假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑及凍干方法
【專利摘要】一種假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑及凍干方法，涉及海洋細(xì)菌的冷凍真空干燥保護(hù)方法領(lǐng)域。凍干保護(hù)劑為液體，其組成成份為：脫脂乳粉、乳糖、蔗糖、維生素C、明膠、NaCl和水。將假交替單胞菌屬細(xì)菌活菌懸液與凍干保護(hù)劑按體積比1:4～1:1的比例充分混合均勻，分裝后先置于-80℃條件下快速冷凍3～4小時(shí)，再放入真空冷凍干燥機(jī)在真空度0.1mbar，凍干艙-54℃條件下凍干20小時(shí)后，向凍干艙內(nèi)充入高純度干燥氮?dú)庵翗?biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封。本發(fā)明凍干后的假交替單胞菌屬細(xì)菌平均存活率超過30％，可置于常溫下長期保存。
【專利說明】假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑及凍干方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)菌冷凍真空干燥保存【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種適用于假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑及凍干方法。
【背景技術(shù)】
[0002]假交替單胞菌(Pseudoalteromonas spp.)是海洋環(huán)境中非常常見的一類細(xì)菌,廣泛分布于海水環(huán)境、底質(zhì)以及海洋生物的體內(nèi)或體表(Torben L.Skovhus, et al.2004)。假交替單胞菌對(duì)營養(yǎng)要求低，多數(shù)情況下能在營養(yǎng)相對(duì)貧瘠的海洋環(huán)境中長時(shí)間生存。但它同時(shí)也是一種條件致病菌，特別是在高密度養(yǎng)殖的情況下，假交替單胞菌的大量繁殖往往會(huì)感染海水養(yǎng)殖動(dòng)、植物并引起發(fā)病，造成疾病的快速傳播和流行，使海水養(yǎng)殖產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(E.J.Nelson, et al.2002, Mahbub Iqball, et al.1998,聞詠等 2002)。
[0003]由于假交替單胞菌可以引起多種海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)、植物發(fā)病，在一定程度上已經(jīng)對(duì)我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成威脅。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所對(duì)假交替單胞菌進(jìn)行了系統(tǒng)的流行病學(xué)和病原學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬細(xì)菌是養(yǎng)殖刺參保苗期重大疾病“腐皮綜合征”的最主要致病原(中國水產(chǎn)科學(xué)，2006年13卷第4期)，并深入進(jìn)行假交替單胞菌在刺參養(yǎng)殖系統(tǒng)的感染來源分析和快速檢測技術(shù)研究(海洋科學(xué)，2007年31卷第8期)。同時(shí)，針對(duì)從患病刺參分離的假交替單胞菌開展了防治中草藥藥物的篩選研究(國家發(fā)明專利ZL200910017176.7)。這些研究主要集中于假交替單胞菌引起養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的流行病學(xué)、病原學(xué)和防治技術(shù)等方面，并未涉及到假交替單胞菌菌株的長期保存技術(shù)研究。
[0004]為了持續(xù)進(jìn)行假交替單胞菌的生物學(xué)、病原學(xué)和致病機(jī)理等方面的研究，對(duì)有致病力的假交替單胞菌菌株進(jìn)行長期保存是非常有必要的。真空冷凍干燥技術(shù)作為長期保藏微生物菌株并保存其活力最有效的方法之一，在微生物保藏方面得到了廣泛的應(yīng)用。然而，由于各類微生物菌株的生境條件、營養(yǎng)需求、培養(yǎng)方法等存在較大差異，造成了不同微生物菌株的凍干保護(hù)劑和凍干方法也不盡相同。在本發(fā)明做出之前，涉及海洋細(xì)菌的凍干保護(hù)劑和凍干方法更是鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑和凍干方法，用于冷凍真空干燥保存，能夠?qū)崿F(xiàn)假交替單胞菌在常溫下的長期保藏并保存活力，為深入開展假交替單胞菌屬菌株的相關(guān)研究提供技術(shù)支撐。
[0006]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0007]—種假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑，它的成分為脫脂乳粉、乳糖、蔗糖、維生素C、明膠、NaCl和無菌蒸懼水
[0008]進(jìn)一步，所述的一種假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑，其各成份的終濃度為:脫脂乳粉50-150g/L,乳糖50-150g/L,蔗糖50-150g/L,維生素C5-20g/L,明膠5-15g/L, NaC115g/L,溶劑為無菌蒸懼水。
[0009]該凍干保護(hù)劑的配置方法為:將脫脂乳粉、乳糖、蔗糖和明膠溶于無菌NaCl溶液中，在106°C條件下濕熱滅菌30min，自然冷卻后配制成溶液A。將維生素C溶于無菌NaCl溶液中，并經(jīng)0.22 μ m混合纖維素濾膜過濾后配制成溶液B。將配置好的溶液A和溶液B在無菌條件下混合，振蕩均勻后配制成假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑溶液，其各成份的終濃度為脫脂乳粉50-150g/L、乳糖50-150g/L、蔗糖50-150g/L、維生素C5-20g/L、明膠 5 -15g/L、NaC115g/L。
[0010]本發(fā)明還提供一種假交替單胞菌屬細(xì)菌冷凍真空干燥保藏的凍干方法。
[0011]本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0012]一種假交替單胞菌屬細(xì)菌冷凍真空干燥保藏的凍干方法，具體步驟是將經(jīng)純化培養(yǎng)的假交替單胞菌屬細(xì)菌用無菌的1.5% NaCl溶液配制成IO7-109cfu/mL的活菌懸液，并將活菌懸液與上述凍干保護(hù)劑溶液按體積比1:4-1:1的比例充分混合均勻后，分裝至安培瓶中并置于_80°C條件下快速冷凍3-4小時(shí)，再放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)凍干艙中，設(shè)置凍干機(jī)的真空度為0.lmbar、凍干艙溫度_54°C的條件下連續(xù)凍干20小時(shí)后，向凍干艙內(nèi)充入99.99%的高純度干燥氮?dú)庵翗?biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封。密封完畢的安培瓶內(nèi)即裝有凍干的假交替單胞菌屬細(xì)菌菌粉，能夠置于常溫下長期保存。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果:
[0014]1.優(yōu)化了凍干保護(hù)劑的配方，并在其中添加了一定的鹽分，使其更加適用于假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保藏。
[0015]2.凍干完畢后向凍干艙中充入高純度氮?dú)獠⒅苯訅荷w密封，在惰性氣體的保護(hù)下使凍干菌株的保存時(shí)間更長，保護(hù)效果更好。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明:
[0017]實(shí)施例1
[0018]2011年11月，山東省青島市某刺參保苗場的刺參幼苗發(fā)生“腐皮綜合征”，從養(yǎng)殖池中挑選發(fā)病癥狀典型的刺參幼苗帶回黃海水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離和培養(yǎng)。在無菌條件下，挑取3-5頭患病刺參幼苗放入無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌的1.5%的NaCl溶液輕輕滴洗病灶處數(shù)次后，用無菌解剖刀刮取每個(gè)病參病灶處組織少許于同一個(gè)新的無菌培養(yǎng)皿中，無菌操作將這些組織剪碎、混勻，并用接種環(huán)挑取少量碎組織在胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離細(xì)菌。將劃線完畢的培養(yǎng)基置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30h后，獲得菌落形態(tài)基本一致的優(yōu)勢細(xì)菌一株，挑取這株菌的單個(gè)菌落，再次轉(zhuǎn)接至一個(gè)新的胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。重復(fù)以上步驟2-3次，直至獲得該菌的純培養(yǎng)物。將獲得的純培養(yǎng)物制成高濃度活菌懸液，并加入水族箱內(nèi)對(duì)刺參幼苗進(jìn)行創(chuàng)傷浸泡以驗(yàn)證其致病性。通過人工回接感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這株菌的致病性后，經(jīng)生理生化表型實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列比對(duì)分析，確定此次刺參發(fā)病的主要病原為假交替單胞菌屬的產(chǎn)黑假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)。
[0019]挑取純培養(yǎng)的產(chǎn)黑假交替單胞菌單菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中在28°C、150rpm條件下培養(yǎng)8h后，于4000r/min離心5min，棄上清，收集菌體沉淀，加入菌體體積15倍左右的濃度為1.5%的無菌NaCl溶液充分振蕩均勻后，再次于4000r/min離心5min,棄上清,收集菌體沉淀,重復(fù)同樣步驟兩次后,用濃度為1.5%的無菌NaCl溶液將收集的菌體重懸配制成IO7-109cfu/mL的菌懸液備用。
[0020]先分別將5g脫脂乳粉、5g乳糖、5g蔗糖和0.5g明膠溶于90mL濃度為1.5%的NaCl溶液中，在106°C條件下濕熱滅菌30min,自然冷卻后配制成溶液A。將0.5g維生素C溶于IOmL濃度為1.5%的無菌NaCl溶液中，并經(jīng)0.22 μ m混合纖維素濾膜過濾后配制成溶液B。將配置好的溶液A和溶液B在無菌條件下混合，并振蕩均勻后配制成凍干保護(hù)劑溶液，其各成份的終濃度為脫脂乳粉50g/L、乳糖50g/L、蔗糖50g/L、維生素C5g/L、明膠5g/L、NaC115g/L。
[0021]在無菌條件下，將已配置好的菌懸液和保護(hù)劑溶液按體積比1:1的比例混合并振蕩均勻后，分裝至數(shù)個(gè)2mL的無菌安培瓶中，每個(gè)安培瓶中裝有1.5mL的混合液，將安培瓶蓋上膠塞后在_80°C超低溫冰箱中快速冷凍3h。然后將已結(jié)冰的混合溶液迅速放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)凍干艙中，在真空度0.lmbar、凍干艙溫度_54°C的條件下連續(xù)凍干20小時(shí)。凍干程序完成后，向凍干艙內(nèi)緩慢充入99.99%的高純度干燥氮?dú)庵翗?biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密封即完成產(chǎn)黑假交替單胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的冷凍真空干燥保存。凍干并密封后的安培瓶置于常溫下保存。
[0022]在凍干完成后的當(dāng)天，第7天和第90天，分別隨機(jī)挑選5個(gè)安培瓶，在無菌條件下打開密封并加入1.5mL的滅菌蒸餾水進(jìn)行復(fù)水，待凍干粉末完全溶解后用濃度為1.5%的無菌NaCl溶液進(jìn)行稀釋，并用胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基涂布進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以測定凍干菌株的存活率，每個(gè)梯度進(jìn)行2次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值，結(jié)果見表I。
[0023]本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，通過本方法獲得的產(chǎn)黑假交替單胞菌凍干菌粉常溫保存I天、7天和90天后的平均存活率均高于32%，取得了較佳的凍干保存效果。
`[0024]表I產(chǎn)黑假交替單胞菌凍干菌粉復(fù)水后的存活率
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑，其特征在于它的組成成份為:脫脂乳粉、乳糖、蔗糖、維生素C、明膠、NaCl和無菌蒸餾水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種假交替單胞菌屬細(xì)菌的凍干保護(hù)劑，其特征在于它的各種成份的終濃度為:脫脂乳粉50-150g/L，乳糖50-150g/L，蔗糖50-150g/L，維生素C5-20g/L,明膠5-15g/L, NaC115g/L,溶劑為無菌蒸懼水。
3.利用權(quán)利要求1或2所述的凍干保護(hù)劑對(duì)假交替單胞菌屬細(xì)菌的冷凍真空干燥保藏的凍干方法，其特征在于它的方法步驟是: 用無菌的1.5% NaCl溶液將待凍干的假交替單胞菌屬細(xì)菌的純培養(yǎng)菌落配制成IO7-109cfu/mL的活菌懸液，并將活菌懸液與權(quán)利要求1或2所述的凍干保護(hù)劑溶液按體積比1:4-1:1的比例充分混合均勻后，分裝至安培瓶中并置于_80°C條件下快速冷凍3-4小時(shí)，再放入預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)凍干艙中，設(shè)置真空度0.lmbar、凍干艙溫度_54°C的條件下凍干20小時(shí)后，向凍干艙內(nèi)充入99.99%的高純度干燥氮?dú)庵翗?biāo)準(zhǔn)大氣壓并壓蓋密 封。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK103451099SQ201310446206
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】王印庚, 張正, 于永翔, 李彬, 榮小軍, 廖梅杰, 史秀清, 王嵐 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所