專(zhuān)利名稱(chēng)：一種特異性指示禽糞便污染的基因檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性指示禽糞便污染的基因檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著沿海養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，農(nóng)業(yè)非點(diǎn)源污染——畜禽排泄物污染已成為影響近海海域及養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量的重要污染源。畜禽養(yǎng)殖排泄物多以非點(diǎn)源的方式進(jìn)入水體環(huán)境， 其隨機(jī)性、散在性、廣泛性和多樣性給管理和控制造成了巨大困難。動(dòng)物糞便帶來(lái)的大量致病微生物，諸如霍亂弧菌、傷寒沙門(mén)氏菌、腸蘭伯氏鞭毛蟲(chóng)、甲型肝炎病毒、貝類(lèi)Norwalk病毒等可以隨著污染的水體到處傳播。部分細(xì)菌或病毒能夠直接作用于海洋動(dòng)植物，導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)或貝類(lèi)等水產(chǎn)養(yǎng)殖品大量死亡；部分致病菌還可以存活于貝類(lèi)或魚(yú)類(lèi)體內(nèi)，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，造成流行病傳染病的暴發(fā)。由此可見(jiàn)，糞便污染不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋生態(tài)環(huán)境帶來(lái)危害，而且還威脅著人類(lèi)的健康生活。治病要去根，治污當(dāng)溯源。建立監(jiān)測(cè)、溯源和示蹤為一體的近岸海域及養(yǎng)殖水環(huán)境非點(diǎn)源污染示蹤監(jiān)測(cè)體系勢(shì)在必行。為了解決農(nóng)業(yè)糞便污染對(duì)水環(huán)境帶來(lái)的污染問(wèn)題，以美國(guó)為代表的先進(jìn)國(guó)家開(kāi)始了一種新型識(shí)別糞便污染源技術(shù)——微生物源示蹤(Microbial Source Tracking, MST) 的研究。MST是指利用微生物為污染源的示蹤指示物，識(shí)別污染環(huán)境中污染物(特別是糞便) 來(lái)源的生物技術(shù)。MST監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在1)準(zhǔn)確識(shí)別環(huán)境水域中非點(diǎn)源污染，特別是糞便污染的來(lái)源；2)正確評(píng)估非點(diǎn)源污染水體的污染貢獻(xiàn)率；3)明確各已知污染源與病原微生物和污染危害之間的相關(guān)性；4)用于預(yù)測(cè)各已知污染源污染物的遷移化規(guī)律和擴(kuò)散途徑。微生物源示蹤的具體方法可分為依賴(lài)數(shù)據(jù)庫(kù)型(library-d印endent methods, LDMs)和非依賴(lài)數(shù)據(jù)庫(kù)型(library-ind印endent methods, LIMs)兩大類(lèi)。LDMs方法是利用不同宿主來(lái)源指示微生物(如五cWi)表型或基因型的差異建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，并參照數(shù)據(jù)庫(kù)信息判別未知宿主來(lái)源的指示菌，從而追溯糞便污染的來(lái)源；包括抗生素耐藥法、脂肪酸分析法、核糖體法、脈沖場(chǎng)電泳法、rep-PCR指紋分析法等。LIMs方法主要依賴(lài)于宿主特異性分子標(biāo)記的檢測(cè)，關(guān)鍵在于篩選針對(duì)不同動(dòng)物宿主的特異性標(biāo)記。目前研究較為成熟且應(yīng)用廣泛的是LDMs，然而此類(lèi)方法需要大量菌株的分離純化及相關(guān)特性數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，耗時(shí)耗力且具有區(qū)域局限性；因此，基于宿主特異性標(biāo)記檢測(cè)的LIMs方法越來(lái)越受到關(guān)注。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，宿主特異性擬桿菌屬(ifecteroiW^) 16S rRNA基因標(biāo)記的檢測(cè)可有效用于指示人源和動(dòng)物源糞便污染，是一種理想的LIMs方法。已有研究篩選得到特異性指示人、狗、牛和豬糞便污染的fecteroii/a^^s 16S rRNA基因標(biāo)記(Kildare et al.， 2007，Water Res. 41:3701 - 3715; Layton et al., 2006, App1. Environ. Microbiol. 72:4214 - 4224; Mieszkin et al. , 2009, App1. Environ. Microbiol. 75:3045 -30 ),而特異性指示禽糞便污染的fecteroii/a^^ 16S rRNA基因標(biāo)記未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析禽糞便擬桿菌屬(Macteroidales) 16S rRNA 序列，獲得一種特異性指示禽糞便污染的基因標(biāo)記Av-Bac，最終將該基因標(biāo)記應(yīng)用于水體中禽源糞便污染的溯源。一種特異性指示禽糞便污染的基因檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟
a)從水域中提取待測(cè)水樣DNA;
b)用熒光定量PCR擴(kuò)增樣品DNA;其中，引物核苷酸序列為 正向引物 Av-BacF: 5’- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’
反向引物 Av-BacR 5 ’ -CGCCCATTGACCAATA-3 ’
探針序列為FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ；
c)將上述擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列與下述核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)
Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGM CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，
若二者核苷酸序列相同，且該序列平均濃度為每毫升樣品中含2. 5士0. 3 Iogltl拷貝，則該水域判斷為受禽糞便污染的水域。進(jìn)一步地，步驟b中，熒光定量PCR反應(yīng)的引物濃度為300 nmol，探針濃度為200 nmol ο步驟b 中，熒光定量 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火、延伸階段收集熒光信號(hào)。本發(fā)明還提供了一種用于上述基因檢測(cè)方法的引物，其特征在于，該引物序列為正向引物 Av-BacF: 5，- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3，；反向引物 Av-BacR: 5’ -CGCCCATTGACCAATA-3’。本發(fā)明中的基因標(biāo)記Av-Bac是通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析得到，具體方法如下 (一)擬桿菌屬UacteroiWe1S) 16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析
采集我國(guó)東海近岸部分海域周?chē)饕B(yǎng)殖禽類(lèi)和海鳥(niǎo)糞便樣品，并提取糞樣DNA ； 利用引物Bac32F/Bac708R選擇性擴(kuò)增Bacteroichles 16S rRNA基因，獲得禽源 Bacteroidales 16S rRNA基因文庫(kù)；將23個(gè)代表性序列與GenBank中16S rRNA序列同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)，并獲得1個(gè)禽類(lèi)特異性序列聚類(lèi)簇Cluster A。(二)特異性指示禽糞便污染基因標(biāo)記(Av-Bac)的引物與序列特征
根據(jù)上述Cluster A中的序列比對(duì)，設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR檢測(cè)的引物和探針， Av-BacF: 5’ - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’ Av-BacR: 5' -CGCCCATTGACCAATA-3‘ Av-BacProbe FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA
上述引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為103 bp，即為特異性指示禽糞便污染基因標(biāo)記Av-Bac，其核苷酸序列為
5’-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3， (三)應(yīng)用Av-Bac熒光定量PCR檢測(cè)樣品的特異性評(píng)價(jià)
將Av-Bac標(biāo)記用于熒光定量PCR檢測(cè)58個(gè)已知來(lái)源的糞樣(包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝、海鳥(niǎo)來(lái)源)，real-time PCR反應(yīng)時(shí)Av-BacF/ Av-BacR最佳濃度為300 nmol， Av-BacProbe 最佳濃度為 200 nmol。最佳反應(yīng)程序?yàn)?5 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火、延伸階段收集熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，禽類(lèi)樣品中均能特異性擴(kuò)增103 bp大小的條帶，Av-Bac標(biāo)記的平均濃度為每克糞樣中含6. 8士0. 4 Iogltl拷貝；而在其他動(dòng)物糞便中無(wú)特異性條帶。利用此基因標(biāo)記進(jìn)行水體的禽源糞便污染溯源可保證100%的準(zhǔn)確率。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)將基因標(biāo)記Av-Bac用于水體中禽源糞便污染(非點(diǎn)源污染)的溯源，具有顯著的宿主特異性，正確判別率可達(dá)100%。(2)用基因標(biāo)記Av-Bac可定量檢測(cè)禽糞便污染情況，從而能正確評(píng)估其污染貢獻(xiàn)率。(3)采用Av-Bac基因標(biāo)記檢測(cè)水體的糞便污染屬于微生物源示蹤(MST)方法中的非依賴(lài)數(shù)據(jù)庫(kù)型(LIMs)，無(wú)需菌株的分離培養(yǎng)及特征數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力， 且不受地域限制。


圖1是基于禽源擬桿菌屬16 S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(雞源FcB，鴨源 FdB，鵝源FgB，海鳥(niǎo)源SgB)。圖2是禽源Av-Bac標(biāo)記的real-time PCR擴(kuò)增曲線。圖3是Real-time PCR檢測(cè)部分已知來(lái)源的糞樣Av-Bac基因標(biāo)記的電泳圖。其中，泳道1、4和8為雞源，泳道9和10為鴨源，泳道14為鵝源，泳道17為海鳥(niǎo)源)。
具體實(shí)施例方式1.樣品采集及DNA提取
采集我國(guó)東海近岸部分海域(寧波、舟山、象山港、杭州灣)周?chē)饕B(yǎng)殖禽類(lèi)(雞、鴨、 鵝)和海鳥(niǎo)糞便樣品，每種禽糞30份。取無(wú)菌采便棒插入新鮮糞便中，確保采便棒兩側(cè)小孔滯納一定量糞便，將采便棒放入無(wú)菌試管內(nèi)并做好記錄，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室并在M h內(nèi)進(jìn)行處理。樣品命名為雞源FcBl-30，鴨源FdBl-30，鵝源FgBl-30，海鳥(niǎo)源SgBl-30。每個(gè)樣品取 250 mg (濕重)采用 FastDNA spin kit for soil (MP Biomedical)試劑盒提取 DNA。2. ^MBacteroidales 16S rRNA 基因文庫(kù)構(gòu)建
禾丨J 用引物 Bac32F: 5' -AACGCTAGCTACAGGCTT-3 ‘ /Bac708R: 5' -CAA TCGGAGTTCTTCGTG-3，從提取的DNA樣品中選擇性擴(kuò)增fecieroiWes 16S rRNA基因。PCR 反應(yīng)條件為94 ° C 5 min, 94 ° C 30 sec, 61 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec，30個(gè)循環(huán)； 72 ° C 延伸 7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) QiaQuick gel purification (Qiagen)試劑盒純化后，克隆至pCR2. 1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F，。藍(lán)白斑篩選獲得69個(gè)陽(yáng)性克隆，挑陽(yáng)性菌落于 37 ° C、130 rpm下振蕩培養(yǎng)M h后離心收集，保存于-20 ° C待測(cè)序。3. Bacteroidales 16S rRNA 序列進(jìn)化分析
序列測(cè)定由上海英俊(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司測(cè)序部完成。用^^仙此??！吐v. 4. 8軟件編輯原始16S rRNA基因克隆序列，然后利用DOTUR軟件分析克隆序列。具有洲的序列差別者定義為分類(lèi)操作單元(即Operational taxonomic unit，簡(jiǎn)稱(chēng)OUT)。在選取 OTU的同時(shí)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行飽和曲線分析。每個(gè)OTU中選取1個(gè)克隆序列(如果該OTU含有的克隆序列多于1個(gè))做為代表序列，共獲23個(gè)代表性序列。將其與NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取相似度最高的同源序列作為參照序列。將選取的同源參照序列和本研究所得OTU代表序列結(jié)合在一起。然后通過(guò)Bioedit軟件包中的 ClustalW將序列對(duì)齊，并將對(duì)齊后的序列文件轉(zhuǎn)為MEGA 4. O軟件的文件輸入格式。最后用 MEGA 4. O軟件做系統(tǒng)進(jìn)化分析。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)，迭代運(yùn)算1000次。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示有1個(gè)禽類(lèi)特異性序列聚類(lèi)簇Cluster A (圖1)。該聚類(lèi)簇包含了本研究獲得的11個(gè)OTU序列，其中FdB22、FgBM和SgB15與GenBank中已知的雞特異性標(biāo)記同源性達(dá)95%以上；FcB18、SgBlO和FdB23與已知的鵝特異性標(biāo)記同源性達(dá)99%以上；FdB7和FdB13與已知的鴨特異性標(biāo)記同源性達(dá)93%以上；SgB21與已知的海鳥(niǎo)特異性標(biāo)記同源性達(dá)99%。因此，根據(jù)Cluster A設(shè)計(jì)禽類(lèi)相關(guān)特異性基因標(biāo)記。4.特異性指示禽糞便污染基因標(biāo)記(Av-Bac)的獲得
將Cluster A中飽Bacteroidales 16S rRNA部分序列(OTU)進(jìn)行比對(duì)，以同源的片段設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的引物和探針。用于real-time PCR檢測(cè)的引物和探針，核苷酸序列為 Av-BacF: 5’ - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’
Av-BacR: 5' -CGCCCATTGACCAATA-3‘ Av-BacProbe FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA。上述引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為103 bp，即為特異性指示禽糞便污染基因標(biāo)記Av-Bac， 其核苷酸序列為
5’-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，。實(shí)施例1 已知來(lái)源糞樣real-time PCR檢測(cè)Αν-Bac標(biāo)記的特異性
將Av-Bac標(biāo)記用于熒光定量PCR檢測(cè)58個(gè)已知來(lái)源的糞樣(包括豬、牛、羊、狗、 雞、鴨、鵝、海鳥(niǎo)來(lái)源)，real-time PCR反應(yīng)時(shí)Av-BacF/ Av-BacR最佳濃度為300 nmol， Av-BacProbe 最佳濃度為 200 nmol。最佳反應(yīng)程序?yàn)?5 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火、延伸階段收集熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，禽類(lèi)樣品中均能特異性擴(kuò)增103 bp大小的條帶，Av-Bac標(biāo)記的平均濃度為每克糞樣中含6. 8士0. 4 Iogltl拷貝；而在其他動(dòng)物糞便中無(wú)特異性條帶(圖3)。利用此基因標(biāo)記進(jìn)行水體的禽源糞便污染溯源可保證100%的準(zhǔn)確率。實(shí)施例2 =Av-Bac標(biāo)記溯源檢測(cè)水環(huán)境中糞便污染的來(lái)源
于東海近岸部分海域(寧波、舟山、象山港、杭州灣)采集水樣共141份，采用FastDNA spin kit for soiKMP Biomedical)試劑盒提取樣品DNA。用熒光定量PCR擴(kuò)增樣品DNA ； 其中，引物核苷酸序列為正向引物Av-BacF 5’ - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’；反向引物 Av-BacR: 5’ -CGCCCATTGACCAATA-3’ ；探針序列為FAM-GAACTGAGACACGGTCC_TAMRA。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列與Av-Bac標(biāo)記核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)
Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，。
結(jié)果顯示，共有27份樣品中可特異性檢測(cè)到103 bp大小的條帶，說(shuō)明禽類(lèi)糞便污染水樣的檢出率為19. 1%，即東海近岸部分海域存在禽糞便污染。Av-Bac標(biāo)記的平均濃度為每毫升水樣中含2. 5±0. 3 Iog1。拷貝。
權(quán)利要求
1.一種特異性指示禽糞便污染的基因檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟a)從水域中提取待測(cè)水樣DNA;b)用熒光定量PCR擴(kuò)增樣品DNA;其中，引物核苷酸序列為正向引物 Av-BacF: 5’- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’反向引物 Av-BacR 5 ’ -CGCCCATTGACCAATA-3 ’探針序列為FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ；c)將上述擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列與下述核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，若二者核苷酸序列相同，且該序列平均濃度為每毫升樣品中含2. 5士0. 3 Iogltl拷貝，則該水域判斷為受禽糞便污染的水域。
2.如權(quán)利要求1所述的基因檢測(cè)方法，其特征在于，步驟b中，熒光定量PCR反應(yīng)的引物濃度為300 nmol，探針濃度為200 nmol。
3.如權(quán)利要求1所述的基因檢測(cè)方法，其特征在于，步驟b中，熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火、延伸階段收集熒光信號(hào)。
4.一種用于權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述基因檢測(cè)方法的引物，其特征在于，該引物序列為正向引物 Av-BacF 5，- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3，；反向引物 Av-BacR 5， -CGCCCATTGACCAATA-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種特異性指示禽糞便污染的基因檢測(cè)方法，包括從水域中提取待測(cè)水樣DNA；用特異性引物熒光定量PCR選擇性擴(kuò)增樣品DNA；將擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列與基因標(biāo)記Av-Bac核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)的步驟。本發(fā)明將基因標(biāo)記Av-Bac用于水體中禽源糞便污染(非點(diǎn)源污染)的溯源，具有顯著的宿主特異性，正確判別率可達(dá)100%。并可定量檢測(cè)禽糞便污染情況，從而能正確評(píng)估其污染貢獻(xiàn)率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102260744SQ20111020271
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者傅玲琳, 王彥波 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)