專利名稱：一種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程及生物防治領(lǐng)域，尤其是涉及ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是ー種革蘭氏陽性芽孢桿菌,其菌體為短桿狀、有鞭毛。當(dāng)菌體營養(yǎng)生長到一定階段吋，菌體的一端會(huì)形成芽孢，另一端形成近菱狀的蛋白質(zhì)晶體稱之為伴孢晶體。菌體破裂后可釋放出芽孢和伴孢晶體，伴孢晶體(原毒素)對鱗翅目或雙翅目等多種昆蟲具有毒殺活性。蘇云金芽孢桿菌的伴孢晶體蛋白是目前世界上研究最多、產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的微生物殺蟲劑，具有專ー性強(qiáng)、對人畜無害、防治效果好、易生物降解及無殘毒等優(yōu)點(diǎn)。 人工制備時(shí)，菌種干粉需要經(jīng)過活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)等步驟產(chǎn)生大量的伴孢晶體。伴孢晶體的分離純化方法種類比較多，純化得到的晶體純度不一，本發(fā)明采用高速冷凍離心法分離純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供ー種操作更簡便、周期短，伴孢晶體単一性強(qiáng)、形態(tài)均一的制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(I)活化培養(yǎng)將蘇云金芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上，控制溫度為28 32°C斜面培養(yǎng)24 48小時(shí)，作為活化種子；(2)種子培養(yǎng)將活化種子接種在液體種子培養(yǎng)基上，控制溫度為28 32°C，在120 200rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)24 36h，作為種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按照I 5v/v%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溫度為28 32°C，在120 200rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)3 5天，得到饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液；(4)伴孢晶體分離純化饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液分裝于離心管中，4°C，轉(zhuǎn)速為4000 6000rpm下冷凍離心15 30min,將得到的沉淀用0. I 0. 5wt*%的生理鹽水洗漆，然后在4°C, 4000 6000rpm下冷凍離心15 30min,再用無菌水洗漆,反復(fù)3 5次后即得到蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體。所述的伴孢晶體主要為菱形。所述的蘇云金芽孢桿菌采用以下步驟制備(I)菌種活化將普通的蘇云金芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，控制溫度為28 32°C斜面培養(yǎng)12 48h，作為活化菌種；(2)誘變處理利用無菌水將活化菌種稀釋10_6 10_12倍，轉(zhuǎn)接入平板培養(yǎng)基上，控制紫外線裝置與活化菌種的距離為30 50cm，對該菌種的正面照射3 5min，反復(fù)3 8次，最后篩選出所需要的蘇云金芽孢桿菌即可。所需要的蘇云金芽孢桿菌的菌株形態(tài)特征營養(yǎng)菌體呈桿狀，鈍圓，菌體有鞭毛，芽孢呈橢圓形，端生。所述的斜面培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉 10g/L、瓊脂 15 20g/L, pH 為 7. 2。所述的液體種子培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨5. Og/L、酵母膏5. Og/L、葡萄糖I. Og/L、磷酸氫ニ鈉0. 8g/L, pH為7. 2。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2. 5g/L、氯化鈉5g/L，pH為7. 2。
所述的平板培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨10g/L、酵母膏5. 0g/L，氯化鈉10g/LJ|^gl5g/L，pH*7.2。所述的生理鹽水為市售的Triton-XlOO生理鹽水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在生物防治等領(lǐng)域提供了ー個(gè)新的產(chǎn)有效殺蟲蛋白的菌株，操作更簡便、周期短、成本也相對較低，此方法提取的伴孢晶體純度達(dá)到99%以上，本發(fā)明分離純化的伴孢晶體単一性強(qiáng)，形態(tài)均一，便于對伴孢晶體毒力蛋白殺蟲機(jī)理的研究。


圖I為蘇云金芽孢桿菌BtTJLZl 109的SEM圖；圖2為2 ii m級尺度下的Bt TJLZl 109伴孢晶體及菌體SEM圖；圖3為I ii m級尺度下的Bt TJLZl 109伴孢晶體SEM圖；圖4為0. 2 ii m級尺度下的Bt TJLZl 109伴孢晶體SEM圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I在紫外殺菌后的超凈臺(tái)中，用接種環(huán)挑取本實(shí)驗(yàn)室保藏的母株，接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C下活化培養(yǎng)48小時(shí)。用移液管向活化后的菌株上注入ImL無菌水，振蕩后移液槍吸取一定菌液，注入試管中，無菌水稀釋10,倍。均勻滴加到事先已滅菌處理好的平板培養(yǎng)基上，無菌涂布棒均勻涂布。涂布后將培養(yǎng)基置于距紫外燈40cm處正面照射，反復(fù)照射3次，毎次5min。紫外光處理后，用接種環(huán)依次挑取單菌落，分別“之”字形接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C下培養(yǎng)48h。挑取單菌落掃描電鏡鏡檢觀察。結(jié)果見圖I所示，蘇云金芽孢桿菌的菌株形態(tài)特征營養(yǎng)菌體呈桿狀，鈍圓，菌體有鞭毛，芽孢呈橢圓形，端生。實(shí)施例2用接種環(huán)挑取Bt TJLZl 109菌株，接種在斜面培養(yǎng)基上，30°C下活化培養(yǎng)24h。接種環(huán)挑取活化種子接種入液體種子培養(yǎng)基，30°C，130rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)24h。用移液槍將種子培養(yǎng)液以1%的比例接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，130rpm搖床培養(yǎng)3天。將發(fā)酵培養(yǎng)液分裝到50mL離心管中，4500rpm，4°C冷凍離心20min。棄去上清液，
0.1% Triton-XlOO的生理鹽水洗滌沉淀物，4500rpm，4°C再次冷凍離心20min。棄去上清液，用無菌水洗漆沉淀，再次于4500rpm, 4°C冷凍離心20min。無菌水洗漆沉淀,冷凍離心反復(fù)3次。最終沉淀用無菌水制成菌懸液，伴孢晶體主要為菱形，掃描電鏡不同倍數(shù)下鏡檢觀察。結(jié)果見2、3、4圖所示。實(shí)施例3一種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，該方法包括以下步驟(I)活化培養(yǎng)將蘇云金芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上，控制溫度為28°C斜面培養(yǎng)48小時(shí)，作為活化種子，使用的斜面培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂15g/L，pH為7. 2 ;(2)種子培養(yǎng)將活化種子接種在液體種子培養(yǎng)基上，控制溫度為28°C，在120rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)36h，作為種子液，使用的液體種子培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨
5.Og/L、酵母膏 5. Og/L、葡萄糖 I. Og/L、磷酸氫ニ鈉 0. 8g/L, pH 為 7. 2 ; (3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按照1V/V%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溫度為28°C，在120rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)5天，得到饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2. 5g/L、氯化鈉5g/L，pH為7. 2 ;(4)伴孢晶體分離純化饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液分裝于離心管中，4°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm下冷凍離心30min,將得到的沉淀用0. Iwt %的Triton-XlOO生理鹽水洗漆,然后在4°C，4000rpm下冷凍離心30min，再用無菌水洗滌，反復(fù)3次后即得到蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體，伴孢晶體主要為菱形。蘇云金芽孢桿菌采用以下步驟制備(I)菌種活化將普通的蘇云金芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，控制溫度為28°C斜面培養(yǎng)48h，作為活化菌種，使用的斜面培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨IOg/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂15g/L，pH為7. 2 ;(2)誘變處理利用無菌水將活化菌種稀釋10_6倍，轉(zhuǎn)接入平板培養(yǎng)基上，控制紫外線裝置與活化菌種的距離為30cm，對該菌種的正面照射5min，反復(fù)3次，最后篩選出所需要的蘇云金芽孢桿菌即可，蘇云金芽孢桿菌的菌株形態(tài)特征營養(yǎng)菌體呈桿狀，鈍圓，菌體有鞭毛，芽孢呈橢圓形，端生，使用的平板培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨10g/L、酵母膏 5. 0g/L,氯化鈉 10g/L、瓊脂 15g/L，pH 為 7. 2。實(shí)施例4一種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，該方法包括以下步驟(I)活化培養(yǎng)將蘇云金芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上，控制溫度為32°C斜面培養(yǎng)24小時(shí)，作為活化種子，使用的斜面培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂20g/L, pH為7. 2 ;(2)種子培養(yǎng)將活化種子接種在液體種子培養(yǎng)基上，控制溫度為32°C，在200rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)24h，作為種子液，使用的液體種子培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨
5.0g/L、酵母膏 5. 0g/L、葡萄糖 I. 0g/L、磷酸氫ニ鈉 0. 8g/L, pH 為 7. 2 ;(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按照5v/v%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溫度為32°C，在200rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)3天，得到饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2. 5g/L、氯化鈉5g/L，pH為7. 2 ;(4)伴孢晶體分離純化饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液分裝于離心管中，4°C，轉(zhuǎn)速為6000rpm下冷凍離心15min,將得到的沉淀用0. 5wt%的Triton-XlOO生理鹽水洗漆,然后在4°C,6000rpm下冷凍離心15min,再用無菌水洗漆,反復(fù)5次后即得到蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體，伴孢晶體主要為菱形。蘇云金芽孢桿菌采用以下步驟制備(I)菌種活化將普通的蘇云金芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，控制溫度為32°C斜面培養(yǎng)12h，作為活化菌種，使用的斜面培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨IOg/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂20g/L, pH為7. 2 ;(2)誘變處理利用無菌水將活化菌種稀釋10_12倍，轉(zhuǎn)接入平板培養(yǎng)基上，控制紫外線裝置與活化菌種的距離為50cm，對該菌種的正面照射3min，反復(fù)8次，最后篩選出所需 要的蘇云金芽孢桿菌即可，蘇云金芽孢桿菌的菌株形態(tài)特征營養(yǎng)菌體呈桿狀，鈍圓，菌體有鞭毛，芽孢呈橢圓形，端生。
權(quán)利要求
1.一種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)活化培養(yǎng)將精制的蘇云金芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上，在28 32°C的溫度下斜面培養(yǎng)24 48小時(shí)，作為活化種子； (2)種子培養(yǎng)將活化種子接種在液體種子培養(yǎng)基上，控制溫度為28 32°C，在120 200rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)24 36h，作為種子液； (3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按照I 5v/v%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溫度為28 32°C，在120 200rpm轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)3 5天，得到饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液； (4)伴孢晶體分離純化饑餓培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液分裝于離心管中，4°C，轉(zhuǎn)速為4000 6000rpm下冷凍離心15 30min,將得到的沉淀用0. I 0. 5wt*%的生理鹽水洗漆，然后在4°C, 4000 6000rpm下冷凍離心15 30min,再用無菌水洗漆,反復(fù)3 5次后即得到蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在于，所述的精制的蘇云金芽孢桿菌采用以下步驟制備 (1)菌種活化將普通的蘇云金芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，在28 32°C的溫度下斜面培養(yǎng)12 48h，作為活化菌種； (2)誘變處理利用無菌水將活化菌種稀釋10_6 10_12倍，轉(zhuǎn)接入平板培養(yǎng)基上，控制紫外線裝置與活化菌種的距離為30 50cm，對該菌種的正面照射3 5min，反復(fù)3 8次，最后篩選出所需的精制的蘇云金芽孢桿菌即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在干，所述的斜面培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化鈉IOg/L、瓊脂 15 20g/L, pH 為 7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在于，所述的液體種子培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨5. Og/L、酵母膏5. Og/L、葡萄糖I. Og/L、磷酸氫ニ鈉 0. 8g/L, pH 為 7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量牛肉膏蛋白胨5g/L、酵母浸膏2. 5g/L、氯化鈉5g/L，pH 為 7. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在干，所述的平板培養(yǎng)基包括以下組分及含量胰蛋白胨10g/L、酵母膏5. Og/L，氯化鈉10g/L、瓊脂15g/L, pH 為 7. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，其特征在于，所述的生理鹽水為市售的Triton-XlOO生理鹽水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的方法，屬于微生物工程和生物防治領(lǐng)域，借助紫外線UVC進(jìn)行誘變，分離純化蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis菌株，經(jīng)活化、種子培養(yǎng)后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)過高速冷凍離心，用生理鹽水洗滌、穩(wěn)定，再經(jīng)無菌水反復(fù)洗滌、離心，分離出純度達(dá)到99％以上的伴孢晶體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明操作更簡便、周期短、成本也相對較低，此方法提取的伴孢晶體純度達(dá)到99％以上，本發(fā)明分離純化的伴孢晶體單一性強(qiáng)，形態(tài)均一，便于對伴孢晶體毒力蛋白殺蟲機(jī)理的研究。
文檔編號C12N15/01GK102757993SQ20111010948
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者周叢照, 張晨璐, 李平, 李延飛 申請人:同濟(jì)大學(xué)