專利名稱：一種茶黃素單體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種茶黃素單體制備新方法，特別是一種利用微生物來源的漆酶在有機體系中將茶多酚通過生物轉化而制備茶黃素單體之一的新方法。
背景技術：
茶黃素(TFs)最早在紅茶中發(fā)現(xiàn)的，但含量很少，只占茶葉干物質的0.3-1.5%， 但對紅茶的色香味和品質起著決定性作用。早在上世紀六十年代我國學者樓福慶等就發(fā)現(xiàn)茶黃素具有抗動脈粥樣硬化與促纖溶作用。近年來大量的研究表明，茶黃素具有極強的生理活性和廣泛的藥理功能，被譽為茶葉中的腦黃金。茶黃素重要的藥理功效引起國內外研究者極大的興趣，越來越多的科技工作者對茶黃素進行深入研究，不僅得到了茶黃素的多種單體，還掌握了茶黃素的藥效機理，并且發(fā)現(xiàn)了茶黃素更多的功能，其主要功能和應用領域有一、對心腦血管疾病方面的功效，主要表現(xiàn)為調節(jié)血脂、抗凝、促纖溶、降低血粘度、抗氧化、改善微循環(huán)、對動物心肌細胞急性缺血損傷有保護作用等。二、抗菌消炎，茶黃素及其單體在0. 6mg/ml的濃度下對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、 志賀細菌均有顯著的抑制作用；三、抗氧化劑，可用于清除自由基，已被應用于化妝品中。另外，茶黃素還具有抑制腫瘤生長，抑制艾滋病病毒轉錄功效，研究表明，茶黃素及沒食子酸酯對艾滋病毒的逆轉錄酶及各種細胞的DNA和RNA聚合酶活性有抑制作用。茶黃素及其單體不僅抑制逆轉錄酶，而且抑制人體DNA聚合酶α、β、γ以及大腸桿菌的RNA 聚合酶。茶黃素強大的藥理功效已被應用到多個領域，目前已有茶黃素的保健藥品，抗氧化劑制品及腫瘤和艾滋病的輔助治療用品，隨著功效應用的研究和臨床試驗的深入，茶黃素將被應用到更廣泛的領域。隨著人們生活水平的提高，對身體健康越來越重視。而茶黃素降血脂、防治心血管病、抗氧化、延緩衰老等作用顯著，又具有抗腫瘤、抗病毒等功效，成為影響人們生活質量的重要產(chǎn)品，被人們接納。目前，國內外市場對茶黃素需求旺盛，僅依靠自紅茶中提取天然茶黃素不能滿足市場需要。目前，國內人工合成茶黃素的方法有采用K3Fe(CN)6等化學氧化法將茶多酚轉化為茶黃素、采用多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)等游離酶發(fā)酵生產(chǎn)茶黃素、利用固定化技術將酶固定化后進行催化合成茶黃素。這些技術方法工藝工業(yè)化能力差；操作程序復雜，產(chǎn)物茶黃素得率低，生產(chǎn)成本高；副產(chǎn)物復雜，而且產(chǎn)生大量的廢水，環(huán)境污染嚴重。曲文娟等對茶黃素的形成機理和制備方法進行了深入的研究，認為只有B環(huán)上有兩個鄰位羥基的兒茶素(即茶多酚)和B環(huán)上有三個鄰位羥基的兒茶素同時存在時，通過氧化兩鄰醌B環(huán)之間偶聯(lián)形成茶黃素。因此茶黃素是含有二羥基苯駢卓酚酮(1' ,2' -二羥基-3，4-苯駢卓酚酮)的一類化合物，無論是酶促氧化或化學氧化，結構和生物活性相同 (《食品工業(yè)科技》Vol. 27. No. 06，2006)。
現(xiàn)有的制備方法無論是酶促氧化法還是化學氧化法，所得到的茶黃素均為多種單體的混合物。李大祥等研究表明，人工制備的茶黃素主要含以下三種單體茶黃素(R1 = R2 =H)、茶黃素-3-單沒食子酸酯(RpR2中一為H、另一為沒食子?；?、茶黃素_3，3'-雙沒食子酸酯(RpR2均為沒食子酰基)，三者的比例為11 52 36 (《安徽農(nóng)業(yè)大學學報》， 2006，33(1) :87-89)。由此可見茶黃素的上述各種生物活性主要取決于茶黃素_3_單沒食子酸酯(TF-3-G)。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有茶黃素制備方法的缺陷，旨在提供一種酶法催化氧化茶多酚制備茶黃素單體的方法，所要解決的技術問題是遴選高選擇性的酶，通過酶促氧化得到一種主要單體茶黃素-3-單沒食子酸酯(TF-3-G)。本發(fā)明所稱的茶黃素單體是分子量為715. 1的茶黃素-3-單沒食子酸酯 (TF-3-G)。本發(fā)明遴選的酶是以真菌靈芝(Ganoderma Lucidum)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到的漆酶。本發(fā)明的技術方案以茶多酚為原料，包括漆酶的制備和茶多酚的氧化以及分離、 濃縮等單元過程，與現(xiàn)有技術的區(qū)別是所述的漆酶的制備是將靈芝真菌接種到液體種子培養(yǎng)基中于20-60°C條件下培養(yǎng)5-7天得到種子發(fā)酵液，經(jīng)離心分離得到酶活為3-10000U/L 漆酶粗酶液；然后將活力為3-10000U/L漆酶粗酶液以1 20-30的體積比加入質量百分濃度1-3%茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空氣作為催化氧化的氧氣來源，30-60°C水浴振蕩，轉速為30-300轉/分鐘，10-40min，接著超聲振蕩l-2min。所述的液體種子培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含玉米粉6-18g、酶母膏8-12g、葡萄糖8-12g、NaH2P04l_2g。反應結束后經(jīng)真空旋轉蒸發(fā)回收乙酸乙酯。然后用4-甲基-2-戊酮(IBMK)作為萃取劑萃取TF-3-G至少兩次，合并萃取液，蒸干IBMK即得到TF-3-G粉末，純度達到95% (HPLC 法)，分子量 715. 2 (LC-MS 法)。本發(fā)明使用真菌靈芝菌發(fā)酵而來的漆酶催化氧化茶多酚生成單體茶黃素TF-3-G， 而且純度高，從而解決了現(xiàn)有技術中難以直接制備茶黃素單體的難題，本方法工藝簡單，過程中所使用的有機溶劑均回收利用，基本無廢水，綠色環(huán)保。
四

圖 1 是 TF-3-G HPLC 圖譜。圖 2 是 TF-3-GLC-MC 圖譜。
五具體實施例方式1、漆酶的制備靈芝菌種購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院菌種保藏中心。每升水中加入玉米粉7g 酵母膏l(xiāng)og、葡萄糖10g、NaH2PO4L 5g配制液體培養(yǎng)基，接種量1平方厘米菌塊，20-60°C條件下培養(yǎng)5-7天得到種子發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心IOmin后取上清液為粗酶液，酶活力測定。2、漆酶的檢測
漆酶酶活測定以愈創(chuàng)木酚為底物，3mL反應混合液中，含50mmol/L琥珀酸鈉緩沖液(pH = 4. 5)，lmmol/L底物和0. 6mL粗酶液(發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心IOmin后取上清液作為粗酶液)，25°C水浴保溫反應30min，于300nm處測定吸光度(300nm處愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)ξ 465 = 1. 21 X IO4L · πιοΓ1 · cm-1)，以100°C滅活的粗酶液與測酶緩沖液混合為對照。酶活定義為每分鐘內催化氧化1 μ mol愈創(chuàng)木酚的酶量為1個酶活單位(U)。本發(fā)酵液酶活為3U/L。3、茶黃素單體TF-3-G的制備將活力為3U/L漆酶以1 20的體積比加入質量百分濃度1-3%茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空氣作為催化氧化的氧氣來源，35-45°C水浴振蕩，轉速為30-300轉/分鐘， 15-25min，接著超聲振蕩l-2min，反應結束后經(jīng)真空旋轉蒸發(fā)回收乙酸乙酯。然后用4-甲基-2-戊酮(IBMK)作為萃取劑萃取TF-3-G，至少兩次，萃取率為90%。合并萃取液蒸干 IBMK即得到TF-3-G粉末純度達到95%4、茶黃素單體TF-3-G HPLC以及LC-MS檢測條件和結果采用高效液相(HPLC，waters600 controller ；C18 色譜柱 05mmX46mm))分析標準樣品和酶促反應產(chǎn)物。結果如圖1所示。采用A、B兩相梯度洗脫，A相是2%的乙酸，B相是乙腈-乙酸乙酯(21 3,v/v)；流動相A在保留時間35min內線性梯度變化為82-74%。 進樣量10 μ 1，流速為0. 8mL/min，柱溫為40°C，檢測波長為^Onm。結果如圖2所示。
權利要求
1.一種茶黃素單體的制備方法，以茶多酚為原料，包括漆酶的制備和茶多酚的氧化以及分離、濃縮和萃取各單元過程，其特征在于所述的漆酶的制備是將靈芝真菌接種到液體培養(yǎng)基中于20-60°C下培養(yǎng)5-7天得到種子發(fā)酵液，經(jīng)離心分離得到酶活為3-10000U/L 的漆酶粗酶液；所述的液體培養(yǎng)基是每升培養(yǎng)基中含玉米粉6-18g、酶母膏8-12g、葡萄糖 8-128力&!12 041-28;所述的茶多酚氧化是將上述粗酶液以1 20-30的體積比加入質量百分濃度1-3%茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空氣作為催化氧化的氧氣來源，30-60°C水浴振蕩 10-40min,然后超聲振蕩l-2min，反應結束后旋轉蒸發(fā)乙酸乙酯，加入萃取劑4-甲基_2_戊酮得到萃取液，脫去萃取劑得到茶黃素單體TF-3-G。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于液體培養(yǎng)基為玉米粉7g/L、酶母膏 10g/L、葡萄糖 10g/L、NaH2PO4L 5g/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于茶多酚氧化時的條件為35-45°C水浴振蕩 15_25min0
全文摘要
一種茶黃素單體的制備方法，以茶多酚為原料，由靈芝真菌通過液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的含有漆酶的粗酶液以1∶20-30的體積比加入質量百分濃度1-3％茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空氣作為催化氧化的氧氣來源，30-60℃水浴振蕩10-40min，然后超聲振蕩1-2min，反應結束后旋轉蒸發(fā)乙酸乙酯，加入萃取劑4-甲基-2-戊酮得到萃取液，脫去萃取劑得到茶黃素單體TF-3-G。純度達95％。
文檔編號C12R1/645GK102286565SQ201110156318
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權日2011年6月10日
發(fā)明者吳佳慧, 尹若春, 王林 申請人:安徽大學