專利名稱：一種異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微藻生物技術領域，具體涉及一種異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法。
背景技術：
傳統(tǒng)化石資源的大量開采和使用，帶來溫室效應、氣候惡化的同時，化石資源匱乏引發(fā)的能源危機也日益突出。為了緩解目前的能源危機和環(huán)境問題，生物柴油作為化石能源的替代品已經成為國際上的熱點。陸生高等植物油脂、廢餐飲油以及動物油脂都可以作為制備生物柴油的原料，但它們的供應量是非常有限的，就算把它們加起來也難以滿足人類對燃油的需求。異養(yǎng)微藻能在有限的土地上全年連續(xù)高密度生長，并可在一定條件下將 無機碳和有機碳轉化為藻體內大量貯存的油脂，而被視為新一代的、甚至是唯一能實現(xiàn)完全替代石化柴油的生物柴油原料。雖然產脂微藻是目前最好的生物柴油工業(yè)生產來源，但它的含油量不高，導致大規(guī)模培養(yǎng)微藻生產油脂成本昂貴，最終使得利用微藻制備生物柴油難以獲得經濟效益，產業(yè)化進程減緩。提高微藻細胞的油脂含量是目前降低成本的關鍵，有望從根本上解決生物柴油產業(yè)成本過高的瓶頸問題。因此，一直需要努力不懈的研究，以開發(fā)出產脂量及生物量更高的優(yōu)良藻株，為單細胞油脂及生物柴油的工業(yè)生產提供具有競爭力的原材料。為了提高微藻細胞的產脂量，過去的研究主要集中在以下幾個方面(I)培養(yǎng)基優(yōu)化；(2)培養(yǎng)過程控制；(3)代謝工程方法改造藻株；(4)誘變選育高脂突變株。前兩種方法雖然可在一定程度上有效促進藻細胞的產脂量，但提高的百分比數(shù)有限(通常提高20%以下)，仍無法滿足產業(yè)化規(guī)模開發(fā)的要求。代謝工程方法改造微藻是解決藻細胞脂含量低的根本方法，需要全面考慮藻株的整體代謝網絡的結構和調控特點，有待進一步進行研究，研發(fā)成本較高。誘變育種方法研發(fā)成本低，選育周期短，是提高微藻細胞產脂量的有效途徑。誘變育種方法的探索過程中，國內外科技工作者們發(fā)明了多種誘變手段(如物理誘變、化學誘變、物理化學復合誘變、多輪誘變等等)，以及多種高通量快篩高脂突變株的方法(如尼羅紅染色法、磷酸香草醛法、稱重法等等)，但也存在一些不足之處，如高脂突變株的篩選是盲目的、非定向的，往往是高脂突變株、低脂突變株、變化不顯著的突變株藻落同時出現(xiàn)，無法區(qū)分，檢測后才能根據(jù)結果進行確認，不可避免的造成人力、物力、財力的浪費，并增大工作量。理論上講，從誘變處理后的藻株中，選育耐受脂合成抑制劑的微藻突變株可作為一種有效的手段，實現(xiàn)高脂突變株的定向篩選，避免盲目性，再結合以高通量的產脂量確認方法進一步驗證，無疑將會以最節(jié)約的成本、最快的時間和最小的工作量選育出產脂量增強顯著、可穩(wěn)定遺傳的微藻新品系。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為—種異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法I)將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小球藻，或其它具有暗異養(yǎng)生長特性的產脂微藻株系，采用EMS化學誘變處理；將具有暗異養(yǎng)生長特性的產脂微藻株系(小球藻)，接種到Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150 μ mol m_2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期的每毫升藻體內加入10-100 μ I EMS溶液，在黑暗條件下以18-35°C處理15_180min，而后加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應；所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、(λ 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。 2)將步驟I)誘變處理后藻體轉接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養(yǎng)；即將誘變處理后藻體洗滌后觀測其細胞濃度，根據(jù)細胞數(shù)將藻體稀釋IO3-IO6倍，分別涂布到高脂定向篩選平板上，置于18-35°c的程控恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)，篩選單細胞體積增大的藻體于Kuhl培養(yǎng)基中,在溫度為18-35°C,轉速為100-200rpm,光照強度為20-150 μ mol m_2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。3)將上述擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體進行誘導培養(yǎng)6-20天，待用；具體為將擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體中加入50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至總體積500ml)至終濃度為30-60g/L，誘導培養(yǎng)6_20天，使藻細胞內脂的大量合成，而后用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉淀進行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定突變株與野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大于110%，即突變株為單細胞油脂高脂突變株；將誘導培養(yǎng)后藻體中加入甲苯、1%硫酸一甲醇(體積比為硫酸甲醇=I 99)和十九烷酸(C19:0)內標液混合均勻后，置于50-60°C振蕩水浴過夜；取出，冷卻后，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均勻后，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2% KHCO3水溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮氣吹干溶劑后，用正己烷定容，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。所述氣相色譜條件為采用分流模式，以氮氣為載氣；進樣口溫度為250°C ;FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240°C。本發(fā)明所具有的優(yōu)點現(xiàn)有的微藻高脂突變株的篩選技術多是將誘變處理后的藻株涂布在生長平板上培養(yǎng)，篩選過程是非定向的，往往是高脂突變株、低脂突變株、變化不顯著的突變株藻落同時出現(xiàn)在生長平板上，無法用肉眼區(qū)分，檢測后才能根據(jù)結果進行確認，基本屬于盲篩，不可避免的造成人力、物力、財力的浪費，并增大工作量。本發(fā)明在無光異養(yǎng)條件下，采用高脂定向篩選平板(含脂合成抑制劑)培養(yǎng)誘變處理后的藻株，既保證了耐受脂合成抑制劑的突變株藻細胞在平板上存活并生長良好，又避免了脂合成抑制劑光解而失去高脂定向篩選的效果。因而可以直接用肉眼篩選出平板上長出的高脂突變株，避免低脂突變株和脂含量變化不顯著的突變株的干擾，實現(xiàn)了高脂突變株的定向篩選，因此大大提高了選育效率，減少了無用工作量，節(jié)約了研發(fā)成本和研發(fā)時間。
具體實施例方式以下結合實施例為本發(fā)明作進一步描述。第一步、在無菌操作臺上，挑取固體培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好的原始小球藻(Chlorella kessleri)藻落，接種到含IOml無菌Kuhl培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在溫度為25°C,轉速為150rpm,光照強度為ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 s4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)。Kuhl培養(yǎng)基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、
O.012mg/L四水鑰酸銨，加水至總體積1000ml, pH 6. 5。
第二步、取第一步中生長至指數(shù)期的藻液，進行EMS化學誘變處理。在黑暗無菌條件下，取3ml藻液到有蓋的無菌玻璃試管中，加入300μ I EMS溶液(IM)，充分混勻。25°C處理30min，以處理Omin作為空白對照。加入EMS溶液等體積無菌現(xiàn)配的硫代硫酸鈉溶液(10%, w/v)終止誘變反應。第三步、將第二步中誘變處理完畢的藻細胞分別用新鮮無菌Kuhl培養(yǎng)基離心(3000rpm, IOmin)清洗兩次，收集沉淀將其懸浮在3ml新鮮無菌Kuhl培養(yǎng)基中，4°C避光存放。第四步、觀測第三步中懸浮液的細胞濃度，而后將第三步中懸浮液稀釋至空白對照組細胞密度，空白對照組細胞密度約為lX103cellS/ml，取100μ I稀釋的藻液涂布高脂定向篩選平板，將涂布了藻液的500個平板置于25°C的程控恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)。所述配制的高脂定向篩選平板為，配制含有15g/L瓊脂的高起始C/N比(30g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀)的Kuhl培養(yǎng)基，于120°C下高壓蒸汽滅菌20分鐘后冷卻至50°C，加入過濾滅菌后的脂合成抑制劑淺藍菌素(Cerulenin)至終濃度為200 μ M，輕輕搖動混勻，倒制成高脂定向篩選平板。第五步、將能夠在第四步中生長的菌株與對照(原始小球藻)相比單克隆藻明顯增大的單克隆藻落挑出，懸浮到裝有3ml新鮮無菌Kuhl液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，在溫度為25°C,轉速為150rpm,光照強度為ΙΟΟμηιοΙ πΓ2 S4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng),進行擴種繼代培養(yǎng)；第六步、將第五步中生長至指數(shù)期的藻液中加入已滅菌的50%葡萄糖母液(取250g葡萄糖溶于水中至總體積500ml)至終濃度為50g/L，誘導藻細胞內脂的大量合成。第七步、在第六步中誘導培養(yǎng)6天時,取50ml藻液,用去離子水3000rpm低溫離心洗滌2次，去除上清，藻泥沉淀進行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。第八步、稱取第七步中所述干藻粉20mg，加入Iml甲苯、2ml I %硫酸一甲醇(體積比為硫酸甲醇=1 99)、0.8ml十九烷酸(C19:0)內標液，漩渦儀上混勻后，置于50°C振蕩水浴過夜。取出，冷卻后，加入5ml 5% NaCl水溶液、3ml正己烷，漩渦儀上混勻，離心收集上層液體，重復多次直至提取完全，向收集的上層液中加入6ml 2% KHCO3水溶液，漩渦儀上混勻，離心收集上層液體，用氮吹儀吹干溶劑后，用正己烷定容至lml，去除雜質后轉移入色譜進樣瓶中，4°C保存。將樣品中的有效脂肪酸提取并甲酯化以便利用氣相色譜(GC)測定。利用氣相色譜(GC)法測定第八步所述提取液。色譜條件為DB_23毛細管氣相色譜柱(30mX0. 25mmX0. 25 μ m);氮氣為載氣；采用分流模式，進樣體積為I μ I ;進樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ;柱溫箱的溫度為以2. 5°C /min的升溫速率從140°C升至240°C。通過比較脂肪酸甲酯與可信標準的停留時間來識別脂肪酸甲酯，并且通過比較脂肪酸甲酯與內標的峰面積對脂肪酸甲酯進行量化(參見表I)。本實施例以小球藻(Chlorella kessleri)為原始株,經化學誘變劑EMS處理,高脂定向篩選平板初篩，獲得80個高脂突變株新品系，經氣相色譜法復篩，分析結果顯示，這80個新品系確實全部為高脂突變株，其中突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值為110-150%的占 9%，為 150-200%的占 43%，200% 以上的占 48%。其中的一個新品系小球藻(Chlorella kessleri)Al,其目的產物脂的產脂率高達野生株的2. 14倍，而生長狀況與出發(fā)株一致，是一個理想的優(yōu)良突變株，可應用于單細胞油脂及生物柴油的工業(yè)生產有一定的優(yōu)勢。該高脂突變株新品系于2011年5月27日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，編號為CGMCC No. 4917,該藻株命名為小球藻(Chlorella kessleri) Al CGMCC No. 4917。小球藻(Chlorellakessleri)Al CGMCC No. 4917藻株的脂肪酸組成、各脂肪酸占總脂肪酸的比例、以及產脂率如下表I :表I突變株Al誘導脂合成六天時脂肪酸組成及含量與野生株的比較。
權利要求
1.一種異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法，其特征在于 1)將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的具有暗異養(yǎng)生長特性的產脂微藻株系，采用EMS化學誘變處理； 2)將步驟I)誘變處理后藻體轉接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養(yǎng)； 3)將上述擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體進行誘導培養(yǎng)6-20天，待用； 4)取步驟3)藻體利用氣相色譜(GC)測定其脂含量以及野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大于110%，即突變株為單細胞油脂高脂突變株；其高脂突變株已于2011年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為 CGMCC No. 4917。
2.按權利要求I所述的異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法，其特征在于將具有暗異養(yǎng)生長特性的產脂微藻株接種到Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150 μ mol m_2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在培養(yǎng)至對數(shù)生長期的每毫升藻體內加入10-100 μ I EMS溶液，在黑暗條件下以18-35°C處理15-180min,而后加入EMS溶液等體積的硫代硫酸鈉溶液終止誘變反應； 所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨，pH 6. 5。
3.按權利要求I所述的異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法，其特征在于將誘變處理后藻體洗滌后涂布到高脂定向篩選平板上，置于18_35°C的恒溫培養(yǎng)箱中無光靜置培養(yǎng)，篩選單細胞體積增大的藻體于Kuhl培養(yǎng)基中，在溫度為18-35°C，轉速為100-200rpm，光照強度為20-150 μ mol m_2 s—1連續(xù)光照的搖床中振蕩擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
4.按權利要求I所述的異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法，其特征在于將擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體中加入50%葡萄糖母液至終濃度為30-60g/L，誘導培養(yǎng)6-20天，使藻細胞內脂的大量合成，而后用去離子水3000g低溫離心洗滌，去除上清，藻泥沉淀進行真空冷凍干燥處理24h，得到干藻粉。
5.按權利要求I所述的異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法，其特征在于將誘導培養(yǎng)后藻體中加入甲苯、1%硫酸一甲醇和十九烷酸(C19:0)內標液混合均勻后，置于50-60°C振蕩水浴過夜；取出，冷卻后，加入5% NaCl水溶液和正己烷，混合均勻后，離心收集上層液體，向收集的上層液中加入2% KHCOyK溶液混合均勻，漩渦儀上混勻離心收集上層液體，用氮氣吹干溶劑后，用正己烷定容，利用氣相色譜(GC)測定突變株中脂含量。
6.按權利要求I所述的異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法，其特征在于所述氣相色譜條件為采用分流模式，以氮氣為載氣；進樣口溫度為250°C ；FID檢測器溫度為260°C ；柱溫箱的溫度為以2. 50C /min的升溫速率從140°C升至240°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于微藻生物技術領域，具體涉及一種異養(yǎng)微藻的高脂突變株定向選育方法。將在Kuhl培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的具有暗異養(yǎng)生長特性的產脂微藻株系，采用EMS化學誘變處理；將誘變處理后藻體轉接培養(yǎng)在高脂定向篩選平板上，篩選出體積增大的單細胞藻體進行擴種繼代培養(yǎng)；將上述擴種繼代培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻體進行誘導培養(yǎng)6-20天，取上述藻體利用氣相色譜測定突變株與野生株的脂含量，突變株的脂含量與野生株的脂含量的比值大于110％，即突變株為單細胞油脂高脂突變株。
文檔編號C12R1/89GK102888393SQ20111021846
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權日2011年7月22日
發(fā)明者王艷, 秦松 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所