~7.0,72~96h。
[0019]經(jīng)過二次脫鈣和脫蛋白后,去除了原料中的鈣離子、蛋白質(zhì)其它有機(jī)物質(zhì)。
[0020]本發(fā)明所述的幾丁聚糖脫乙酰度高達(dá)98%以上。
[0021]將檸檬酸脫鈣后的濾液和酶解后的濾液混合,干燥后可獲得鈣、膠原和微量元素等混合的補(bǔ)鈣制劑。
[0022]本發(fā)明的產(chǎn)物與任何一種或一種以上藥劑學(xué)上輔料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各種劑型,例如,可制成片齊?、緩釋片、滴丸、顆粒齊?、膠囊齊?、微粒劑。優(yōu)選劑型為膠囊劑或顆粒劑。
[0023]本發(fā)明的酶解工藝與現(xiàn)有技術(shù)制相比,二次脫鈣與脫蛋白,并且第二次脫鈣與脫蛋白在同一步實(shí)現(xiàn),大大提高了生產(chǎn)效率,獲得高純度的幾丁聚糖,減少強(qiáng)酸和強(qiáng)堿用量,耗能低,無污染,更加環(huán)保。同時,脫鈣產(chǎn)物可回收制成補(bǔ)鈣制劑,以獲取更高的經(jīng)濟(jì)價值。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1
制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ; (2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,34°C,PH6.l,72h。
[0025]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.5mm顆粒,加入4倍重量體積比的水制成料液,料液中加入10%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入8%氫氧化鈉溶液,80°C,Ih,過濾水洗至中性。
[0026]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入4倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?.05%菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至5.5,40°C攪拌Ih ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0027]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:3,0.2MPa,30°C,72h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0028]實(shí)施例2 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵:接種構(gòu)巢曲霉菌,35°C,PH6.0,發(fā)酵72h。
[0029]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至1.0mm顆粒,加入8倍重量體積比的水制成料液,料液中加入15%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入15%氫氧化鈉溶液,100°C,3h,過濾水洗至中性。
[0030]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入8倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?.2%菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至6.5,60°C攪拌2h ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0031]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:3,0.2MPa,32°C,48~72h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0032]實(shí)施例3 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,32°C,PH6.0,80h。
[0033]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.5mm顆粒,加入8倍重量體積比的水制成料液,料液中加入12%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入12%氫氧化鈉溶液,90°C,2h,過濾水洗至中性。
[0034]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入8倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?.1%菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至6,50°C攪拌1.5h ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0035]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比2:1,0.2MPa,32 V,56h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0036]實(shí)施例4 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,35°C,PH6.0,96h。
[0037]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至1.0mm顆粒,加入4倍重量體積比的水制成料液,料液中加入10%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入15%氫氧化鈉溶液,100°C,lh,過濾水洗至中性。
[0038]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入4倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?.15%菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至5.5,60°C攪拌Ih ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0039]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:2,0.2MPa,30°C,48h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0040]實(shí)施例5 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,33°C,PH6.5,96h。
[0041]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.8mm顆粒,加入6倍重量體積比的水制成料液,料液中加入15%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入8%氫氧化鈉溶液,80-0C,2h,過濾水洗至中性。
[0042]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入7倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?.08%菠蘿蛋白酶 ,加檸檬酸調(diào)PH值至6.5,55°C攪拌2h ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0043]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:5,0.2MPa,31.5°C,64h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0044]實(shí)施例6
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,30°C,PH7.0,72h。
[0045]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.6mm顆粒,加入5倍重量體積比的水制成料液,料液中加入11%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入10%氫氧化鈉溶液,100°C,lh,過濾水洗至中性。
[0046]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入6倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?.12%菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至6.5,60°C攪拌2h;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0047]酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比4: 5,0.2MPa,31°C,72h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
[0048]實(shí)施例7 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml,水 1000ml ;
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,32°C,PH6.6,72h。
[0049]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.7mm顆粒,加入7倍重量體積比的水制成料液,料液中加入15%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性,留取殘渣。殘渣中加入8%氫氧化鈉溶液,100°C,lh,過濾水洗至中性。
[0050]將第一次脫蛋白后的殘渣中加入8倍重量體積比的水,再加入占?xì)ち现亓勘葹?br>
0.08%菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至6.5,45°C攪拌1.5h ;分離液體,殘渣再次重復(fù)提取。
[0051] 酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,殘渣加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1: 5,0.2MPa,32°C , 72h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
【權(quán)利要求】
1.一種二次脫鈣制備幾丁聚糖的方法,包括如下步驟: (1)將蟹殼或蝦殼干燥粉碎; (2)第一次脫鈣和脫蛋白; (3)第二次脫鈣和脫蛋白; (4)酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0mm大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法,其特征在于,所述的第一次脫鈣是將蟹殼或蝦殼粉碎后的原料中加入4-8倍重量體積比的水制成料液,再加入10~15%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,留取殘渣。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述的第一次脫蛋白是將第一次脫鈣后的殘渣加入4-8倍重量體積比的水,加入8~15%氫氧化鈉溶液,80-100°C,l_3h,水洗至中性,過濾,留取殘渣。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法,其特征在于,所述的第二次脫鈣和脫蛋白是將第一次脫蛋白后的殘渣中加入4-8倍重量體積比的水,再加入菠蘿蛋白酶,加檸檬酸調(diào)PH值至5.5~6.5,40~60°C攪拌I~2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,酶解殼料所用的蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05~0.2%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述的脫乙酰是酶解脫鈣和脫蛋白后,過濾,棄濾液,留取殘渣,加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰,甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比I~4:2~5,0.2MPa, 30~32°C ,48~72h,然后120°C,20min,干燥即得幾丁聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其特征在于,所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法如下: (1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg,殼聚糖15g,葡萄糖30g,磷酸二氫鉀2g,無水硫酸鎂Ig, 0.01mol/l 二氯化鈷 10ml,水 100ml ; (2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌,接入構(gòu)巢曲霉菌,30~35°C,PH6.0~7.0,72~96h。
【文檔編號】C12P19/26GK104046669SQ201310450776
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】苗勝昆, 李雨田, 許卉婷, 楊國元, 白潔, 李瑩, 楊玉, 胡巧鳳 申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司