專利名稱：生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建微生物工程菌生產(chǎn)重組蛋白。具體是應(yīng)用微生物工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
背景技術(shù)：
淀粉必須水解為葡萄糖才能被轉(zhuǎn)化為乙醇，人體不能直接吸收淀粉，但是能直接吸收葡萄糖。每年世界上需要生產(chǎn)大量的異淀粉酶、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶而應(yīng)用于將淀粉轉(zhuǎn)化于葡萄糖的飴糖、釀酒和美食等行業(yè)。淀粉由直鏈和支鏈組成。支鏈由α-1，6糖苷鍵連接，而直鏈的糖分子之間由 α-1,4糖苷鍵連接。在天然的淀粉質(zhì)原料中，支鏈淀粉的含量約占70 % 95 %，而直鏈淀粉的含量< 30%。異淀粉酶(Isoamylase，Ε. C. 3. 2. 1. 68)能專一性地分解支鏈淀粉中分支點(diǎn)的α-1，6糖苷鍵，將支鏈淀粉轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉，因此又稱為脫支酶。α-淀粉酶 (a-amylase,EC. 3. 2. 1. 1)是一種能從直鏈淀粉分子內(nèi)部切開α _1，4糖苷鍵的內(nèi)切酶，產(chǎn)物包括麥芽糖、麥芽三糖和其它寡聚糖。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，Ε. C. 3. 2. 1. 3)，簡稱糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化淀粉水解為葡萄糖，其葡萄糖主要是來源于直鏈淀粉。因?yàn)樗饕撬庵辨湹矸鄣摩?1.4糖苷鍵，歲能水解α-1，6糖苷鍵，但其水解α_1，6糖苷鍵比速率僅為作用于α-1，4糖苷鍵的0.2%。若在淀粉中只加異淀粉酶那么只能剪切淀粉的支鏈，其產(chǎn)物是直連淀粉而不是葡萄糖；若在淀粉中加入α淀粉酶，其產(chǎn)物是麥芽糖、麥芽三糖和α糊精而不是葡萄糖；若在淀粉中加入葡萄糖淀粉酶，獲得的葡萄糖產(chǎn)物主要是來自于直鏈淀粉。根據(jù)異淀粉酶、α 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用機(jī)理，若異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶聯(lián)合應(yīng)用，那么將能充分地、高效地將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。當(dāng)前市面上只有這些酶的單種酶，尚沒有混合表達(dá)這些酶的菌種和混合酶產(chǎn)品。 枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母都是常用于生產(chǎn)重組蛋白的宿主菌，但各具有特征。畢赤酵母的主要特征是分泌極少自身蛋白有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化的特點(diǎn)，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有兼性需氧的特性，適合于固態(tài)厭氧發(fā)酵的大規(guī)模地低能耗的酶的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有聯(lián)合水解淀粉的作用，市場上還沒有異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合酶產(chǎn)品，枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母是常用于表達(dá)外源蛋白的宿主菌，而通過分子生物學(xué)技術(shù)將來自解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶、地衣芽孢桿菌的α淀粉酶、大麥的α淀粉酶和黑曲霉菌的葡萄糖淀粉酶基因重組于枯草芽孢桿菌基因組、畢赤酵母基因組和釀酒酵母基因組。用含異淀粉酶、兩種α 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌，畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
1.克隆酶基因應(yīng)用PCR技術(shù)，從解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因， 從地衣芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因，從大麥基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增葡萄糖淀粉酶基因；2.克隆構(gòu)建表達(dá)載體的相關(guān)原件(啟動(dòng)子，重組序列，信號(hào)肽，轉(zhuǎn)錄終止序列和抗性基因)3.構(gòu)建如附圖1，附圖2和附圖3的三種表達(dá)載體。4.通過表達(dá)載體將異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母基因組。即構(gòu)建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌，畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌。5.發(fā)酵含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌、 畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。本發(fā)明構(gòu)建含異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于(1)針對(duì)異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有協(xié)同水解淀粉生成葡萄糖的特性，異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶混合酶的添加能達(dá)到顯著地加強(qiáng)水解淀粉為葡萄糖的作用，而市場上需求這種混合酶產(chǎn)品。本發(fā)明通過構(gòu)建工程菌，應(yīng)用工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，一方面提供混合酶的新產(chǎn)品，另一方面取代分別發(fā)酵含異淀粉酶基因的菌株生產(chǎn)異淀粉酶，發(fā)酵含α淀粉酶基因菌株生產(chǎn)α淀粉酶，發(fā)酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶。即用一個(gè)發(fā)酵工序生產(chǎn)整個(gè)水解淀粉生成葡萄糖酶系的酶取代用多個(gè)工序分別生產(chǎn)異淀粉酶，α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。達(dá)到節(jié)省了原材料、能耗和人力資源的作用。(2)枯草芽孢桿菌，畢赤酵母和釀酒酵母在生產(chǎn)重組蛋白方面各具特征，本發(fā)明分別構(gòu)建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌，畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌，為其重組酶生產(chǎn)提供多種宿主選擇。


附圖1.含異淀粉酶、兩種
菌表達(dá)載體附圖2含異淀粉酶、兩種c 載體附圖3含異淀粉酶、兩種c 載體
具體實(shí)施例方式下面用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌，生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶1. 1構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)載體1. 1. 1構(gòu)建克隆載體
α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架的釀酒酵母表達(dá)
4
DNA合成含氨芐青霉素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，在其序列的兩端形成堿基互補(bǔ)。通過DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為ρΒΡΑ。1. 1.2獲取基因①PCR擴(kuò)增異淀粉酶基因提取解淀粉假單胞桿菌基因組DNA，應(yīng)用引物(5，CGGATATC GCCATCAACAGCATGAGC3 ‘ ； 5 ‘ CGGATATCGGCTACTTGGAGATCAACAG3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是異淀粉酶基因序列。②PCR擴(kuò)增地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA，應(yīng)用引物(5 ’ Atgaaacaacaaaaacggct3，； 5’ ctatctttgaacataaattg3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定和用NCBI提供的BLAST 軟件分析證明是含信號(hào)肽的α淀粉酶基因序列。③PCR擴(kuò)增大麥的α淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)應(yīng)用RNA提取試劑盒提取黑曲霉菌的RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用引物(5，ATGGGGAAGAACGGCAGCCT 3，，5，TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是含信號(hào)肽的α 淀粉酶基因序列。④PCR擴(kuò)增葡萄糖淀粉酶基因(包括信號(hào)肽)應(yīng)用RNA提取試劑盒提取黑曲霉菌的RNA，應(yīng)用cDNA合成試劑盒合成其cDNA，應(yīng)用弓 I 物(5，atgtcgttccgatctcttct3，5，CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是含信號(hào)肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。1. 1. 3分別構(gòu)建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架。①用PCR擴(kuò)增巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子序列。提取巨大芽孢桿菌的基因組DNA，應(yīng)用如下引物(5，GATCCATTATCGGTGAACCA3，； 5，GGGAATACATTACGGCCGAT3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定和用NCBI提供的BLAST 軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列。②DNA序列合成法合成如下α因子信號(hào)肽ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAAC ACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGT TGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAG AAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC ③DNA序列合成法合成如下DNA轉(zhuǎn)錄終止序列GGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTT TTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATG
5ATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATT TTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGGATATTATTTCGAAATAAACCGTGTTGTGTAAGCTTGAAG④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列CCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAA TACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGG TATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGA GAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCC AGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAAT ACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAAT ATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCAT CATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCT GTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGAT TGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCG GCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT⑤用PCR從枯草芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增rDNA序列應(yīng)用常規(guī)方法提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用如下引物 (5，gacgaacgctggcggcgtgc3 :5，gcaccttccgatacggctacct3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌基因組中的rDNA序列。⑥表達(dá)框架構(gòu)建(啟動(dòng)子-信號(hào)肽-基因-轉(zhuǎn)錄終止序列)過程A.含異淀粉酶基因的表達(dá)框架的構(gòu)建將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBPA載體的多克隆位點(diǎn)；將α因子信號(hào)肽DNA序列重組于pBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將異淀粉酶基因序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于信號(hào)肽序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含異淀粉酶基因的表達(dá)框架的載體稱為ΡΒΡΑ1。B.含地衣芽孢桿菌α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建
將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBPA載體的多克隆位點(diǎn)；將包含信號(hào)肽的地衣α淀粉酶基因序列重組于pBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含α 淀粉酶基因的表達(dá)框架的載體稱為ΡΒΡΑ2。C.含大麥α淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBPA載體的多克隆位點(diǎn)；將包含信號(hào)肽的大麥α淀粉酶基因序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子下游；將轉(zhuǎn)錄終止序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含大麥α淀粉酶基因的表達(dá)框架的載體稱為ΡΒΡΑ3。D.含葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架的構(gòu)建將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列重組于pBPA載體的多克隆位點(diǎn)；將包含信號(hào)肽的葡萄糖淀粉酶基因序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于啟動(dòng)子序列的下游；將轉(zhuǎn)錄終止序列重組于PBPA載體的多克隆位點(diǎn)，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因的表達(dá)框架的載體稱為ΡΒΡΑ4。⑦完成表達(dá)載體的構(gòu)建Α.將表達(dá)框架組裝于同一個(gè)克隆載體。通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，分別切取ρΒΡΑ2、ρΒΡΑ3和ρΒΡΑ4載體的表達(dá)框架，并將以上的這三套表達(dá)框架依次插入于PBPAl的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為 PBPA1234.B.然后同樣通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用依次將DNA重組序列和G418 抗性基因重組于PBPA1234載體的多克隆位點(diǎn)。構(gòu)成含異淀粉酶基因、兩種α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因表達(dá)框架的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(附圖1)。1. 2構(gòu)建含異淀粉酶基因、兩種α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因枯草芽孢桿菌工程菌將含含異淀粉酶基因、兩種α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌基因組，用載體上的抗性基因篩選重組子。用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因驗(yàn)證重組子分別用異淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌α淀粉酶基因、大麥α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的特異引物，以重組子基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；重組子能擴(kuò)增出目標(biāo)大小的PCR擴(kuò)增帶，并且對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定證明其異淀粉酶基因、兩種α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因已經(jīng)重組于重組子的基因組。其重組子即含異淀粉酶基因、兩種α 淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌。1. 3生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶將含異淀粉酶基因、兩種α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌接種于含淀粉的液體培養(yǎng)基(含10%木薯淀粉，0.5% NaCl，l%蛋白胨，0.5%酵母粉) 中發(fā)酵2d，離心取上清進(jìn)行酶活性分析。并應(yīng)用同樣的條件對(duì)如下對(duì)照菌株進(jìn)行發(fā)酵重組異淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌；重組α淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌；重組葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌。含異淀粉酶基因、兩種α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因枯草芽孢桿菌工程菌表達(dá)的重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的活性分析見下表。
權(quán)利要求
1.用枯草芽孢桿菌工程菌、畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。其特征在于通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆解淀粉假單胞桿菌的異淀粉酶基因，地衣芽孢桿菌的α淀粉酶基因，大麥的α淀粉酶基因和黑曲霉菌的葡萄糖淀粉酶基因；通過構(gòu)建表達(dá)載體，將以上所獲得的異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因重組于枯草芽孢桿菌基因組、畢赤酵母基因組和釀酒酵母基因組。用含以上所述的異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌、畢赤酵母工程菌和釀酒酵母工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡葡萄糖淀粉酶方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先從解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因，從地衣芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因，從大麥基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增葡萄糖淀粉酶基因；分別構(gòu)建含異淀粉酶、兩種α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體、畢赤酵母表達(dá)載體和釀酒酵母表達(dá)載體；構(gòu)建工程菌將枯草芽孢桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌基因組，將畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組，將釀酒酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母基因組；發(fā)酵工程菌生產(chǎn)重組混合異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。這些酶的混合應(yīng)用能顯著地加強(qiáng)水解淀粉為葡萄糖的作用。生產(chǎn)混合酶的優(yōu)越性在于，將常規(guī)需要幾道工序分別生產(chǎn)異淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，轉(zhuǎn)變?yōu)橐坏拦ば蛏a(chǎn)這三種酶的混合酶，起到顯著地減少能耗和降低生產(chǎn)成本的作用。
文檔編號(hào)C12N9/28GK102286443SQ20111021335
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月16日
發(fā)明者劉振旺, 張澤華, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 易國輝, 沈錦城, 羅進(jìn)賢, 陳麗萍 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 羅進(jìn)賢