專利名稱：一種HCV Core protein基因RT-PCR分型及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種HCV Core protein基因RT-PCR分型及檢測(cè)方法,特別涉及可用于丙型肝炎篩查和丙型肝炎病毒分型的引物組合物。
背景技術(shù)：
丙型肝炎(hepatitis C ；HC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus ；HCV)感染而導(dǎo)致的一種復(fù)雜的病理過程。HC呈世界分布，目前全世界有近2億人感染HCV，占世界人口的3% -5%。2003至2008年我國(guó)丙肝新報(bào)告的病例數(shù)以及與丙肝相關(guān)的肝癌發(fā)病率逐年增加，在法定報(bào)告的27種傳染病中，其發(fā)病率由2004年的第十位上升至2008年第七位，目前我國(guó)約有丙肝患者4000萬(wàn)。HCV基因組長(zhǎng)度約9. 6kb，僅含有單個(gè)開放閱讀框架(ORF)，編碼一條長(zhǎng)約3100個(gè)·氨基酸殘基的多聚蛋白前體。在宿主細(xì)胞和病毒蛋白酶的作用下，多蛋白被加工成至少10個(gè)成熟的 HCV 蛋白質(zhì)C、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。HCV 核心蛋白由191個(gè)氨基酸殘基組成，與HCV RNA結(jié)合后形成病毒核心。目前，第四代抗-HCV檢測(cè)試劑主要有C、NS3、NS4、NS5抗原片段。由于HCV極易變異，相應(yīng)其所表達(dá)的蛋白也發(fā)生變化，在實(shí)際檢測(cè)中會(huì)產(chǎn)生弱陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種HCV Core protein基因RT-PCR分型及檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的第一種引物組合物，可用于丙型肝炎患者輔助篩查，包括序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示 DNA。本發(fā)明提供的第二種引物組合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所7]n DNA、序列表的序列3所不DNA、序列表的序列4所不DNA、序列表的序列5所不DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述引物組合物的用途為如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者輔助篩查；(b)丙型肝炎病毒輔助分型。本發(fā)明提供的第三種引物組合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述引物組合物的用途為如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者輔助篩查；(b)丙型肝炎病毒輔助分型。所述第一種引物組合物、所述第二種引物組合物或所述第三種引物組合物可用于制備丙型肝炎患者輔助篩查的試劑盒。所述第二種引物組合物或所述第三組引物組合物可用于制備丙型肝炎病毒輔助分型的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)一種丙型肝炎患者輔助篩查的試劑盒，包括所述第一種引物組合物、所述第二種弓I物組合物或所述第三種弓I物組合物。本發(fā)明還保護(hù)一種丙型肝炎病毒輔助分型的試劑盒，包括所述第二種引物組合物或所述第三種引物組合物。本發(fā)明還保護(hù)一種丙型肝炎病毒輔助分型的方法，包括如下步驟(I)以待測(cè)丙型肝炎病毒的總RNA為模板，用引物對(duì)甲進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；(2)以步驟⑴的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)乙為序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)；(3)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型；所述測(cè)序所用的引物為引物對(duì)丙；所述引物對(duì)丙為序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)。所述步驟(2)中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為450bp?！け景l(fā)明還保護(hù)另一種丙型肝炎病毒輔助分型的方法，包括如下步驟(I)以待測(cè)丙型肝炎病毒的總RNA為模板，用所述引物對(duì)甲進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)以步驟⑴的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用所述引物對(duì)丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型；所述測(cè)序所用的引物為所述引物對(duì)丙。所述丙型肝炎病毒具體可為Ib型、Ia型、6a型、3a型或2a型。HCV的早期診斷與基因分型是傳染病防控與臨床工作的難點(diǎn)。本研究選擇巢式PCR對(duì)HCV核心蛋白的編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，從而對(duì)HCV進(jìn)行基因水平的分型。巢式PCR是為擴(kuò)增一個(gè)低拷貝片段而進(jìn)行兩次聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段是擴(kuò)增包括目的片段在內(nèi)的比目的片段還長(zhǎng)的片段。第二對(duì)引物(稱為巢式引物)能夠與第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部結(jié)合，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)在于能夠擴(kuò)增出比普通PCR更難擴(kuò)增的片段，而且如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。第三代第四代HCV ELISA試劑盒中關(guān)鍵成份之一就是對(duì)HCV核心蛋白的檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)使用HCV ELISA試劑盒檢測(cè)為抗-HCV陰性但ALT大于100U/L的血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有一例核心蛋白基因擴(kuò)增陽(yáng)性，說明本方法可以作為可疑HCV感染人群的輔助篩查。本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)涉及1063條HCV Core Protein基因序列，包括6個(gè)基因型83個(gè)亞型，理論上能全部對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因型的檢測(cè)和分型確認(rèn)。綜上所述，本發(fā)明提供的引物組合物可以用于丙型肝炎篩查和丙型肝炎病毒分型，具有重大潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖I為第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；1為DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2-5均為待測(cè)血清，其中2至4顯示陽(yáng)性結(jié)果，5顯示陰性結(jié)果。圖2為I例Ib型的部分測(cè)序譜圖。
圖3為I例Ib型的國(guó)際HCV數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例I、引物組合物的設(shè)計(jì)
從國(guó)際HCV 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hcv. lanl. gov/components/sequence/HCV/search/searchi.html)查找到1063條HCV Core Protein基因序列,包括6個(gè)基因型83個(gè)亞型,利用DNAStar-Megalign分析比對(duì)找出其保守序列，并用PRMER5設(shè)計(jì)引物，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)其特異性。共設(shè)計(jì)并篩選得到6種引物(Cl、C2、C3、C4、C5和C6)，序列見表I。表I 6條引物(簡(jiǎn)并引物)的核苷酸序列
權(quán)利要求
1.用于丙型肝炎患者輔助篩查的引物組合物，包括序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所不DNA、序列表的序列3所不DNA和序列表的序列4所不DNA。
2.引物組合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所不DNA、序列表的序列4所不DNA、序列表的序列5所不DNA和序列表的序列6所不DNA組成；所述引物組合物的用途為如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者輔助篩查； (b)丙型肝炎病毒輔助分型。
3.引物組合物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述引物組合物的用途為如下(a)或(b) (a)丙型肝炎患者輔助篩查； (b)丙型肝炎病毒輔助分型。
4.權(quán)利要求I或2或3所述引物組合物在制備丙型肝炎患者輔助篩查的試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或3所述引物組合物在制備丙型肝炎病毒輔助分型的試劑盒中的應(yīng)用。
6.一種丙型肝炎患者輔助篩查的試劑盒，包括權(quán)利要求I或2或3所述引物組合物。
7.—種丙型肝炎病毒輔助分型的試劑盒，包括權(quán)利要求2或3所述引物組合物。
8.—種丙型肝炎病毒輔助分型的方法，包括如下步驟 (1)以待測(cè)丙型肝炎病毒的總RNA為模板，用引物對(duì)甲進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)； (2)以步驟(I)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物對(duì)乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)乙為序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)； (3)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型；所述測(cè)序所用的引物為引物對(duì)丙；所述引物對(duì)丙為序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中的所述擴(kuò)增產(chǎn)物為450bp。
10.一種丙型肝炎病毒輔助分型的方法，包括如下步驟 (1)以待測(cè)丙型肝炎病毒的總RNA為模板，用引物對(duì)甲進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)； (2)以步驟(I)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用引物對(duì)丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物對(duì)丙為序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)； (3)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型；所述測(cè)序所用的引物為所述引物對(duì)丙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HCV Core protein基因RT-PCR分型及檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的引物組合物，包括序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA，還可包括序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA。本發(fā)明提供的引物組合物可以用于丙型肝炎患者篩查和丙型肝炎病毒分型，具有重大潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899422SQ20111020854
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者朱玉蘭, 董瑞玲, 劉勝牙, 古莉冰, 王佃鵬, 孫杰, 徐媛, 李微 申請(qǐng)人:深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心