專利名稱：一組引物及其在家蠶微孢子蟲的快速檢測方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子診斷和鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組特異性引物及其在家蠶微孢子蟲的快速檢測方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微孢子蟲(Microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物。由家蠶微孢子蟲iNoseim力ο 知cis，簡稱N. b)寄生家蠶引起的家蠶微粒子病，是蠶桑生產(chǎn)上危害嚴(yán)重而又長期得不到根治的傳染性疫病，并嚴(yán)重制約著蠶絲業(yè)的健康穩(wěn)定的發(fā)展。19世紀(jì)中葉曾因該病的蔓延，給歐洲的蠶絲業(yè)帶來了毀滅性的破壞；上個(gè)世紀(jì)初家蠶微粒子病也給中國、日本、印度等養(yǎng)蠶國帶來了極大地危害。自Nageli首次發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲(以下簡稱N.b)以來，世界各地又陸續(xù)從家蠶體內(nèi)分離出多種不同種屬的微孢子蟲(汪忠康.家蠶異形微孢子蟲與交叉?zhèn)魅?江蘇蠶業(yè)，2001, (2) 19-21 ；Takeshi Kawarabata. Biology of microsporidians Infecting the Silkworm, Bombyx mori, in Japan. Journal of Insect Biotechnology and Sericology, 2003，72: 1-32)。且研究發(fā)現(xiàn)，其它昆蟲來源的微孢子蟲也能感染家蠶(黃旭華，朱方容，劉吉平等.廣西菜粉蝶微孢子蟲對家蠶的病原性研究.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40 (4) 415-419)。近年來我國原種超毒淘汰的比例逐年增加的趨勢相對明顯。大體上，每生產(chǎn)1萬張?jiān)N，因檢測出家蠶微孢子蟲而淘汰近1000張， 而剩余的帶毒合格的和無毒合格的基本各占50%，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)上千萬元，且這個(gè)比例還是發(fā)生在條件和技術(shù)相對較好的桑蠶原種場內(nèi)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，全國桑蠶微粒子病發(fā)生情況調(diào)研資料匯編，2010)。因此探討實(shí)用的檢測蠶感染家蠶微孢子蟲技術(shù)，尤其是開展對家蠶微孢子蟲的快速診斷技術(shù)研究，為系統(tǒng)預(yù)防和控制家蠶微粒子病提供重要技術(shù)依據(jù)，提高蠶種檢疫的質(zhì)量，對家蠶微粒子病的防治具有重要的科學(xué)意義。目前國內(nèi)外蠶種生產(chǎn)環(huán)節(jié)的檢測檢疫工作主要是針對家蠶微粒子病病原微孢子蟲的檢驗(yàn)，世界各養(yǎng)蠶國均將家蠶微粒子病列為檢疫對象。目前實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)建立的新檢測方法有顯微鏡鏡檢法(王玉強(qiáng)，柞蠶微孢子蟲侵染甜菜夜蛾的生物學(xué)特性研究，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文.2009 ；劉吉平，曾玲.CalcofIuor White M2R熒光染色法識別家蠶微孢子蟲.昆蟲學(xué)報(bào)，2007，50(11):1185-1186)、免疫學(xué)檢測法(梅玲玲，金偉.SPA-協(xié)同凝集反應(yīng)快速鑒別微孢子蟲孢子的研究.蠶業(yè)科學(xué)，1988，2:110-111;劉吉平，盧鏗明，徐興耀等.單抗免疫金銀染色法診斷家蠶微抱子蟲的研究.廣東蠶業(yè)，1995，29 (3) 30-35 ； 李艷紅，謝儷，潘國慶等，家蠶微孢子蟲抗體免疫熒光檢測方法的建立及應(yīng)用.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006，沘(6):990-993)10 技術(shù)(劉吉平，曹陽，Smith J. E等.模擬感染家蠶微粒子病的PCR分子診斷技術(shù)研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37 (12): 1925-1931 )、核酸分子雜交方法(蔡平鐘，邱寶利，周鵬.PCR和核酸雜交檢測家蠶微孢子蟲的研究(摘報(bào)). 四川蠶業(yè)，2000, 28(4) 15)等。但是，上述檢測方法均都存在耗時(shí)費(fèi)力、特異性不強(qiáng)且不適于野外檢測等缺點(diǎn)，不利于實(shí)際生產(chǎn)上廣泛地推廣和使用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是日本學(xué)者Notomi等(2000)發(fā)明的一種新型體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸判斷的技術(shù)。隨著 LAMP技術(shù)的發(fā)展，LAMP技術(shù)在農(nóng)林畜牧業(yè)上的應(yīng)用取得不俗的成績，已成功應(yīng)用LAMP 技術(shù)檢測家畜、家禽病病毒以及水產(chǎn)品病病毒等(李啟明，馬學(xué)軍，高寒春等.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)在H5W禽流感病毒基因檢測中的應(yīng)用.病毒學(xué)報(bào),2008, 24(3)179-184 ；Tereza C Cardoso, Heitor F Ferrari, Livia C Bregano et al. Visual detection of turkey coronavirus RNA in tissues and feces by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) with hydroxynaphthol blue dye. Molecular and Celluar Probes, 2010，24:415-417),LAMP法存在特異性強(qiáng)，快速、高效，敏感性高，操作簡便，檢測方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，肉眼即可判斷結(jié)果， 從而簡化了檢測過程，比PCR法靈敏1(Γ1000倍，檢測時(shí)間也大大縮短。但是基于關(guān)鍵技術(shù)的限制，尤其是引物的設(shè)計(jì)以及與引物相關(guān)的檢測試劑的技術(shù)問題，目前尚未見應(yīng)用LAMP法檢測家蠶微孢子蟲的相關(guān)技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有家蠶微孢子蟲檢測技術(shù)的不足，提供一組特異性引物， 基于本發(fā)明引物，結(jié)合本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)可制備得到應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)家蠶微孢子蟲的LAMP法快速檢測的相關(guān)試劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述引物在家蠶微孢子蟲的快速檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
基于本申請人多年來對家蠶微孢子蟲的研究實(shí)驗(yàn)和針對性分析總結(jié)，成功地設(shè)計(jì)一組特異引物，并選擇家蠶微孢子蟲Qi力ο 知cis)擬假基因rDNA序列作為本發(fā)明LAMP檢測的靶基因，建立了家蠶微孢子蟲的LAMP檢測方法，所述檢測方法新型、快速、特異性高，依據(jù)本方法可有效地檢測家蠶微孢子蟲。具體地，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
根據(jù)Genbank公布的N. b rRNA擬假基因序列(登錄號D14632)，使用在線軟件Jrimer ExplorerV3(http//primerexplorer. jp/elamp3. 0. O /index, html)設(shè)計(jì)一組特異性 LAMP 檢測用引物，包括引物F2、B2、FI2和BI2，分別具有SEQ ID N0:1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。將所述引物的核苷酸序列(5，-3，)分別描述如下
F2 GGTTTTCTTGAAACTAGTTCTGT ； B2 GGTGAATTTTTAACTACTTTGATGG ； FI2 TTCCAGCGTCGTTGATTCGC-CATGAATGAGTTGATGCAGTA ； BI2 CGAATACACTTACCGTCTAGGTCA-ATCATGTTGCTTCTTCATCG。本發(fā)明同時(shí)提供了所述引物應(yīng)用于制備LAMP法檢測家蠶樣本微孢子蟲用的試劑方面的應(yīng)用。所述檢測家蠶樣本微孢子蟲的方法包括以下步驟
(1)采用煮沸沉淀法抽提待測樣本的模板DNA；
(2)以登錄號為D14632的擬假基因rDNA序列為靶基因，采用權(quán)利要求1所述的引物， 對步驟(1)制備的家蠶樣本模板DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)；
(3)將步驟(2)所述LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入IyL10000 X SYBR Green I染色檢測。
步驟(1)所述樣本模板DNA的抽提采用煮沸沉淀法，具體是取待測的感染家蠶微孢子蟲0 bombycis)的家蠶樣本中腸于研缽中，液氮研磨后，取200 μ L研磨液于無菌的 1.5 mL離心管中；12000 r/min，離心5 min，棄上清，留孢子沉淀備用；
加IOOyL裂解液于上述孢子沉淀中，混勻后，煮沸10 15 min，所述DNA裂解液為取 9 mL IM Tris-HClCpH 8. 0),1. 8 mL 0. 5M EDTAU8 mL 5M KCl禾口90 mL 1% Triton X-100 混勻后，用ddH20定容至900 mL。優(yōu)選地，所述DNA裂解液可先置于110°C溫度下電熱鼓風(fēng)干燥箱中孵育10 15 min。將煮沸后的裂解液和孢子沉淀混合液在12000 r/min條件下離心10 min,取上清， 即為檢測用DNA溶液，置_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。步驟(3)所述LAMP反應(yīng)25 μ L反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)2. 5 μ L IOXThermopol Buffer (20 mM Tris-HCl, ρΗ8· 8 ；10 mM KCl ；2 mM MgSO4 ；20 mM (NH4)2SO4 ；0. 1% Triton X-100 ； )；2. 8 mM dNTPs (三磷酸脫氧核糖核苷酸);1 M 甜菜堿；6 μ L 25 HiMMgCl2 ；40 pmol FI2/BI2 (正向內(nèi)引物/反向內(nèi)引物)、5pmol F2/B2 (正向外引物/反向外引物)；2 μ L Template DNA (DNA 模板)；1 μ L Bst DNA polymerase (Bst DNA 聚合酶)(8U);ddH20 補(bǔ)至25 μ L0反應(yīng)條件為63°C水浴60 min ；最后95°C，2 min滅活。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明克服現(xiàn)有家蠶微孢子蟲檢測技術(shù)的不足，將LAMP方法應(yīng)用于家蠶微粒子病檢測；通過分析對比多個(gè)靶基因，最終選定家蠶微孢子蟲0 bombycis) 16S-rDNA的擬假基因作為目的檢測基因；根據(jù)目的檢測基因，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成出若干組引物， 并對這些引物的有效性、特異性、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行模擬和實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，綜合考慮各種影響因素，提供一組特異的引物；本發(fā)明很好地應(yīng)用LAMP法，不使用PCR儀器，只需要水浴鍋等提供恒溫的設(shè)備，通過直觀的顯色反應(yīng)就可以肉眼鑒別檢測樣本是否感病。本發(fā)明尤其適于小量樣本操作，操作簡單，僅需0.2 mL家蠶組織含Λ(力ο 知eh微孢子蟲液。使用本發(fā)明方法采用煮沸沉淀法快速抽提家蠶微孢子蟲0 力ο 知cis)制備的DNA樣品能夠滿足LAMP方法對家蠶微孢子蟲0 力ο 知cis)進(jìn)行分子診斷的需要，結(jié)合設(shè)計(jì)的特異性引物和適宜的檢測條件，為應(yīng)用LAMP技術(shù)進(jìn)行家蠶微孢子蟲(M bombycis)的早期檢測和預(yù)知檢查提供重要基礎(chǔ)和技術(shù)儲備。


圖1 CTAB法抽提家蠶微孢子蟲N. bombycis的模板DNA檢測結(jié)果； 圖2煮沸沉淀法抽提家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA檢測結(jié)果；
圖3 CTAB法抽提家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA檢測結(jié)果(熒光圖)； 圖4煮沸沉淀法抽提家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA檢測結(jié)果(熒光圖)； 圖5抽提感染家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA染色檢測結(jié)果； 圖6抽提感染家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA染色檢測結(jié)果(熒光圖)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1
本實(shí)施例分別采用CTAB法、煮沸沉淀法制備家蠶微孢子蟲DNA用于LAMP法檢測。本實(shí)施例以家蠶微孢子蟲OVo1Seffl3 bombycis, N. bombycis,簡貨、m (由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常規(guī)的桑葉添食繼代繁殖獲得，也可以采用本領(lǐng)域其他實(shí)驗(yàn)室或者研究院所提供的家蠶微孢子蟲)為材料，分別通過CTAB法、煮沸沉淀法(劉吉平.昆蟲微孢子蟲鑒別技術(shù)及分子系統(tǒng)發(fā)育研究.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，博士學(xué)位論文，2005;陳冬妹， 林英，王艷霞.一種簡便分離高質(zhì)量家蠶基因組DNA的方法.蠶學(xué)通訊，2007，27 O) :5-9) 兩種方法制備N. b DNA模板。1. CTAB法抽提感染家蠶微孢子蟲的模板DNA
取感染家蠶微孢子蟲的家蠶(例如感染所述微孢子蟲的死蠶樣本或檢疫用樣本蠶)的中腸于研缽中，液氮研磨后，取200 μ L孢子液于無菌的1.5 mL離心管中；12000 r/min，離心5 min,棄上清；沉淀用m十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的緩沖液400 μ L重懸(緩沖液10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. 1 mol/L EDTA, pH 8. 0 ；0. 5% SDS，其余體積用水補(bǔ)足)，加入蛋白酶K 20 μ L，然后在振蕩器上振蕩20 30 s，60°C水浴4 h以上或過夜；將 PLG (Phase Lock Gel Heavy), 12000 r/min，離心2min，使膠體沉積與離心管底部；將酶消化后的抽提液從水浴鍋中取出，室溫下冷卻，倒入離心管，加入300 μ L氯仿，混勻后(手動振蕩)，12000 r/min，離心10 min ；將上清液倒入新的1. 5 mL離心管中，加入300 μ L室溫保存的100%異丙醇溶液，混合后置于4°C保溫1 h以上，然后12000 r/min，離心10 min, 棄上清；DNA沉淀用70%乙醇300 μ L洗滌1 2次，然后將離心管倒置，讓其自然晾干；用 50 μ L無菌ddH20溶解DNA沉淀，4°C冰箱保存過夜后，置_20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?.煮沸沉淀法抽提感染家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA
取感染家蠶微孢子蟲的家蠶(例如感染所述微孢子蟲的死蠶)的家蠶中腸于研缽中，液氮研磨后，取200yL研磨液于無菌的1. 5mL離心管中；12000 r/min，離心5min，棄上清； 將 DNA 裂解液(DNA 裂解液取 9 mL IM Tris-HCl (pH 8. 0),1. 8 mL 0. 5M EDTAU8 mL 5M KCl和90 mL 1% Triton X-100混勻后，用ddH20定容至900mL)放于110°C電熱鼓風(fēng)干燥箱中孵育10 15 min ；加100 μ L裂解液于孢子沉淀中，混勻后，煮沸10 15 min ；將混合液12000 r/min，離心10 min，取上清，即為DNA溶液，置_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)施例2
分別采用實(shí)施例1煮沸沉淀法和CTAB法獲得的家蠶微孢子蟲Λ bombycis的模板DNA 進(jìn)行LAMP檢測。根據(jù)Genbank公布的N. b rRNA擬假基因序列(登錄號D14632)，使用在線軟件 Primer ExplorerV3 (http://primerexplorer. jp/elamp3. 0. 0 /index, html)成功設(shè)計(jì) LAMP引物，所述引物的核苷酸序列(5’ -3’)分別為
權(quán)利要求
1.一組應(yīng)用于樣本微孢子蟲快速檢測的引物，其特征在于包括引物F2和B2、FI2和 BI2，分別具有 SEQ ID NO =USEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
2.—種權(quán)利要求1所述引物的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備LAMP法檢測家蠶樣本微孢子蟲用的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述引物的應(yīng)用，其特征在于所述LAMP法檢測家蠶樣本微孢子蟲的方法包括以下步驟(1)采用煮沸沉淀法抽提待測樣本的模板DNA；(2)以登錄號為D14632的擬假基因rDNA序列為靶基因，采用具有SEQID NO :1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的引物，對步驟(1)制備的樣本模板DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)；(3)將步驟(2)所述LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μ L 10000XSYBR Green I染色檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述引物的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)抽提樣本模板DNA包括以下步驟(a)取家蠶樣本的中腸于研缽中，液氮研磨后，取200μ L研磨液于無菌的1.5 mL離心管中；12000 r/min，離心5 min，棄上清，得孢子沉淀備用；(b)加100μ L DNA裂解液于步驟(a)制得的孢子沉淀中，混勻后，煮沸10 15 min ；所述 DNA 裂解液取 9 mL IM Tris-HCl (pH 8. 0),1. 8 mL 0. 5M EDTAU8 mL 5M KCl和 90 mL 1% Triton X-100 混勻后，用 ddH20 定容至 900 mL ；(c)將步驟(b)煮沸后的混合液在12000r/min條件下離心，取上清，即為模板DNA溶液，置-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述引物的應(yīng)用，其特征在于步驟(b)所述DNA裂解液在與孢子沉淀混合之前先置于Iio ！電熱鼓風(fēng)干燥箱中孵育10 15 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述引物的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)所述LAMP反應(yīng)采用25μ L 反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系為2·5 μ L IOXThermopol Buffer (20 mM Tris_HCl，pH8. 8 ;10 mM KCl ；2 mM MgS04 ；20 mM (MM)2SO4 ；0. 1% Triton X-100 ； );2· 8 mM dNTPs ； IM 甜菜堿； 6 yL 25mMMgC12 ； 40 pmol FI2/BI2、5 pmol F2/B2 ； 2 μ L Template DNA ； 1 μ L Bst DNA polymerase(8U);ddH20 補(bǔ)至 25 μ L ；所述反應(yīng)條件為63°C水浴 60 min ；最后 95°C，2 min 滅活。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組引物及其在家蠶微孢子蟲的快速檢測方面的應(yīng)用。所述引物具有SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的核苷酸序列?；诒景l(fā)明引物，結(jié)合本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)可制備得到應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)家蠶微孢子蟲的LAMP法快速檢測的相關(guān)試劑，對家蠶微孢子蟲的LAMP法檢測，快速準(zhǔn)確，適于小量樣本操作，操作簡單，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。
文檔編號C12N15/11GK102260737SQ201110141178
公開日2011年11月30日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者劉吉平, 魏建影 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)