專利名稱：玉米轉錄因子ZmWRKY33基因的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及玉米轉錄因子基因的功能及其應用。
背景技術：
全世界約有三分之一的土地為鹽堿地，在鹽脅迫下，植物生長緩慢，新陳代謝受到強烈抑制，嚴重時出現鹽斑，萎蔫，甚至是植株死亡的情況，顯而易見，土壤鹽漬化嚴重影響了農業(yè)生產和生態(tài)環(huán)境。干旱、高鹽會造成植物不同程度的脫水，引起植物體內一系列的生理代謝變化，所以又將干旱、高鹽等非生物脅迫稱為水分脅迫，或滲透脅迫。植物應答滲透脅迫的過程是一個涉及到多基因、多信號途徑、多基因產物的復雜過程，大體上可將這些基因及其表達產物分成兩類，即功能蛋白和調節(jié)蛋白。功能蛋白是指在抵抗?jié)B透脅迫中直接起作用的蛋白質；而調節(jié)蛋白是在逆境中參與各種信號轉導或調控基因表達，間接起保護作用的蛋白，主要包括傳遞信號和調控基因表達的轉錄因子等。植物在逆境脅迫下可誘導合成大量抗逆的化合物和蛋白質，這些與抗逆境相關的化合物和蛋白質又受轉錄因子在轉錄水平上的調控.轉錄因子可以通過與順式作用元件結合，啟動抗逆相關功能基因的轉錄，通過抗逆功能基因的表達使植物作出適應逆境脅迫的代謝調整。近年來，在提高作物抗逆性的分子育種中，研究重點已逐漸從改良個別基因轉到改良或增強一個或多個發(fā)揮關鍵作用的轉錄因子上，這樣能促使多個功能基因發(fā)揮作用，以期獲得綜合抗逆性狀改良的植物。植物WRKY家族轉錄因子能夠與(T) TGAC (C/T)序列(又稱W-box)發(fā)生特異性作用，調節(jié)啟動子中含W-box元件的功能基因或調控基因的表達，從而參與植物的各種抗逆性反應。目前有關WRKY家族轉錄因子的研究大部分來自水稻和擬南芥，而其它物種的研究報道不多。電子克隆(in silico cloning)是近年來伴隨著基因組計劃和EST計劃發(fā)展起來的基因克隆的新方法。其原理是利用日益發(fā)展的生物信息學技術，借助電子計算機的巨大運算能力，通過EST或基因組的序列組裝和拼接，再利用RT-PCR的方法快速地獲得新基因。本發(fā)明以玉米為研究材料，以擬南芥中與抵抗高鹽有關的轉錄因子WRKY33為查詢序列，同源搜索玉米核苷酸數據庫，通過生物信息學的方法找到玉米中與抵抗非生物脅迫有關的WRKY轉錄因子基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供玉米轉錄因子為MXTJJ基因的序列及功能，并進一步公開了該基因的應用。本發(fā)明通過對基因在玉米受高鹽脅迫時的表達模式判斷，該基因可能參與植物抗逆途徑。根據該基因的序列設計引物，利用RT-PCR技術從玉米品種鄭單958總 cDNA中擴增得到基因。利用農桿菌蘸花法轉化到野生型擬南芥植株中，并研究其在擬南芥體內的抗逆功能，為ZmWRKY33基因在其他植物上的應用提供了很好的基礎。本發(fā)明所述的玉米基因可用于植物轉化，提高植物的耐鹽能力。本發(fā)明還公開了一種提高植物耐鹽能力的方法，即利用玉米基因轉化目標植物，從而獲得轉基因植物。所述的提高植物耐鹽能力的方法，包括下述步驟
(1)用電子克隆的方法獲得玉米轉錄因子基因ZmWRKY33,
(2)用RT-PCR獲得玉米ZfflTMTJJ基因片段，
(3)將基因片段構建到質粒載體中，
(4)利用電擊法將步驟(3)得到的帶有的質粒轉化農桿菌，
(5)將帶有轉化質粒的農桿菌采用蘸花法轉化目標植物，
(6)目標植物轉基因陽性苗的鑒定。本發(fā)明步驟(2)是根據基因的序列設計如下引物 L3 :5，-ATGGCGTCCTCCACGGGGAGCTT-3，(SEQ ID NO. 1),
R3 :5’ -CTAGCAGAGGAGCGAGTCGACGAAC-3，(SEQ ID NO. 2)；
利用RT- PCR技術從玉米總cDNA中擴增得到基因全長cDNA(開放閱讀框部分)。本發(fā)明根據ZmWRKY33基因的cDNA序列設計如下檢測引物 1497幾5，-GTGGTCCAGACGATGAGCGACAT -3，(SEQ ID NO. 3), 1497JR: 5，- GCTGCTCAGCATCTCCAGGGTGT -3，(SEQ ID NO. 4)。檢測玉米經過NaCl處理后體內ZmWRKY33基因的表達情況。結果表明ZmWRKY33 受NaCl誘導表達。
本發(fā)明步驟(3 )是將擴增得到的ZmWRKY33基因片段克隆到pCAMBIA_1304 (AF234300. 1)(購買于上海皓嘉生物科技有限公司)載體中，構建的新載體命名為 pZmWRKY33。為了更好的表達外源基因，還可在pZmWRKY33載體的多克隆位點處兩側插入了煙草的染色質附著SAR序列，這有利于轉基因的穩(wěn)定遺傳及表達；外源基因的表達單元內， 在目的基因的兩側導入了 BamH I和Mc I酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV 35S啟動子 + TMV Omega leader sequence控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表達，作為轉基因植物的篩選標記基因。本發(fā)明利用電擊法將構建好的雙元載體pZmWRKY33導入根癌農桿菌中，根癌農桿菌菌株為EHA105。通過農桿菌蘸花法將耐鹽相關的轉錄因子基因轉化到擬南芥中，然后驗證了轉基因擬南芥對鹽脅迫的耐受能力得到提高。本發(fā)明的基因是能夠針對性調控植物耐鹽能力提高的轉錄因子基因； 且該抗逆基因來自植物本身，對環(huán)境影響較小。本發(fā)明通過對基因轉化擬南芥進行該基因的功能研究，獲得效果如下 1.獲得了對鹽脅迫有較高耐受性的轉基因擬南芥植株。2. ZmWRKY33基因具有抵抗鹽脅迫逆境的功能，為利用該基因在其他植物上的應用而提高植物抗逆性提供了理論依據及利用價值。


圖1 ZmWRKY33與其它物種WRKY家族轉錄因子保守區(qū)的氨基酸序列同源性比對。 完全相同的氨基酸用黑色方框表示，WRKY結構域以下劃線所示。圖2 ZmWRKY33與其它WRKY轉錄因子氨基酸序列比對后所作進化樹。ZmWRKY33 與其它單子葉植物的WRKY轉錄因子，如水稻的0sWRKY53和小麥的TaWRKYH分在一個分支；與ZmWRKY33親緣關系最近的雙子葉植物WRKY轉錄因子是擬南芥的AtWRKY33和煙草的 NtffRKYU NtffRKY2
圖3 ZmWRKY33基因在高鹽誘導時的表達譜變化情況。ZmWRKY33基因在受到鹽脅迫1 小時后表達量開始升高，到12小時到達頂峰。圖4 T1代轉基因擬南芥植株的PCR檢測。M :DL2000 Marker ；1, 2 野生型植株； 3-14 =T1代轉基因植株。圖5野生型和轉基因擬南芥對200mM NaCl脅迫的反應。左邊為野生型植株，白線右邊為轉基因植株。圖6野生型和轉基因擬南芥對50mM NaCl脅迫的反應。黑線左邊為野生型植株， 黑線右邊為轉基因植株。
具體實施例方式實施例1 玉米轉錄因子ZfflTMTJJ的電子克隆
登陸公共數據庫NCBI主頁(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)，搜索到擬南芥中與抵抗高鹽脅迫有關的轉錄因子WRKY33的氨基酸序列，以此氨基酸序列為查詢探針，用NCBI的 tblastn程序同源搜索NCBI的玉米EST數據庫。將在玉米EST數據庫中得到高度同源EST 序列用CAP程序拼接成重疊群(contig)；以此重疊群作為查詢探針，重新搜索NCBI的玉米 EST數據庫，將獲得的同源EST與原重疊群重新拼接為新的重疊群，從而使原重疊群的兩端得到延伸；重復上述過程，直至重疊群不能再往兩端延伸；將最后得到的重疊群用NCBI的 ORF finder程序預測ORF (開放閱讀框)的可能范圍，從而獲得全長cDNA序列中編碼蛋白質的序列。由電子克隆得到的玉米轉錄因子^MXTJJ的核苷酸序列和推測的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。實施例2 玉米轉錄因子ZfflTMTJJ的分子克隆
取三葉一芯期玉米幼苗，品種為鄭單958 (購于揚州市田源種業(yè)有限公司)，液氮速凍， 放置_70°C冰箱中保存以備提取總RNA。總RNA抽提采用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒提取·玉米 cDNA 的合成按 Fermentas 公司的 Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作進行第一鏈合成。以上述試劑盒合成的cDNA第一鏈為擴增模板，以設計的L3 5’ -ATGGCGTCCTCCACGGGGAGCTT -3，(SEQ ID NO. 1)和 R3 5’-CTAGCAGAGGAGCGAGTCGACGAAC -3，(SEQ ID N0. 2)為引物，利用RT-PCR進行cDNA擴增，擴增條件為94°C預熱1 min ； 94°C , 40 s, 58°C , 30 s, 72°C，2 min，共35個循環(huán)。PCR結束后進行電泳分析，采用百泰克公司的DNA回收試劑盒回收約1500 bp的擴增片段。將擴增片段連接到TaKaRa公司的PMD19-T載體，轉化感受態(tài)細胞，挑取白色菌落進行菌落PCR以鑒定陽性克隆，將陽性克隆送到英俊公司測序。根據序列測序結果，到NCBI數據庫里進行序列比對，發(fā)現克隆到的基因序列與WRKY家族轉錄因子同源關系最近，和擬南芥轉錄因子WRKY33有較高同源性，因此我們將其歸入WRKY類轉錄因子，由于該基因是從玉米中克隆出來的，因此將其命名為ZniWRKY33。 ZmffRKY33與WRKY類轉錄因子保守的DNA結合域比對及進化樹分析如圖1和圖2所示。最終獲得與擬南芥轉錄因子WRKY33具有較高同源性的玉米轉錄因子基因ZmWRKY33。實施例3 轉錄因子基因ZniWRKY33在逆境脅迫時的表達譜分析
將生長到四葉一芯期的水培玉米幼苗用于高鹽處理，將玉米幼苗置于250 mM/L的氯化鈉溶液中，分別于0，1，6，12，M小時剪取幼苗葉片，每個時間點至少取10株幼苗， 每株幼苗取第四片充分展開的葉子的葉尖部分(約5厘米)，迅速置于液氮中速凍，并轉移到 70° C冰箱保存，直至RNA抽提。RNA抽提和cDNA的合成如實施例2所述。熒光定量PCR在 ABI 公司的 7500 定量 PCR 儀上進行，以設計的 1497-JL 5，-GTGGTCCAGACGATGAGCGACAT -3，(SEQ ID NO. 3)禾口 1497-R :5，- GCTGCTCAGCATCTCCAGGGTGT -3，(SEQ ID NO. 4)為引物進行熒光定量 PCR，反應條件為94°C 30s; 94°C , 10 s, 63°C , 20 s, 72°C , :34s，采集熒光信號，共40個循環(huán)；60°C to 95°C，每1°C采集一次熒光信號，持續(xù)Is。反應結束后，用ABI 7500自帶的軟件進行分析及繪圖。高鹽處理的表達譜如圖3 所示，經過高鹽處理1小時后，為MXTJJ基因的表達量開始增加，處理12小時后該基因強烈表達，表達量約為未處理時的60倍。 實施例4 轉錄因子基因ZniWRKY33植物表達載體的構建
將玉米cDNA用含BamHI酶切位點的基因擴增引物ML3 5，-CGCGGATCCATGGCGTCCTCCAC GGGGAGCTT-3，(SEQ ID NO. 7)和含
SacI 酶切位點的基因擴增引物 MR3 :5，-TTCGAGCTCGTTCTAGCAGAGGA GCGAGTCGACGAAC-3‘ (SEQ ID NO. 8)進行 RT-PCR 擴增。擴增條件為:94°C 預熱 1 min ； 94°C , 40 s, 58°C , 30 s, 72°C，2 min，共；35個循環(huán)。PCR結束后進行電泳分析，采用百泰克公司的DNA回收試劑盒回收約1497 bp (SEQ ID NO. 5)左右的擴增片段?；厥债a物用 BamHI + Mel雙酶切后，進行電泳分析，再回收約1497 bp (SEQ ID NO. 5)左右的目的片段，將此片段與相應酶切的pCAMBIA-1304載體(AF234300. 1)(購買于上海皓嘉生物科技有限公司)相連，獲得的載體命名為pZmWRKY33。為了更好的表達外源基因，在pZmWRKY33載體的多克隆位點兩側插入了煙草的染色質附著SAR序列，這有利于轉基因的穩(wěn)定遺傳及表達；外源基因的表達單元內，在目的基因的兩側導入了 BamH I和Mc I酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙 CAMV 35S 啟動子 + TMV Omega leader sequence 控制；CAMV 35S+TMV Omega leader sequence控制Hyg抗性基因的表達，作為轉基因植物的篩選標記基因。實施例5 農桿菌培養(yǎng)和植物轉化
農桿菌菌株為根癌農桿菌EHA105菌株。質粒pZmWRKY33經電擊法導入農桿菌中。挑取單菌到25 ml YEB培養(yǎng)基(50mg/l利福平)培養(yǎng)過夜，取5 ml菌液轉接到100 ml YEB培養(yǎng)基(50mg/l利福平)，培養(yǎng)至0D600 = 0. 7-0. 8，菌液冰上放置10 min, 5000 rpm離心10 min，4°C，收集菌體，加入100 ml無菌雙蒸水清洗兩次。加入4 ml 10%甘油懸浮菌體，轉到50 ml離心管。5500 rpm離心10 min，4°C。收集菌體,加入500 μ 10%甘油懸浮菌體， 轉到1. 5 ml離心管。取70μ1感受態(tài)細胞，加入 μ 重組質粒pZmWRKY33。用去頭的槍頭混勻，轉到0.1cm電擊杯中。電擊參數200Ω，1.7 KV, 2. 5F，電擊后立即加入800μ1 SOC培養(yǎng)液。培養(yǎng)1小時后，取ΙΟΟμΙ涂抗性板篩選轉化子，28°C培養(yǎng)。植物轉化采用蘸花法將含目的質粒的農桿菌單菌落接種在5 ml含對應抗生素的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。取5 ml菌液轉到500 ml的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16- h (OD=L 5-2. 0)。液體可以在4°C保存30天。室溫下離心收集菌體，4000 g離心10 min。 用等體積5%的新鮮蔗糖溶液懸浮。加入0. 02%的Silwet-77混勻后置于燒杯中。轉化時將擬南芥倒置后浸入菌液中約10 s，蓮座和花序都要侵染，侵染后使吸附于植株上的菌液空氣干燥3-5秒，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤環(huán)境，水平放置22°C下避光培養(yǎng)，24 h后去掉保鮮膜直立培養(yǎng)。農桿菌菌株用300 ml轉化，轉2-3盆。隔7天后再轉化1次。轉化后不要放置在高溫和強光下，揭開保鮮膜后要保持一定濕度，再生長1個月后收種子。利用50 Pg/mL潮霉素對收獲的種子進行轉化植株篩選，獲得Ttl代轉基因植株，用同樣的方法篩選獲得T1代轉基因植株。實施例6 轉基因擬南芥陽性植株的鑒定
采用SDS酚-氯仿法微量提取擬南芥基因組DNA，其步驟如下
1.取兩片幼嫩葉片(約0.2g)，剪碎裝入2ml的離心管中，置于液氮中冷卻，用筷子搗碎至粉末狀；
2.加入700μ1的抽提緩沖液Α，輕輕混勻后，于65°C水浴30min(每5min上下顛倒混勻一次)；
3.取出稍冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿(各350μ1)，上下顛倒充分混勻，抽提 IOmin ；
4.12000rpm,離心5min，吸取上清到一新的離心管中；
5.加0.7倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫放置lOmin，可見絮狀沉淀；
6.12000rpm,離心lOmin，棄去上清；
7.加入700μ1的70%的乙醇清洗沉淀；
8.12000rpm,離心5min,棄去上清；
9.室溫下晾干；
10.加入30μ1的TE溶液溶解，37°C溫浴60min后，-20°C保存。取 μ DNA作為模板，以實施例2中的引物進行PCR擴增，擴增條件為94°C預熱 1 min ；940C , 40 s, 58°C , 30 s, 72°C，2 min，共；35 個循環(huán)。如圖 4 所示，以 T1 轉基因擬南芥DNA為模板，能擴增出長度為1497bp的目的片段，證明目的基因已經整合入擬南芥基因組中。實施例7 轉錄因子基因ZniWRKY33轉化擬南芥后的耐鹽性分析
在進行高鹽處理時，先將在固體MS培養(yǎng)基上生長了一個月的擬南芥植株轉移到含有 1/10液體MS培養(yǎng)液的水培裝置緩苗7天，待其充分適應水培環(huán)境后，再用200mM NaCl溶液取代培養(yǎng)液，對野生型和轉基因植株進行高鹽脅迫。如圖5所示，在鹽脅迫30分鐘后，野生型植株均已經發(fā)生萎蔫并呈現出倒伏狀，而轉基因植株則影響相對較小，呈現出輕微的傾斜但沒有倒伏，直到鹽脅迫90分鐘后，轉基因植株才發(fā)生倒伏。將倒伏后的野生型植株和轉基因植株放回清水中恢復生長，轉基因植株在清水中恢復生長15分鐘后就已經從倒伏狀態(tài)恢復成直立狀態(tài)，轉基因植株比野生型植株表現出更快的恢復速度，而此時的野生型植株則剛剛開始表現出恢復的跡象，但仍然處于倒伏的狀態(tài)，直到在清水中恢復生長70分鐘后，才恢復到原來的直立狀態(tài)。上述試驗結果表明，在遭受到高鹽脅迫時，轉基因擬南芥比野生型擬南芥表現出更強的脅迫耐受性，而且在鹽脅迫處理終止后，轉基因擬南芥比野生型擬南芥表現出更快的恢復速度。 此外還采用濃度為50mM的NaCl溶液對水培條件下的野生型和轉基因植株進行較長時間的鹽脅迫處理，鹽脅迫7天后，將它們重新置于清水環(huán)境中進行恢復培養(yǎng)。如圖6所示，在遭受50mM NaCl溶液脅迫7天后，野生型植株的葉片表現出嚴重的萎黃現象，部分植株并已死亡，而轉基因植株雖有部分葉片發(fā)生萎黃，但大部分植株的葉片及莖干仍保持綠色并在鹽脅迫后存活了下來。
權利要求
1.HZmWRKY33基因用于植物轉化，提高植物的耐鹽能力。
2.一種提高植物耐鹽能力的方法，是用玉米基因轉化目標植物，獲得轉基因植物。
3.根據權利要求2所述的提高植物耐鹽能力的方法，其特征在于包括下述步驟(1)用電子克隆的方法獲得玉米轉錄因子基因ZmWRKY33，(2)用RT-PCR方法獲得玉米為膠足FJJ基因片段，(3)將基因片段構建到質粒載體中；(4)利用電擊法將步驟(3)得到的帶有的質粒轉化農桿菌，(5)將帶有轉化質粒的農桿菌采用蘸花法轉化目標植物，(6)目標植物轉基因陽性苗的鑒定。
4.根據權利要求3所述的提高耐鹽能力的方法，其特征在于步驟(3)是將Z〃#MTJJ基因片段克隆到pCAMBIA-1304載體中，得到載體pZmWRKY33。
5.根據權利要求3所述的提高耐鹽能力的方法，其特征在于所述的目標植物是擬南
全文摘要
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種與玉米耐鹽相關的轉錄因子基因及其應用。該基因為玉米WRKY家族轉錄因子基因ZmWRKY33,該玉米ZmWRKY33基因用于植物轉化，提高植物的耐鹽能力。可用于其他作物的抗逆轉基因應用。該抗逆基因來自植物本身，對環(huán)境影響較小。
文檔編號C12N15/84GK102250946SQ20111019190
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權日2011年7月11日
發(fā)明者鄧德祥, 陳建民, 高勇, 黎華 申請人:揚州大學