專利名稱：一種線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法及用于線性化表達(dá)載體構(gòu)建的類載體片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因重組表達(dá)技術(shù)，具體涉及一種通過(guò)高效準(zhǔn)確的連接反應(yīng)直接構(gòu)建線性化載體片段實(shí)現(xiàn)線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法及用于線性化表達(dá)載體構(gòu)建的類載體片段。
背景技術(shù)：
基因重組表達(dá)技術(shù)在當(dāng)今的生物科學(xué)研究及產(chǎn)業(yè)化中有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。目前，基因重組表達(dá)的宿主生物有很多種，比如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。很多情況下，在利用這些宿主生物表達(dá)目的基因時(shí)需要先在大腸桿菌中構(gòu)建一個(gè)正確插入目的基因的環(huán)狀質(zhì)粒載體，將該載體提純、線性化后再轉(zhuǎn)化宿主生物，目的基因通過(guò)同源重組整合到宿主生物的基因組中，根據(jù)篩選基因可獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆子。比如常用 畢式酵母(Pichia pastoris)的pPIC9K載體(Invitrogen)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO的pOptiVECtm-TOPO 載體(Invitrogen)都屬此類。圖 2 以畢式酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115和載體pPIC9K表達(dá)綠色熒光蛋白GFP為例說(shuō)明該重組表達(dá)過(guò)程的基本步驟。從圖中可知該重組表達(dá)過(guò)程基本上由17步操作完成，其中有15步操作是在構(gòu)建一個(gè)線性化載體片段，期間需要多次細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提、酶切、純化等操作，成本較高且繁瑣，一般需要一周以上的時(shí)間。如果能夠?qū)⒖梢?guī)模制備的、通用的類似載體的并含有基因表達(dá)所需元件的DNA片段與目的基因片段通過(guò)連接反應(yīng)直接制備圖2中第15步所需的線性化載體片段或者有相同功能的DNA片段，則可以避開(kāi)質(zhì)粒載體構(gòu)建過(guò)程，相關(guān)工作一天內(nèi)可以完成而且非常簡(jiǎn)單，這必將大大加快重組表達(dá)的速度，技術(shù)路線見(jiàn)圖3。上述直接構(gòu)建線性化載體的過(guò)程對(duì)連接反應(yīng)效率要求很高。當(dāng)前基因的克隆表達(dá)中廣泛應(yīng)用的連接反應(yīng)的類型有以下三種一、在極大多數(shù)的環(huán)狀的克隆表達(dá)質(zhì)粒載體中均含有多克隆位點(diǎn)，目的基因和載體經(jīng)多克隆位點(diǎn)中的限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生末端，末端間可以通過(guò)連接酶催化連接反應(yīng)；二、在T載體和TOPO系列載體(Invitrogen)中，載體和目的基因通過(guò)末端的堿基T和A產(chǎn)生連接反應(yīng)，其中在T載體中反應(yīng)由連接酶催化，而在TOPO系列載體中反應(yīng)由拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topoisomerase I)介導(dǎo)連接反應(yīng)；三、其它非連接酶催化的連接反應(yīng)，如GatewayTM系統(tǒng)(Gibco/Life Technologies)和EchoTM系統(tǒng)(Invitrogen)采用Cre酶介導(dǎo)的LoxP位點(diǎn)同源重組構(gòu)建載體。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)上述三大類連接反應(yīng)連接效率均非常低而且極易產(chǎn)生錯(cuò)誤連接，需要在大腸桿菌中篩選正確連入目的基因的陽(yáng)性克隆子，顯然不適合直接用于構(gòu)建線性化載體。中國(guó)專利申請(qǐng)案(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2116936. 5、02117763· 5和02123460. 4)報(bào)道
了三種無(wú)需克隆的線性化載體構(gòu)建方法并且注重參與連接反應(yīng)的末端的產(chǎn)生。每個(gè)發(fā)明中分別給出一種末端產(chǎn)生的方法，分別是以非對(duì)稱性切割的限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生末端、DNA和RNA雜交體的RNA突出末端作為末端、切口酶及核酸外切酶作用產(chǎn)生末端。帶有相應(yīng)末端的相當(dāng)于載體的片段和目的基因由T4DNA連接酶催化產(chǎn)生連接反應(yīng)從而構(gòu)建無(wú)需克隆的線性化載體。實(shí)際應(yīng)用中這些方法受到一定的限制，未能進(jìn)一步得到推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種通過(guò)高效準(zhǔn)確的連接反應(yīng)直接構(gòu)建線性化載體片段實(shí)現(xiàn)快速轉(zhuǎn)基因的方法。本發(fā)明主要是通過(guò)如圖I所示的三段DNA片段的高效準(zhǔn)確的連接反應(yīng)直接構(gòu)建轉(zhuǎn)化表達(dá)目的基因的宿主生物所需的線性化載體片段或者有相同功能的片段，避開(kāi)了通過(guò)構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒載體得到線性化載體片段的繁瑣方法，從而實(shí)現(xiàn)快速轉(zhuǎn)基因的操作。為方便表述，在本發(fā)明中對(duì)圖I中三段依次連接的DNA片段稱為前類載體片段、目的基因片段和后類載體片段。目的基因片段中，編碼鏈5’端對(duì)應(yīng)的DNA序列的一端稱為目的基因片段的前端，編碼鏈3’端對(duì)應(yīng)的DNA序列的一端稱為目的基因片段的后端。目的基因片段的前端與前類載體片段后端連接，目的基因片段的后端與后類載體片段前端連接。
本發(fā)明一方面提供了一種線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括下列步驟I)設(shè)計(jì)前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段，所述前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段滿足下列要求；所述目的基因片段含有目的基因且兩個(gè)末端均為5’冗余粘性末端；所述目的基因片段的5’冗余粘性末端同時(shí)滿足下列要求a)單個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)為1-10個(gè)，較佳的為2_6個(gè)，最佳的為2-4 個(gè)；b)兩個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基選自A、T、C和G中的至多三種，且任一冗余堿基均與目的基因片段中任一單鏈DNA的3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基不同，冗余末端由T4DNA聚合酶降解產(chǎn)生；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述目的基因片段的5’冗余粘性末端還滿足下列要求中至少一項(xiàng)c)兩個(gè)5’冗余粘性末端中至多只有一個(gè)5’冗余粘性末端含有回文對(duì)稱序列；較佳的是兩個(gè)5’冗余粘性末端均沒(méi)有回文對(duì)稱序列。d)兩個(gè)5’冗余粘性末端之間堿基的匹配率要低。較佳的，兩個(gè)5’冗余粘性末端之間最多的連續(xù)配對(duì)的堿基個(gè)數(shù)不大于任一個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)的一半，且當(dāng)出現(xiàn)多個(gè)間隔的連續(xù)配對(duì)時(shí)，匹配的堿基總個(gè)數(shù)小于不匹配的堿基總個(gè)數(shù)。連續(xù)配對(duì)是指一個(gè)冗余末端中2個(gè)或者2個(gè)以上緊鄰的堿基同時(shí)與另一冗余末端中相應(yīng)的堿基配對(duì)。所述前類載體片段的一個(gè)末端為5’冗余粘性末端，且與所述目的基因片段中，編碼鏈5’端對(duì)應(yīng)的5’冗余粘性末端(目的基因片段的前端)相互補(bǔ)，該末端即為前類載體片段的后端，另一個(gè)末端為平端或者經(jīng)去磷酸化酶處理的末端，該末端即為前類載體片段的前端；所述后類載體片段的一個(gè)末端為5’冗余粘性末端，且與所述目的基因片段中，編碼鏈3’端對(duì)應(yīng)的5’冗余粘性末端(目的基因片段的后端)相互補(bǔ)，該末端即為后類載體片段的前端，另一個(gè)末端為平端或者經(jīng)去磷酸化酶處理的末端，該末端即為后類載體片段的后端；2)按照步驟I)的設(shè)計(jì)構(gòu)建前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段；
3)將步驟2)構(gòu)建的前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段直接采用連接酶連接獲得前類載體片段、目的基因片段及后類載體片段依次相連的線性雙鏈DNA表達(dá)載體。步驟I)中，所述5’冗余粘性末端是指帶5’突出的粘性末端；所述冗余堿基是指5’冗余粘性末端中5’突出部分的單鏈堿基。所述目的基因兩個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基選自A、T、C和G中的至多三種，且任一冗余堿基均與目的基因片段中任一單鏈DNA 3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基不同。舉例來(lái)說(shuō)，如下列片段即符合上述規(guī)定 (1)5，AAATG§A------------TG3，
II
3，GT------------A§TTT 5，
(2)5’ TTTTG§A------------TT3’
II
3，GT------------A0GTG 5，上述片段中，下劃線部分為冗余堿基，帶方框的堿基即為單鏈DNA 3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基。在片段(I)中，冗余堿基種類為A、T和G，兩條單鏈DNA 3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基均為C，任一冗余堿基均與兩條單鏈DNA 3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基不同；在片段(2)中，冗余堿基種類為T(mén)和G，兩條單鏈DNA 3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基分別為C和A，任一冗余堿基均與兩條單鏈DNA 3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基不同。設(shè)計(jì)出符合步驟I)要求的前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段后，可將前類載體片段和后類載體片段構(gòu)建于質(zhì)粒載體以制備含有所需末端的類載體片段，可將目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用T4 DNA聚合酶酶處理以制備含有所需末端的目的基因片段。所述步驟3)中，連接酶可選自T4 DNA連接酶或大腸桿菌連接酶。本發(fā)明中，三段DNA依次經(jīng)連接酶連接產(chǎn)生“前類載體-目的基因-后類載體”的線性化載體片段(即前類載體片段、目的基因片段及后類載體片段依次相連的線性雙鏈DNA表達(dá)載體)的連接反應(yīng)中，只有前類載體片段的后端與目的基因片段的前端的連接反應(yīng)，以及后類載體片段的前端與目的基因片段的后端的連接反應(yīng)是預(yù)期的，而其他末端之間的連接反應(yīng)均是非預(yù)期的。為確保前類載體片段的前端或后類載體片段的后端盡可能地不參與任何連接反應(yīng)，最優(yōu)化的方式是前類載體片段的前端或后類載體片段的后端均為平末端，選用大腸桿菌連接酶。平末端的產(chǎn)生可采用酶切后為平末端的限制性內(nèi)切酶，也可對(duì)酶切后的粘性末端經(jīng)單鏈核酸外切酶削平處理獲得平末端或者經(jīng)DNA聚合酶補(bǔ)平處理獲得平末端。較佳的，目的基因片段的構(gòu)建包括下列步驟A.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因得到目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B.將目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，利用T4DNA聚合酶產(chǎn)生5’冗余粘性末端。
步驟A中所述引物包括一上游引物與下游向引物，所述上游引物與下游引物的5’端均加入1-10個(gè)堿基的多核苷酸接頭序列以與所設(shè)計(jì)的5’冗余粘性末端的冗余堿基段相對(duì)應(yīng)。上述步驟B中，利用T4DNA聚合酶產(chǎn)生5’冗余粘性末端的方法為將純化的目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在有堿基底物存在的反應(yīng)體系中，用T4 DNA聚合酶處理，最終獲得帶有5’冗余粘性末端的目的基因片段，所述堿基底物選自dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并且必須含有待構(gòu)建目的基因的兩條單鏈DNA 3’端的首個(gè)喊基相對(duì)應(yīng)的喊基底物,而不得含有待構(gòu)建的目的基因片段中任一冗余堿基的互補(bǔ)堿基相對(duì)應(yīng)的堿基底物。所述堿基底物并且必須含有待構(gòu)建目的基因的兩條單鏈DNA 3’端的首個(gè)堿基相對(duì)應(yīng)的喊基底物，而不得含有待構(gòu)建的目的基因片段中任一幾余喊基的互補(bǔ)喊基相對(duì)應(yīng)的堿基底物。舉例來(lái)說(shuō)，如果擬構(gòu)建的目的基因片段如下
權(quán)利要求
1.一種線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括下列步驟 1)設(shè)計(jì)前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段， 所述前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段滿足下列要求； 所述目的基因片段含有目的基因且兩個(gè)末端均為5’冗余粘性末端； 所述目的基因片段的5’冗余粘性末端同時(shí)滿足下列要求 a)單個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)為1-10個(gè)； b)兩個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基選自A、T、C和G中的至多三種，且任一冗余堿基均與目的基因片段中任一單鏈DNA的3’端首個(gè)堿基的互補(bǔ)堿基不同，冗余末端由T4 DNA聚合酶降解產(chǎn)生； 所述前類載體片段的一個(gè)末端為5’冗余粘性末端，且與所述目的基因片段中，編碼鏈5’端對(duì)應(yīng)的5’冗余粘性末端相互補(bǔ)，另一個(gè)末端為平端或者經(jīng)去磷酸化酶處理的末端； 所述后類載體片段的一個(gè)末端為5’冗余粘性末端，且與所述目的基因片段中，編碼鏈3’端對(duì)應(yīng)的5’冗余粘性末端相互補(bǔ)，另一個(gè)末端為平端或者經(jīng)去磷酸化酶處理的末端； 2)按照步驟I)的設(shè)計(jì)構(gòu)建前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段； 3)將步驟2)構(gòu)建的前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段采用連接酶連接獲得前類載體片段、目的基因片段及后類載體片段依次相連的線性雙鏈DNA表達(dá)載體。
2.如權(quán)利要求I所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟I)中，所述目的基因片段的5’冗余粘性末端還滿足下列要求中至少一項(xiàng) c)兩個(gè)5’冗余粘性末端中至多只有一個(gè)5’冗余粘性末端含有回文對(duì)稱序列； d)兩個(gè)5’冗余粘性末端之間堿基的匹配率要低。
3.如權(quán)利要求2所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述要求c)為兩個(gè)5’冗余粘性末端均沒(méi)有回文對(duì)稱序列；所述要求d)具體為兩個(gè)5’冗余粘性末端之間最多的連續(xù)配對(duì)的堿基個(gè)數(shù)不大于任一個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)的一半，且當(dāng)出現(xiàn)多個(gè)間隔的連續(xù)配對(duì)時(shí)，匹配的堿基總個(gè)數(shù)小于不匹配的堿基總個(gè)數(shù)。
4.如權(quán)利要求I所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，要求a)為單個(gè)5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)為2-4個(gè)；
5.如權(quán)利要求I所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟3)中，連接酶選自T4 DNA連接酶或大腸桿菌連接酶。
6.如權(quán)利要求I所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)中，目的基因片段的構(gòu)建包括下列步驟 A.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因得到目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； B.將目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，利用T4DNA聚合酶產(chǎn)生5’冗余粘性末端。
7.如權(quán)利要求6所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟B中，利用T4DNA聚合酶產(chǎn)生5’冗余粘性末端的方法為將純化的目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在有堿基底物存在的反應(yīng)體系中，用T4 DNA聚合酶處理，最終獲得帶有5’冗余粘性末端的目的基因片段，所述堿基底物選自dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并且必須含有待構(gòu)建目的基因片段的兩條單鏈DNA 3’端的首個(gè)堿基相對(duì)應(yīng)的堿基底物，而不得含有待構(gòu)建的目的基因片段中任一冗余堿基的互補(bǔ)堿基相對(duì)應(yīng)的堿基底物。
8.如權(quán)利要求I所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)中，所述前類載體片段和后類載體片段的制備方法為在設(shè)計(jì)的類載體片段的4個(gè)末端加上多核苷酸接頭，制備帶有多核苷酸接頭的類載體片段后，將其克隆在環(huán)狀質(zhì)粒載體中或者改造現(xiàn)有的一些質(zhì)粒載體，而后將所述質(zhì)粒載體在大腸桿菌中復(fù)制，提取質(zhì)粒，通過(guò)工具酶處理多核苷酸接頭獲得符合步驟I)所述要求的末端。
9.如權(quán)利要求8所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述用工具酶處理多核苷酸接頭獲得符合步驟I)所述要求的末端，選用以下方法之一 方法一利用限制性內(nèi)切酶酶切類載體片段末端的多核苷酸接頭，直接獲得末端恰好符合步驟I)末端設(shè)計(jì)要求的前類載體片段和后類載體片段； 方法二 先利用限制性內(nèi)切酶酶切類載體片段末端的多核苷酸接頭，再用核酸酶、DNA聚合酶處理限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端以產(chǎn)生符合步驟I)末端設(shè)計(jì)要求的冗余末端。
10.如權(quán)利要求I所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述前類載體片段、目的基因片段及后類載體片段依次相連的線性雙鏈DNA表達(dá)載體中，含有同源重組序列、篩選基因、啟動(dòng)子和終止子。
11.如權(quán)利要求10所述線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述前類載體片段、目的基因片段及后類載體片段依次相連的線性雙鏈DNA表達(dá)載體中還含有增強(qiáng)子、信號(hào)肽和與目的基因產(chǎn)物融合的蛋白中的至少一種。
12.一種用于構(gòu)建線性化表達(dá)載體的類載體片段，包括前類載體片段和后類載體片段，所述前類載體片度的后端為5’冗余粘性末端，前端為平端；后類載體片段的前端為5’冗余粘性末端，后端為平端；所述前類載體片度和后類載體片段的5’冗余粘性末端同時(shí)滿足下列要求 A.前類載體片段的后端的5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)為2個(gè)，后類載體片段的前端的5’冗余粘性末端的冗余堿基個(gè)數(shù)為3個(gè)； B.所述兩個(gè)5’冗余粘性末端無(wú)回文對(duì)稱序列； C.所述兩個(gè)5’冗余粘性末端自身及之間連續(xù)配對(duì)的堿基個(gè)數(shù)小于2個(gè)。
13.如權(quán)利要求12所述用于構(gòu)建線性化表達(dá)載體的類載體片段，其特征在于，所述前類載體片段和后類載體片段含有同源重組序列、篩選基因、啟動(dòng)子和終止子。
14.如權(quán)利要求12所述用于構(gòu)建線性化表達(dá)載體的類載體片段，其特征在于，所述前類載體片段的后端5’冗余粘性末端的冗余堿基序列為3’-GA 5’，另一末端為平端；后類載體片段的前端5’冗余粘性末端的冗余堿基序列為5’ GAC-3’，另一末端為平端。
15.如權(quán)利要求14所述用于構(gòu)建線性化表達(dá)載體的類載體片段，其特征在于，所述前類載體片段包含在序列為SEQ ID NO: I的片段中，兩端經(jīng)SnaB I和Acc I酶切即產(chǎn)生所述末端，所述后類載體片段包含在序列為SEQ ID NO :2的片段中，兩端經(jīng)SnaB I和Cpo I酶切即產(chǎn)生所述末端。
16.如權(quán)利要求12或13所述類載體片段的使用方法，包括下列步驟 I)目的基因片段的構(gòu)建 A.設(shè)計(jì)帶有多核苷酸接頭的PCR引物擴(kuò)增目的基因得到目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；設(shè)計(jì)的多核苷酸接頭應(yīng)滿足使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T4DNA聚合酶處理后兩端均產(chǎn)生5’冗余粘性末端，且編碼鏈5’端對(duì)應(yīng)的5’冗余粘性末端與所述類載體片段的前類載體片段的后端5’冗余粘性末端互補(bǔ)，編碼鏈3’端對(duì)應(yīng)的5’冗余粘性末端與所述類載體片段的后類載體片段的前端5’冗余粘性末端互補(bǔ)； B.將目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，利用T4DNA聚合酶處理或工具酶酶切產(chǎn)生5’冗余粘性末端； 2)將目的基因片段與所述類載體片段連接。
17.如權(quán)利要求16所述的使用方法，其特征在于，步驟I)所述帶有多核苷酸接頭的PCR引物中，目的基因的上游引物帶有5’CTA-3’接頭，目的基因的下游引物帶有3’-ACTG5’接頭，采用所述PCR引物擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物，在堿基底物dTTP存在下，經(jīng)T4 DNA聚合酶在處理后產(chǎn)生5’冗余粘性末端；步驟2)所述類載體片段為權(quán)利要求14或15所述類載體片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法及用于線性化表達(dá)載體構(gòu)建的類載體片段，本發(fā)明的線性化表達(dá)載體構(gòu)建方法包括下列步驟設(shè)計(jì)并構(gòu)建前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段；將前類載體片段、后類載體片段及目的基因片段采用連接酶連接獲得線性雙鏈DNA表達(dá)載體。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了用于線性化表達(dá)載體構(gòu)建的類載體片段。本發(fā)明通過(guò)高效準(zhǔn)確的連接反應(yīng)制備類似線性化載體片段，避開(kāi)了通過(guò)繁瑣耗時(shí)的環(huán)狀質(zhì)粒載體的構(gòu)建而獲得線性化載體片段的過(guò)程，同時(shí)目的基因末端的產(chǎn)生不受其序列的限制可以極大簡(jiǎn)化操作、降低成本并縮短實(shí)驗(yàn)周期，在酵母等表達(dá)系統(tǒng)中具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102911961SQ20111021838
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者尚玉栓 申請(qǐng)人:尚玉栓