專利名稱：一種內(nèi)皮細胞生長因子融合蛋白及其在再生醫(yī)學中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用基因重組技術(shù)制備一種內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)與免疫球蛋白Fc (Fe)的融合蛋白(VEGF-Fc)，該融合蛋白可作為基質(zhì)化內(nèi)皮細胞生長因子用于組織工程、再生醫(yī)學相關(guān)的細胞大批量擴增及內(nèi)皮/血管誘導修復等應用研究。
背景技術(shù)：
材料的抗凝血及血管化問題一直是組織工程和再生醫(yī)學研究中所面臨的瓶頸之一，尤其是對于尺寸超過200 μ m的再生組織，血管化的不足會導致細胞氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的供應不足進而導致組織內(nèi)部細胞凋亡1。為了解決這一問題，有專家提出一方面可以在體外移植血管，另一方面可以設計出一種新型生物材料在體內(nèi)誘導血管再生2。然而，血管內(nèi)皮細胞的粘附、增殖和生存能力是實現(xiàn)組織血管再生的重要因素。研究表明，細胞外基質(zhì)可有效調(diào)控細胞行為，如細胞的粘附、增殖、遷移、細胞形貌和細胞間的分化。因此，我們通過研究制備可溶性生物信號分子的細胞外基質(zhì)化，為血管內(nèi)皮細胞的粘附、生長和增殖構(gòu)建良好的細胞外微環(huán)境。人工細胞外基質(zhì)通過模擬天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性，影響細胞生存和生物學功能。人工細胞外基質(zhì)來源主要分為三類天然生物大分子(如膠原、海藻酸、透明質(zhì)酸等)、 化學合成聚合物(如PLA、PGA、PLGA、PEG等)以及近年發(fā)展起來的基因重組型細胞外基質(zhì) (如基質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)依賴型融合蛋白、生長因子型融合蛋白和鈣粘素依賴型融合蛋白)。其中， 天然生物大分子以其良好的生物相容性和生物降解性而廣泛用于組織工程領(lǐng)域。然而，這種細胞外基質(zhì)具有機械性能差，使用過程中不穩(wěn)定的缺點。化學合成聚合物雖然機械性能強，但其生物相容性差，易弓I起免疫應答反應。與前兩種人工細胞外基質(zhì)相比，基因重組蛋白型細胞外基質(zhì)不僅可特異性增強靶細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，而且可用于構(gòu)建一種安全、可控的細胞外微環(huán)境達到調(diào)控細胞的黏附、增殖、遷移等細胞生物學行為的目的。組織工程研究中，VEGF作為促進血管新生的有效特異性活性信號分子，已被廣泛應用于促進新血管的生成3，4。有報道指出，VEGF通過與細胞外受體KDR結(jié)合而激活細胞內(nèi)信號通路，進一步影響內(nèi)皮細胞的粘附、增殖及其功能表達。近年來，已報道了多種固定、緩慢釋放VEGF以提高其生物學活性的生物材料相關(guān)技術(shù)。例如①利用材料的肝素化通過生物親和域物理固定并緩釋VEGF，該方法雖可一定程度上避免VEGF的生物降解，提高 VEGF的生物活性，促進內(nèi)皮細胞的增殖，但這種物理修飾的方法不能定量調(diào)控VEGF的固定及其釋放行為1，5；②利用化學鍵合交聯(lián)法固定生長因子，其結(jié)果均顯示出該方法雖能部分改善VEGF持久促進內(nèi)皮細胞增殖及血管再生的性能，但在化學反應過程中會有部分生長因子的固有生物學活性喪失6，7;③利用可注射水凝膠包埋而達到生長因子持續(xù)釋放的目的，進而起到誘導人血管內(nèi)皮細胞形成毛細血管的作用。但利用這種方法，生長因子仍然以可溶性狀態(tài)存在且其半衰期僅為4小時，VEGF的生物活性仍有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，針對改善內(nèi)皮細胞生長微環(huán)境的研究，利用基因重組技術(shù)，提供一種可基質(zhì)化的內(nèi)皮細胞生長因子融合蛋白(即VEGF-Fc融合蛋白)并開發(fā)其在再生醫(yī)學中的應用。本發(fā)明旨在提供含有目的基因(VEGF、Fe)的真核細胞蛋白表達基因質(zhì)粒，如 pcDNA3. I-VEGF-Fc,以及由所述的基因質(zhì)粒制得的VEGF-Fc融合蛋白。該融合蛋白不僅提高了生長因子的穩(wěn)定性，并可作為一種可基質(zhì)化內(nèi)皮細胞生長因子提高組織工程、再生醫(yī)學相關(guān)生物材料的內(nèi)皮細胞特異親和性，改善材料快速誘導內(nèi)皮/血管修復等功能。本發(fā)明提供的含有目的基因(VEGF、Fe)的真核細胞表達基因質(zhì)粒，是采用基因重組PCR技術(shù)擴增目的基因VEGF和Fc序列，并分別通過雙酶切連接并嵌入真核細胞表達基因質(zhì)粒載體(如PCDNA3. 1)中，得到含有雙功能目的基因(VEGF-Fc)片段的真核細胞表達基因質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種可基質(zhì)化應用的內(nèi)皮細胞生長因子融合蛋白(VEGF-FC)，由所述的基因質(zhì)粒經(jīng)真核細胞基因轉(zhuǎn)染、表達及蛋白A親和層析色譜柱分離純化而制得。本發(fā)明還提供了一種上述VEGF-Fc融合蛋白做為細胞外基質(zhì)固定化的內(nèi)皮細胞生長因子的應用，其通過物理包埋或(/及)疏水作用用于材料本體或(/及)材料表面修飾， 提高材料的親水性，改善材料的生物相容性。其使用濃度范圍為lOng/ml-lOOOng/ml。其中，上述VEGF-Fc融合蛋白通過Fc可在疏水材料表面自組裝分子層的作用，將 VEGF-Fc融合蛋白有序固定于疏水材料表面，實現(xiàn)VEGF的基質(zhì)化固定，提高材料的內(nèi)皮細胞特異親和性，促進內(nèi)皮細胞的黏附、增殖；并可用于普通細胞培養(yǎng)皿表面修飾及大批量擴增VEGF受體陽性表達的內(nèi)皮細胞。其具體方案如下
(1)將純化后的VEGF-Fc融合蛋白用PBS稀釋至lOng/ml-lOOOng/ml，浸泡疏水性生物材料(如聚苯乙烯培養(yǎng)板)；
(2)在4°C至 37°C，孵育 0. 5-24h.
(3)棄上清，用PBS淋洗1-3遍，除去未穩(wěn)定固定的融合蛋白VEGF-Fc ；
(4)在疏水性生物材料表面使融合蛋白VEGF-Fc基質(zhì)化進行內(nèi)皮細胞培養(yǎng)。通過細胞表面VEGF受體的介導，促進VEGF受體陽性表達細胞與基質(zhì)化VEGF-Fc 融合蛋白的特異性粘附，改善生物材料的細胞特異親和性，提高其細胞的增殖及分化功能的表達。并可用于促進誘導干細胞向內(nèi)皮細胞定向分化、快速誘導材料表面內(nèi)皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料誘導血管新生的能力。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果
一，本發(fā)明利用基因工程原理和技術(shù)手段，將內(nèi)皮細胞生長因子與免疫球蛋白Fc段融合，制備了具有VEGF和Fc雙功能的融合蛋白。二，本發(fā)明通過免疫球蛋白Fc片段使VEGF以有活性的二聚體形式存在，一方面提高VEGF的穩(wěn)定性，另一方面利用Fc段與蛋白質(zhì)A特異性結(jié)合利于融合蛋白的后期純化。三，本發(fā)明的融合蛋白通過Fc的可通過疏水作用自組裝形成單分子層，實現(xiàn)疏水材料表面固定修飾，在材料表面形成一種基質(zhì)化內(nèi)皮細胞生長因子，提高材料的親水性，改善材料的生物相容性，加強了內(nèi)皮細胞與材料的特異性相互作用。四，本發(fā)明的VEGF-Fc融合蛋白通過基質(zhì)化固定可以有效的促進內(nèi)皮細胞的粘附、增殖和分化功能表達，不僅可促進材料的快速內(nèi)皮化，提高材料抗凝血性能，同時還可促進實現(xiàn)組織工程、再生醫(yī)學相關(guān)種子細胞的批量擴增。五，本發(fā)明的VEGF-Fc融合蛋白提高內(nèi)皮細胞生長因子的活性，并通過基質(zhì)化固定可促進干細胞向內(nèi)皮細胞的定向誘導分化，改善材料的血管新生誘導能力。

圖1是重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖2是重組質(zhì)粒鑒定。①DNA分子標記；②質(zhì)粒載體PCDNA3. I-Fc (6112bp);③重組質(zhì)粒 pcDNA3. I-VEGF-Fc 經(jīng) BamHI 和 NotI 雙酶切(573bp，6112bp)； 圖3是純化融合蛋白鑒定；
圖4是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化用于細胞培養(yǎng)示意圖； 圖5是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對內(nèi)皮細胞粘附的影響；
圖6是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對內(nèi)皮細胞增殖的影響。A 培養(yǎng)液中添加VEGF-Fc融合蛋白促進血管內(nèi)皮細胞增殖；B =VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化固定改善其促進內(nèi)皮細胞增殖的生物活性；
圖7是VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對血管內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響(A:聚賴氨酸鋪板；B 聚賴氨酸鋪板培養(yǎng)液中添加生長因子VEGF ；C 聚賴氨酸鋪板培養(yǎng)液中添加VEGF-Fc融合蛋白；D =VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化固定鋪板；a’，b’，C’和d’分別是a，b, c和d圖中方框處放大圖)；
具體實施方式
實施例1
本發(fā)明研究的基本策略是利用基因重組技術(shù)將人血管內(nèi)皮生長因子和免疫球蛋白Fc 段進行融合，得到含有目的基因(VEGF、Fe)的質(zhì)粒pcDNA3. I-VEGF-Fc0以pET28A-VEGF質(zhì)粒為模板，利用合成的引物特異性擴增VEGF基因。1%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，將膠回收PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHl V和AfoiI雙酶切后，插入pcDNA3. 1 BamHl V和NotY位點之間(圖1)。重組表達質(zhì)粒經(jīng)BamHI和NotI雙酶切電泳鑒定，顯示切出與目的基因大小一致的DNA片段(573bp)，將此質(zhì)粒載體命名為pcDNA3. I-VEGF-Fc (圖 2)。實施例2
將實例1構(gòu)建的含有目的基因的質(zhì)粒pcDNA3. I-VEGF-Fc轉(zhuǎn)染293F細胞，收集細胞上清液，利用rProtein A FF柱對VEGF - Fc融合蛋白進行純化。純化的融合蛋白利用抗VEGF 抗體通過免疫印跡檢測，圖中沒有其他非特異性曝光條帶出現(xiàn)，只有一條與預計分子量大小(46KD)相似的條帶。此結(jié)果說明，本發(fā)明制備得到了 VEGF-Fc融合蛋白(圖3)。將得到的融合蛋白修飾疏水材料表面形成一種內(nèi)皮細胞生長因子融合蛋白基質(zhì)用于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)，如示意圖(圖4)所示。
實施例3本發(fā)明通過MTT法檢測在不同修飾的聚苯乙烯培養(yǎng)皿表面內(nèi)皮細胞的黏附情況，進而考察VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)對內(nèi)皮細胞粘附的影響。以聚苯乙烯培養(yǎng)板粘附細胞為100%，接近81. 25%的細胞能黏附到VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化表面修飾的培養(yǎng)板上；而只有17. 5%的細胞黏附到涂有IgG的培養(yǎng)板上。結(jié)果表明VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化，其可通過VEGF受體介導顯著提高血管內(nèi)皮細胞的粘附(圖 5)。 實施例4
本發(fā)明中通過細胞增殖實驗進一步表明與溶液中添加VEGF相比，溶液中添加 VEGF-Fc融合蛋白可有效促進內(nèi)皮細胞的增殖且隨培養(yǎng)時間的延長VEGF-Fc融合蛋白可以更好的維持細胞增殖活性(圖6)。我們可以得出結(jié)論=VEGF-Fc融合蛋白可有效延長VEGF 在體外的生物活性，VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化可以持久地促進內(nèi)皮細胞增殖。實施例5
本發(fā)明中利用免疫熒光染色技術(shù)進一步評價了 VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化對內(nèi)皮細胞生長形態(tài)的影響(圖7)。比較內(nèi)皮細胞分別培養(yǎng)于聚賴氨酸修飾培養(yǎng)板、聚賴氨酸修飾培養(yǎng)板并于培養(yǎng)基中分別添加VEGF、VEGF-Fc融合蛋白，以及VEGF-Fc融合蛋白修飾培養(yǎng)板形成的VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化表面，其結(jié)果表明黏附于VEGF-Fc融合蛋白基質(zhì)化表面的內(nèi)皮細胞表達更多的肌動蛋白纖維且在觀察時間范圍內(nèi)(48h)細胞形態(tài)穩(wěn)定，細胞骨架緊密排列，形成類似血管內(nèi)皮層緊密排列的結(jié)構(gòu)；而黏附于聚賴氨酸修飾且培養(yǎng)基中添加VEGF的內(nèi)皮細胞，在培養(yǎng)早期細胞伸展良好且出現(xiàn)胞間連絲，但在培養(yǎng)48小時之后，這些細胞的胞間連絲消失。
參考文獻
1.Chen Lj He Zj Chen B，Yang Mj Zhao Y，Sun W, Xiao Zj Zhang Jj Dai J. Loading of VEGF to the heparin cross-linked demineralized bone matrix improves vascularization of the scaffold. J Mater Sci Mater Med. 2010;21 (1):309—17.
2.Chiu LLj Radisic M. Scaffolds with covalently immobilized VEGF and Angiopoietin—1 for vascularization of engineered tissues. Biomaterials· 2010; 31 (2) : 226-41.
3.Vempati P， Mac Gabhann F， Popel AS. Quantifying the Proteolytic Release of Extracellular Matrix-Sequestered VEGF with a Computational Model. PLoS One. 2010 Jul 29;5 (7):ell860.
4.Kleinheinz J， Jung S， Wermker K， Fischer C， Joos U. Release kinetics of VEGF165 from a collagen matrix and structural matrix changes in a circulation model. Head Face Med. 2010 Jul 19;6:17.
5.Steffens GCj Yao C，Prevel P，Markowicz M，Schenck P，Noah EMj Pallua N. Modulation of angiogenic potential of collagen matrices by covalent incorporation of heparin and loading with vascular endothelial growth factor. 2004;10 (9-10):1502-9.6.I. Zachary. VEGF signalling: integration and endothelial cell biology. Biochemical Society Transactions.
7.Lim SM, Oh SH, Lee HH, Yuk SH, Im GI, Lee factor-releasing nanoparticle/hydrogel system for engineering. J Mater Sci Mater Med. 2010;21 (9):2593-600.
multi-tasking in 2003;31(6):1171-8 JH. Dual growth cartilage tissue
權(quán)利要求
1.一種表達血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和免疫球蛋白Fc (Fe)融合蛋白的基因質(zhì)粒，即利用基因工程手段將VEGF和Fc結(jié)構(gòu)域基因重組構(gòu)建真核細胞表達VEGF和Fc雙功能融合蛋白的基因質(zhì)粒。
2.—種VEGF-Fc融合蛋白，由權(quán)利要求1所述的基因質(zhì)粒經(jīng)真核細胞基因轉(zhuǎn)染、表達及分離純化而制得。
3.—種權(quán)利要求2所述的VEGF-Fc融合蛋白的應用，用于材料本體或材料表面修飾，提高材料的親水性，改善材料的生物相容性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于用于提高材料的內(nèi)皮細胞特異親和性，促進內(nèi)皮細胞的黏附、增殖及批量擴增。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于用于促進誘導干細胞向內(nèi)皮細胞定向分化、快速誘導材料表面內(nèi)皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料誘導血管新生能力。
全文摘要
本發(fā)明利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了一種內(nèi)皮細胞生長因子VEGF與免疫球蛋白G的Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(VEGF-Fc)。該融合蛋白一方面可以更好地維持VEGF的生物活性，延長其半衰期，另一方面將其通過疏水作用固定于二、三維生物材料的本體或其表面，改善材料的生物相容性及其與內(nèi)皮細胞的特異親和性，促進內(nèi)皮細胞的黏附、增殖及誘導干細胞向內(nèi)皮細胞定向分化，提高材料抗凝血及誘導血管新生的生物活性。
文檔編號C12N5/071GK102260702SQ20111020253
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日 公開號201110202533.發(fā)明者于美華, 杜鳳移, 楊軍 申請人:南開大學