專利名稱：牛Nramp1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種真核表達(dá)載體的構(gòu)建，特別是牛天然免疫力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白I(Nrampl)的吞噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本載體可以作為一種轉(zhuǎn)基因載體應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因抗病動物培育中。
背景技術(shù)：
研究動物機(jī)體抵抗牛結(jié)核分支桿菌(M. bovis)、鼠麻風(fēng)分支桿菌 (M. lepraemurium) > ^fJ # K ^ (Brucella)、 ^ Π ^ (S. typhimurium) RMW W^ (Leishmania spp)等胞內(nèi)寄生病原微生物的侵染機(jī)制，是尋求高效的防治藥物與疫苗和進(jìn)行家畜抗病育種的前提。機(jī)體抵御胞內(nèi)寄生微生物侵染主要依賴于細(xì)胞免疫，即巨噬細(xì)胞吞噬病原體、處理并遞呈抗原至T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞識別抗原后增殖分化，釋放細(xì)胞因子，巨噬細(xì)胞活化清除病原微生物。巨噬細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞與最后的效應(yīng)細(xì)胞在細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮巨大的作用。然而，胞內(nèi)寄生微生物擁有一套抵御巨噬細(xì)胞殺傷的機(jī)制來阻遏機(jī)體對其的清除作用，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，給胞內(nèi)寄生菌疾病的防治工作帶來很大的困擾。1981年，Gros等指出機(jī)體對結(jié)核分支桿菌的易感性是受遺傳因素控制的， 針對與機(jī)體天然免疫相關(guān)蛋白功能的研究遂成為胞內(nèi)寄生菌疾病防治研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。I^iX(5c^2006)通過SSCA法比較荷斯坦奶牛及瘤?；蚪M指出，不同基因型對布魯氏菌的抗性和敏感性差異顯著，這種差異源自荷斯坦牛及瘤牛天然免疫力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白 1 (Nrampl)基因3’UTR區(qū)序列的遺傳變異。牛Nrampl基因是一個(gè)較為保守的基因，位于第二號染色體上，全長約10926bp，含有15個(gè)外顯子，編碼的磷酸糖蛋白位于吞噬細(xì)胞吞噬溶酶體膜上，含有12個(gè)推定的跨膜區(qū)(Feng et al.，1996)，在有吞噬能力的細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞，噬中性粒細(xì)胞)內(nèi)特異性表達(dá)，具有二價(jià)金屬陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。Nrampl可通過外運(yùn)吞噬體內(nèi)病原微生物滿足自身營養(yǎng)代謝或合成防御體系所必須的金屬離子(如狗2+、Mn2+) 而減弱其對吞噬體內(nèi)環(huán)境的抵御能力，同時(shí)，Nrampl的離子轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)可活化巨噬細(xì)胞，引起 “多向性效應(yīng)”(包括NO產(chǎn)生、抗原遞呈、蛋白激酶C產(chǎn)生等功能的上調(diào))，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對病原微生物的殺傷性，從而影響動物對疾病的天然抵抗力。2006年，Pereira-Suarez從感染牛結(jié)核分枝桿菌牛群取樣檢測Nrampl表達(dá)量發(fā)現(xiàn)病畜較健康牛Nrampl表達(dá)量顯著升高；且對比健康人群，患病兒童Nrampl表達(dá)的減弱增加了機(jī)體對結(jié)核病的易感性。提示，機(jī)體對胞內(nèi)寄生菌的抵抗力強(qiáng)弱與Nrampl的表達(dá)存在量依賴關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種牛Nrampl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該載體含有牛Nrampl基因及其調(diào)控序列，可以通過特異性的增強(qiáng) Nrampl的表達(dá)量，從而提高轉(zhuǎn)基因動物的抗病能力。牛Nrampl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體構(gòu)建方法，包括以下步驟Al 血液基因組提取
A2 =Nrampl調(diào)控區(qū)序列的擴(kuò)增，具體包括以下操作，A21 引物設(shè)計(jì)從牛Nrampl 全基因序列結(jié)合其核心啟動子區(qū)序列設(shè)計(jì)含Vsp I和》!0 I酶切位點(diǎn)的引物F 5' -CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3，R 5' -CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’ ；下劃線序列為酶切位點(diǎn)；A22 =PCR反應(yīng)以荷斯坦奶牛外周血基因組為模板，按照 TaKafci公司TaKafci TaqTM使用說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下94°C 3min ；94°C 30s， 60. 8°C 30s, 72°C 2min 20s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C IOmin ；用瓊脂糖凝膠電泳分離待回收的PCR產(chǎn)物，切膠回收；回收產(chǎn)物與pMD 18-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒后用Vsp I及BioI進(jìn)行雙酶切鑒定；酶切正確的質(zhì)粒送樣測序序列正確者命名為PMD18-P ；A3 吞噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體PIRES2-P的構(gòu)建與鑒定pMD18-P與pIRES2-EGFP載體分別用Vsp I及Bio I進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得的目的基因片段與相應(yīng)載體片段用T4DNA連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，選取陽性菌落增菌獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，命名為PIRES2-P ；Α4 牛Nrampl吞噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pIRES2_PN的構(gòu)建與鑒定pIRES2-P與pMD18_N4載體分別用BamH I和Ml I進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得的目的基因片段與相應(yīng)載體片段用T4DNA連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Dffia感受態(tài)細(xì)菌，選取陽性菌落增菌獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，命名為PIRES2-PN。所述的構(gòu)建方法，所屬步驟Al具體操作如下(1)取荷斯坦奶牛外周血血液樣本200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混勻；再次加入200uL的緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液變清亮后瞬時(shí)離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(2)加入200uL無水乙醇，充分振蕩15s，瞬時(shí)離心；(3)將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱CB3中，13400Xg離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(4)向吸附柱CB3中加入500uL緩沖液GD, IMOOXg離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，IMOOXg離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，IMOOXg離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(7) IMOOXg離心aiiin，倒掉廢液，將吸附柱CB3室溫放置lOmin，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液；(8)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加IOOuL洗脫緩沖液TE,室溫放置5min, 13400 X g離心2min ；(9)重復(fù)步驟8 ；(10)獲得的外周血基因組溶液，5uL上樣，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析。根據(jù)上述的構(gòu)建方法獲得的重組載體PIRES2-PN。所述的重組載體pIRES2-PN在轉(zhuǎn)基因抗病動物培育中的應(yīng)用。
本發(fā)明選擇質(zhì)粒pIRES2-EGFP為骨架載體，該載體所含IRES序列不僅可以實(shí)現(xiàn)目的基因與標(biāo)記基因(綠色熒光蛋白)的獨(dú)立表達(dá)，而且兩者的表達(dá)量存在比例關(guān)系一方面減少了綠色熒光蛋白對目的蛋白功能的影響，另一方面更有利于檢測目的蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明在質(zhì)粒pIRES2-EGFP多克隆位點(diǎn)Ml I與BamH I之間插入牛Nrampl開放閱讀框序列，并用Nrampl基因表達(dá)調(diào)控序列替換掉骨架載體上巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子序列(命名為PIRES2-PN)，從而實(shí)現(xiàn)Nrampl基因在吞噬細(xì)胞內(nèi)的特異性表達(dá)。一方面，該載體可以提高Nrampl基因的表達(dá)量；另一方面，該載體啟動子的特異性限制了 Nrampl的表達(dá)范圍，最大程度的減少人工加入基因表達(dá)對轉(zhuǎn)基因動物機(jī)體生命活動的不利影響。本發(fā)明將重組質(zhì)粒PIRES2-PN分別轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞與鼠單核巨噬細(xì)胞系 RAW264. 7中驗(yàn)證重組質(zhì)粒功能轉(zhuǎn)染后的7出現(xiàn)綠色熒光，而轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞并沒有綠色熒光出現(xiàn)；以轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞基因組為模板進(jìn)行Nrampl的開放閱讀框序列擴(kuò)增，有目的條帶出現(xiàn)。說明質(zhì)粒PIRES2-PN中Nrampl的表達(dá)具有特異性。


圖1為外周血總RNA瓊脂糖凝膠電泳；
圖2為Nrampl基因PCR擴(kuò)增；圖3重組質(zhì)粒pMD18-N酶切鑒定；圖4重組質(zhì)粒pIRES2-N酶切鑒定；圖5牛外周血基因組瓊脂糖凝膠電泳；圖6牛Nrampl基因調(diào)控區(qū)序列PCR擴(kuò)增；圖7重組質(zhì)粒pMD18-P酶切鑒定；圖8重組質(zhì)粒pIRES2-P酶切鑒定；1 :Vsp I和Xho I雙酶切后的pIRES2_P ;2 PIRES2-P ；圖9重組質(zhì)粒pIRES2-PN的鑒定；1 =Sal I單酶切后的pIRES2_PN 2 =BamH I和 Sal I雙酶切；3 =Vsp I和Β ο I雙酶切；圖10質(zhì)粒載體pIRES2-EGFP、pIRES2_N、pIRES2_PN轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞株 RAW264. 7 ；圖11重組質(zhì)粒pIRES2-N、pIRES2_PN轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞；圖12重組質(zhì)粒pIRES2-PN轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞單克隆基因組PCR ；圖13重組質(zhì)粒pIRES2-PN示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例INrampl基因片段的分離，擴(kuò)增與測序1. 1總RNA的提取無菌采取秦川牛(陜西楊凌科元生物工程有限公司)頸靜脈血，加入紅細(xì)胞裂解液(Triis-NH4Cl)，混勻4°C作用4 5min (其間反復(fù)輕柔顛倒混勻)除去紅細(xì)胞，待紅細(xì)胞完全破碎，1000r/min離心5min，得到白細(xì)胞沉淀，PBS清洗2 3次，離心沉淀。加入適量TRIzoI試劑，室溫靜置5min，加入l/5TRIzol試劑量的氯仿震蕩混勻室溫靜置5min， 12000r/min 4°C離心lOmin，吸取上清移至新的離心管中，加入等量體積的異丙醇，室溫靜置lOmin，12000r/min 4°C離心IOmin加入75%乙醇清洗2次，離心、沉淀干燥后溶解于適量的DEPC處理水中，瓊脂糖電泳檢測(圖1)。1.2引物設(shè)計(jì)從牛Nrampl基因(GenBank序列號U12862. 1)的完整閱讀框架序列的兩端設(shè)計(jì)含 Sal I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物
F 5'-CCGTCGACTGCGGTCCTCATGTCAG -3' (SEQ ID NO: 1)
R 5'-CCGGATCCTGGTGGGAGCTCATCC -3' (SEQ ID N0:2)下劃線序列為酶切位點(diǎn)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為1660bp。1.3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1. 3. 1引物處理干粉狀的引物在稀釋之前，12000r/min離心30s，然后慢慢地半打開管蓋，加入適量的雙蒸去離子水，制成引物貯存液，分裝后于_20°C保存?zhèn)溆谩?. 3. 2如下配制微量離心管中混合液
組成數(shù)量引物1 uLdNTP1 uL總RNA樣品4uL無RNA酶的雙蒸去離子水添加至IOuL1. 3. 3在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)。65°C，5min后4°C離心數(shù)秒。1. 3. 4如下配制微量離心管中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
組成數(shù)量上述變性、退火反應(yīng)液IOuL5 xPrimerScriptTM Buffer4 uLRNase Inhibitor(40U/ uL)0.5 uLPrimerScriptTM RTase0.5 uL無RNA酶的雙蒸去離子水5 uL1. 3. 5在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)300C IOmin ；45°C 30min ；95°C 5min ；4°C IOmin0
1. 4PCR反應(yīng) 按下表制備50uLPCR反應(yīng)
權(quán)利要求
1.牛Nrampl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 Al 血液基因組提取A2 =Nrampl調(diào)控區(qū)序列的擴(kuò)增，具體包括以下操作，A21 引物設(shè)計(jì)從牛Nrampl全基因序列結(jié)合其核心啟動子區(qū)序列設(shè)計(jì)含Vsp I和》!0 I酶切位點(diǎn)的引物 F :5’ -CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3， R :5’ -CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’ ；下劃線序列為酶切位點(diǎn)；A22 :PCR反應(yīng)以荷斯坦奶牛外周血基因組為模板，按照 TaKafci公司TaKafci TaqTM使用說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下94°C 3min ；94°C 30s， 60. 8°C 30s, 72°C 2min 20s，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C IOmin ；用瓊脂糖凝膠電泳分離待回收的PCR產(chǎn)物，切膠回收；回收產(chǎn)物與pMD18-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒后用Vsp I及BioI進(jìn)行雙酶切鑒定；酶切正確的質(zhì)粒送樣測序序列正確者命名為PMD18-P ；A3 吞噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體PIRES2-P的構(gòu)建與鑒定PMD18-P與pIRES2-EGFP載體分別用Vsp I及)(h0 I進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得的目的基因片段與相應(yīng)載體片段用T4DNA連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)菌，選取陽性菌落增菌獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，命名為PIRES2-P ； A4 牛Nrampl吞噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pIRES2_PN的構(gòu)建與鑒定 PIRES2-P與pMD18-N4載體分別用BamH I和Ml I進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得的目的基因片段與相應(yīng)載體片段用T4DNA連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)菌，選取陽性菌落增菌獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，命名為PIRES2-PN。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所屬步驟Al具體操作如下(1)取荷斯坦奶牛外周血血液樣本200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混勻；再次加入 200uL的緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液變清亮后瞬時(shí)離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(2)加入200uL無水乙醇，充分振蕩15s，瞬時(shí)離心；(3)將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱CB3中，13400Xg離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(4)向吸附柱CB3中加入500uL緩沖液⑶，13400X g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3 放回收集管中；(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，13400X g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，13400X g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；(7)13400 X g離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3室溫放置lOmin，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液；(8)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加IOOuL洗脫緩沖液TE,室溫放置5min, 13400 X g離心2min ；(9)重復(fù)步驟8；(10)獲得的外周血基因組溶液，5uL上樣，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法獲得的重組載體PIRES2-PN。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體在轉(zhuǎn)基因抗病動物培育中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種牛Nramp1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該方法以質(zhì)粒pIRES2-EGFP為骨架載體，在多克隆位點(diǎn)Sal I與BamH I之間插入牛Nramp1開放閱讀框序列，并用Nramp1基因表達(dá)調(diào)控序列替換掉骨架載體上巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子序列，從而實(shí)現(xiàn)Nramp1基因在吞噬細(xì)胞內(nèi)的特異性表達(dá)。本載體可以作為一種轉(zhuǎn)基因載體應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因抗病動物培育中。本發(fā)明還指出秦川牛Nramp1開放閱讀框序列與GenBank中相應(yīng)序列(GenBank序列號U12862.1)相似率為99.88％，存在兩個(gè)堿基差異。
文檔編號C12N15/85GK102226200SQ20111010995
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者張涌, 徐曉彬, 李倩, 王愛華, 胡林勇, 靳亞平 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)