專利名稱：副豬嗜血桿菌pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一種革蘭氏陰性、非溶血性、NAD依賴性細菌，有15個血清型。HPS可引起豬的纖維素性多發(fā)性漿膜炎、多發(fā)性關節(jié)炎、胸膜炎和腦膜炎。該菌自1910年以來就被認為是豬Glasser病的病原體。HPS存在于健康豬的上呼吸道，臨床上主要感染小豬，特別是4周齡 6周齡的斷奶仔豬，臨床特征為急性敗血癥， 往往在感染后2 d死亡。該病同樣會給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。副豬嗜血桿菌病在我國一些養(yǎng)豬基地、養(yǎng)豬專業(yè)戶及農(nóng)戶的豬群中存在，嚴重危害豬群的健康?，F(xiàn)在市場缺少一種能對臨床樣品的副豬嗜血桿菌進行簡便、快捷、靈敏、準確的檢測的試劑盒。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，它可以快速檢測副豬嗜血桿菌，并且簡便、靈敏、準確、特異性強。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，它包括8 12. 5 μ L的PCR premix 緩沖液，25 μ L 超純水，2 3 μ L 的 Marker DL2000，0. 75 2. 0 μ L 濃度為 12pmol/ μ L的上引物及0. 75 2. 0μ L濃度為12ρπιο1/μ L的下引物，25 μ L濃度為20mg/ml的蛋白酶K，20 50 μ L質量濃度為10%的SDS、TE緩沖液，2 μ L陰性對照以及2 μ L陽性對照。PCR premix 緩沖液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L,25mmol/ yL 的 Tris-HCl 及 0.2μ L Taq 酶組成，其 PH 值為 ρΗ8. 3。上游引物的序列號為LPF 5 ‘ -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 '或 LPF 5 ‘-GCTAACTCCGTGCCAGCAG-3 ‘，下游引物的序列號為 LPR 5 ‘ -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3 ‘或 LPR 5' -GTCATCATGGCCCTTACGAG-3‘。陰性對照為非副豬嗜血桿菌的DNA片斷。陽性對照為標準副豬嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物。TE緩沖液包括Tris-HCLlOmM及EDTAlmM組成的混合溶液，混合溶液的PH值為 7. 0 8. O0副豬嗜血桿菌PCR診斷方法的建立 1、材料與方法
1.1材料 1. 1. 1菌株
大腸埃希氏桿菌，沙門氏菌、胸膜肺炎放線桿菌，銅綠假單胞菌，鏈球菌和葡萄菌等均由本實驗室分離保存。1.1. 2酶及試劑
TaqDNA聚合酶、dNTP (mix)、Marker2000購自華美生物工程公司和恒因生物公司，ProteinaseK, RNaseA購自上海華舜生物工程有限公司.乙酸鈉、冰乙酸、乙醇等常用試劑均為國產(chǎn)分析純。犢牛血清、馬血清等由恒因生物公司購入。1.1.2 培養(yǎng)基
含有0. OOS0ZoVB1因子、0. 0025% NADH和5%的馬血清普通瓊脂平板或同樣因子巧克力瓊脂營養(yǎng)平板(即改良巧克力瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基)；TSA培養(yǎng)基，TSB液體培養(yǎng)基。1.2 方法
1. 2. 1直接鏡檢
取肝、脾觸片，革蘭氏染色。副豬嗜血桿菌屬革蘭氏陰性短小桿菌，形態(tài)多變。1.2. 2菌株的培養(yǎng)
培養(yǎng)用營養(yǎng)瓊脂，加入50 mL/L犢牛血清和30 mg/1 50 mg/L的NAD，37 °C培養(yǎng)M h左右后在4 °C進行保存?；驅PS分離株接種于含有V因子和NAD的巧克力瓊脂營養(yǎng)平板上(改良巧克力瓊脂營養(yǎng)基)，恒溫箱中培養(yǎng)18 Mh。1.2. 3 DNA 的提取方法一
挑取少許菌落于1. 5ml離心管中加入TE緩沖液稀釋至微濁，取Iml裝入離心管中9000r/min離心10秒，棄上清，在細菌沉淀管中加入20ulDB液，160ullysozyme和 20ulRNaSeA，徹底振蕩懸浮，3 7 °C溫浴45分鐘，期間來回顛倒離心管數(shù)次。加入400ulDL 和25ul蛋白消化酶K (ProteinaseK)迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。置65°C溫浴 45分鐘，離心1分鐘，取上清液。加入200ul異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混合后，移取 600ul至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。將剩余的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。加入500ulWl液，靜置一分鐘后，離心30秒。將吸附柱放入另外一個收集管中。加入 500ulWl液，離心15秒。棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中。離心1分鐘。將吸附柱移入一個干凈的1. 5ml離心管中。在吸附膜中央加入100 UlTl液，65°C靜置 5分鐘后，離心1分鐘。將1. 5ml離心管(DNA) 4°C保存?zhèn)溆?。方法?br> 挑取數(shù)個菌落懸浮于含100 μ L超純水的小試管中，震蕩混勻，用PCR儀95°C加熱5 min或煮沸6 min后置于冰上冷卻2 min, 12 000 r / min離心1 min，取上清作為PCR反應的粗制DNA模板，置-20 °C保存?zhèn)溆谩?. 2. 4 PCR引物的選擇，設計與合成
根據(jù)GenBank公布的Hps 16 S rRNA基因序列設計特異性引物二對，或查找國外已經(jīng)建立的針對病原菌的單一 PCR方法，選擇特異性敏感性好、樣品制備簡單、PCR擴增產(chǎn)物易于區(qū)分、PCR條件相近、有臨床數(shù)據(jù)參考文獻，采用其中已發(fā)表的引物序列，送由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物1 =LPF 5' -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 ‘；下游引物1:LPR 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3‘,預期擴增片段長度為822 bp。HPS擴增長度為 822 bp。按Haemophilus parasuis 菌株 Bakos B26 16S ribosomal RNA S 基因 ( AY362910)自行設計的一對引物為上游引物 2 :LPF 5' - GCTAACTCCGTGCCAGCAG-3‘， 下游引物2 LPR 5' -GTCATCATGGCCCTTACGAG-3 ‘，預期擴增片段長度為650 bp。并用DNAstar軟件和BLAST分析比較引物的各個參數(shù)和同源性。1.2.5 PCR 擴增
優(yōu)化后的PCR反應條件如下采用25 μ L反應體系。即PCR premix緩沖液8 12. 5 μ UMgCl2 濃度為 3 mmol/ul,500pmol/ul dNTP 2.0 μ L,25 mmol/μ L Tris-HCl 以及 Taq 酶0.2 yL, pH值為8. 3)，濃度為12pmol/μ L的引物2條各0.75 2.0 μ L，菌液模板為0.5 2. OyL，ddH20 (超純水)加至25. 0 μ L0按下列參數(shù)進行PCR反應95 °C預變性5 min，然后94 °C變性30s，60 °C退火30s，72 °C延伸30s，；35個循環(huán)，最后72 °C終延伸 10 min。產(chǎn)物于-20 °C保存?zhèn)溆谩?. 2. 6 PCR產(chǎn)物的檢測
取2 5 μ L擴增產(chǎn)物加入點樣孔子，以100 V電壓，2%瓊脂糖凝膠(含1%溴化乙錠 2 μ L，后改為Goldview)上進行電泳。電泳液用1 XTAE緩沖液。1個小時后在紫外燈下觀察擴增結果，并一次成像拍照。1. 2. 7 PCR檢測方法的應用
采用常規(guī)方法收集病料，對病原進行分離培養(yǎng)，再應用已建立的PCR方法對發(fā)病豬群中的350頭份病例進行檢測。2 實驗
2.1副豬嗜血桿菌PCR檢測方法的優(yōu)化組合，如圖1所示。2. 2 PCR方法的敏感性試驗，如圖2所示。2. 3 PCR特異性檢測，如圖3所示。2. 4 PCR檢測方法對副豬嗜血桿菌貴州地方株的檢測，如圖4所示。3 結果
3.1本試驗用本實驗室保存的動物銅綠假單胞菌菌株和豬常見的細菌如大腸桿菌、豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌、豬附紅細胞病病原等為模板做PCR，僅副豬嗜血桿菌出現(xiàn)特異性DNA闊增帶，證明了該方法的特異性。通過對產(chǎn)物進行純化、轉化、克隆、基因測序，進一步證明PCR特異性。通過DNA的提取，紫外分光光度計測定，實驗室的標準DNA模板的平均0D260值為0. 01022nm,以DNA模板含量為0. 05111 μ g/ μ L按10倍稀釋法進行稀釋后， 取2 μ L進行擴增，則副豬嗜血桿菌DNA濃度依次為103. 2ng, 10. 32ng, 1. 032ng, 103. 2pg, 10. 32pg, 1. 032pg, 103. 2fg, 10. 32fg, 1. 032fg,可檢出的副豬嗜血桿菌DNA模板最低含量為1. 032pg。菌細胞的靈敏度為200個左右。PCR退火溫度為49 60°C ；模板DNA濃度 0. 75 2. 0 μ L0該方法使用的模板DNA，DNA標準樣品和MasterMix使用劑量比同類方法和產(chǎn)品相對較少。此方法對副豬嗜血桿菌病的診斷而言，具有特異、敏感、檢出率高、快速、 簡便、易自動化等突出優(yōu)點。3. 2在根據(jù)病史、臨床癥狀和特征性病變觀察，病料采集、細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定 (微量培養(yǎng)管由恒因生物提供)、間接血凝試驗的基礎上，建立了針對貴州省副豬嗜血桿菌的PCR實驗室檢測方法，并采用該方法對發(fā)病豬群350頭份疑是病例進行PCR檢測，PCR檢出率為8%-49%。同時針對貴陽市南明區(qū)三豬場和本省甕安縣收集的具有代表性血清和病料90頭份進行間接血凝抑制試驗和PCR方法對比試驗，結果表明間接血凝抑制試驗陽性率為30.5%。PCR方法檢出率為36%。PCR方法不僅具有自動化特點，避免血清學方法人為判定帶來的誤差，若采用鼻咽棉拭紙采集病料更可減少對豬造成的傷害。
3. 3該PCR的優(yōu)點是它可以把幾種流行特征、癥狀或病變器官相似的疾病進行鑒別診斷，以提高檢驗效率，降低費用。通過試驗表明實驗室PCR方法已經(jīng)取代了費工費時的生化試驗和血清學監(jiān)測二4個小時內就可以檢出副豬嗜血桿菌，縮短了副豬嗜血桿菌的檢出時間。由于采用了上述技術方案，本發(fā)明對PCR反應條件進行優(yōu)化，采用常規(guī)PCR法取代了費工費時的生化試驗和血清學監(jiān)測，研制了用于檢測副豬嗜血桿菌的的PCR試劑盒，該試劑盒可以檢測副豬嗜血桿菌，適用于副豬嗜血桿菌的檢測、診斷和流行病學調查，能避免人為判定帶來的誤差，更可減少對豬造成的傷害，在M小時內就檢出副豬嗜血桿菌，縮短了副豬嗜血桿菌的檢出時間，具有快速、靈敏性高、特異性強等特點。本發(fā)明檢測結果準確， 并且快捷、靈敏，檢測方式簡單，使用效果好。


附圖1為副豬嗜血桿菌16SrRNA基因片斷PCR優(yōu)化后電泳結果；
M: Marker DL2000 ； 1，PCR 產(chǎn)物(650 bp) ;2，標準菌株 PCR 產(chǎn)物(650 bp) ；3,陰性對眧.
/、、、
附圖2為副豬嗜血桿菌16SrRNA基因片斷PCR敏感性試驗結果； 1 103. 2ng基因片斷PCR產(chǎn)物；2 :10. 32ng基因片斷PCR產(chǎn)物；3 :1. 032ng基因片斷 PCR產(chǎn)物；4 :103.2 pg基因片斷PCR產(chǎn)物；5 :10. 32pg基因片斷PCR產(chǎn)物； 附圖3為副豬嗜血桿菌16SrRNA基因片斷特異性PCR檢測結果； M: Marker DL2000 ；1 大腸埃希氏桿菌；2 沙門氏菌；3 胸膜肺炎放線桿菌；4 鏈球菌；5 葡萄菌；6 豬附紅細胞?。? 動物綠膿桿菌；8 巴氏桿菌；9 鉤端螺旋體；10 滅菌生理鹽水；11 :PCR產(chǎn)物(650bP)；
附圖4為副豬嗜血桿菌貴州地方株16SrRNA基因片斷PCR檢測結果 M =Marker DL2000 ； 1 分離株 HPSl PCR 產(chǎn)物(650 bp) ;2 分離株 HPSl PCR 產(chǎn)物(650 bp);3 分離株HPS2 PCR產(chǎn)物；4 分離株HPS3 PCR產(chǎn)物；5 分離株HPS4 PCR產(chǎn)物；6 陰性樣品； 標準菌株PCR產(chǎn)物(650 bp ) ；8 滅菌雙蒸水。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例1 副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，它包括10 μ LPCR premix緩沖液，PCR premix 緩沖液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L,25 mmol/ μ L的Tris-HCl及0· 2 μ L Taq酶組成，其PH值為ρΗ8· 3 ;25 μ L超純水；2 μ L的 Marker DL2000 ；IyL濃度為12pmol/μ L的上引物及1 μ L濃度為12pmol/μ L的下引物， 上游引物的序列號為LPF 5 ‘ -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 ‘，下游引物的序列號為LPR 5 ‘ -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3 ‘ ；25 μ L 濃度為 20mg/ml 的蛋白酶 K，30 μ L 質量濃度為 10% 的SDS，500 μ L TE緩沖液，TE緩沖液包括Tris-HCLlOmM及EDTAlmM組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7. 3 ；采用2 μ L非副豬嗜血桿菌的DNA片斷作為陰性對照；采用2 μ L標準副豬嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物作為陽性對照。本發(fā)明的實施例2 副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，它包括8 μ LPCR premix緩沖液，PCR premix 緩沖液由 3mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP2. 0μ L，25 mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0. 2 μ L Taq 酶組成，其 PH 值為 ρΗ8. 3 ;25 μ L 超純水；3 μ L 的 Marker DL2000 ；0. 75 μ L濃度為12pmol/y L的上引物及0. 75 μ L濃度為12pmol/y L的下引物， 上游引物的序列號為LPF 5' - GCTAACTCCGTGCCAGCAG-3 ‘，下游引物的序列號為LPR 5 ‘ -GTCATCATGGCCCTTACGAG-3 ‘ ；25 μ L 濃度為 20mg/ml 的蛋白酶 K，20 μ L 質量濃度為 10% 的SDS，500 μ L TE緩沖液，TE緩沖液包括Tris-HCLlOmM及EDTAlmM組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7. 0 ；采用2 μ L非副豬嗜血桿菌的DNA片斷作為陰性對照；采用2 μ L標準副豬嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物作為陽性對照。 本發(fā)明的實施例3:副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，它包括12. 5μ LPCR premix 緩沖液，PCR premix 緩沖液由 3mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP2. OyL, 25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 2 μ L Taq 酶組成，其 PH 值為 ρΗ8. 3 ;25 μ L 超純水；3 μ L 的 Marker DL2000 ；2 μ L濃度為12ρπιο1/μ L的上引物及2μ L濃度為12pmol/y L的下引物，上游引物的序列號為LPF 5' - GCTAACTCCGTGCCAGCAG-3 ‘，下游引物的序列號為LPR 5' -GTCATCATGGCCCTTACGAG-3 ‘ ；25μ L 濃度為 20mg/ml 的蛋白酶 K，50 μ L 質量濃度為 10% 的SDS，500 μ L TE緩沖液，TE緩沖液包括Tris-HCLlOmM及EDTAlmM組成的混合溶液，混合溶液的PH值為8. 0 ；采用2 μ L非副豬嗜血桿菌的DNA片斷作為陰性對照；采用2 μ L標準副豬嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物作為陽性對照。
權利要求
1.一種副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于它包括8 12.5yL的PCR premix 緩沖液，25 μ L 超純水，2 3 μ L 的 Marker DL2000，0. 75 2. 0 μ L 濃度為 12pmol/ μ L的上引物及0. 75 2. 0 μ L濃度為12pmol/ μ L的下引物，25 μ L濃度為20mg/ml的蛋白酶K，20 50 μ L質量濃度為10%的SDS，500 μ L的TE緩沖液，2 μ L陰性對照以及2 μ L 陽性對照。
2.根據(jù)權利要求1所述的副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于PCRpremix緩沖液由 3 mmol/ul 的MgCl2，500pmol/ul 的 dNTP 2. 0 μ L，25mmol/μ L 的 iTris-HCl 及0. 2 μ L Taq酶組成，其PH值為ρΗ8. 3。
3.根據(jù)權利要求1所述的副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于上引物的序列號為 LPF 5 ‘ -GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3 '或 LPF 5 ‘-GCTAACTCCGTGCCAGCAG-3‘，下引物的序列號為 LPR 5' -GGCTTCGTCACCCTCTGT-3‘或 LI3R 5' -GTCATCATGGCCCTTACGAG-3‘。
4.根據(jù)權利要求1所述的副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于陰性對照為非副豬嗜血桿菌的DNA片斷。
5.根據(jù)權利要求1所述的副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于陽性對照為標準副豬嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求1所述的副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，其特征在于ΤΕ緩沖液包括 Tris-HCLlOmM及EDTAlmM組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7. 0 8. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種副豬嗜血桿菌PCR檢測試劑盒，它包括8～12.5μl的PCRpremix緩沖液，25μl超純水，2～3μl的MarkerDL2000，0.75～2.0μl濃度為12pmol/μl的引物2條，2μl陰性對照以及2μl陽性對照。本發(fā)明采用常規(guī)PCR法取代了費工費時的生化試驗和血清學監(jiān)測，研制了用于檢測副豬嗜血桿菌的的PCR試劑盒，該試劑盒可以檢測副豬嗜血桿菌，適用于副豬嗜血桿菌的檢測、診斷和流行病學調查，能避免人為判定帶來的誤差，更可減少對豬造成的傷害，在24小時內就檢出副豬嗜血桿菌，縮短了副豬嗜血桿菌的檢出時間，具有快速、靈敏性高、特異性強等特點。
文檔編號C12R1/21GK102220426SQ201110119828
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權日2011年5月10日
發(fā)明者吳位珩, 徐景峨, 楊茂生, 楊莉 申請人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所