專利名稱：檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的試劑盒及其制備方法，具體地說是一種檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
連接酶可以對與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)的兩條寡核苷酸片段進(jìn)行連接，進(jìn)而形成一條較長的寡核苷酸探針，如果兩條寡核苷酸探針連接處的堿基與目標(biāo)序列不完全互補(bǔ)，那么連接反應(yīng)就不會發(fā)生，也就不會產(chǎn)生較長的寡核苷酸探針。根據(jù)這一原理，根據(jù)SNP位點的基因型設(shè)計不同長度的寡核苷酸探針，可以對SNP位點的基因型進(jìn)行檢測。根據(jù)最終產(chǎn)物的長度分類，可以確定SNP位點的基因型，這就是連接酶檢測反應(yīng)(Ligase Detection Reaction)。人類基因組是遺傳信息的最終載體，人類個體之間的差異根本原因也在于基因組序列的差異。單核苷酸多態(tài)性(SNP)正是表征這種差異的常用的遺傳標(biāo)記，在人類基因組上大概每一千個堿基對，就包含有一個SNP。雙生子實驗等證明，重度抑郁是一種復(fù)雜的遺傳疾病，遺傳度高達(dá)60%左右。現(xiàn)代遺傳學(xué)研究表明，各種遺傳疾病都會被某些SNP位點所表征，也就是說，某些SNP位點與遺傳疾病呈現(xiàn)出關(guān)聯(lián)性。全基因組關(guān)聯(lián)研究的出現(xiàn)，更為尋找關(guān)聯(lián)位點提供了有力的技術(shù)支持。這些強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNP位點可以作為一種患病風(fēng)險的表征?，F(xiàn)在對SNP位點的分型，常用的方法有AB公司的TaqMan探針技術(shù)，測序技術(shù)等。 TaqMan探針要從AB公司定制，周期較長而且價格較為昂貴。測序技術(shù)雖然結(jié)果較為可靠， 但是對特定位點的SNP分型，該方法相對成本較高，花費時間也比較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法，本發(fā)明操作簡便，成本低廉，針對重度抑郁而開發(fā)。結(jié)果可靠，穩(wěn)定性好，靈敏度高。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明涉及檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，包括PCR試劑組和LDR(連接酶檢測反應(yīng))試劑組，兩個試劑組包裝在同一個盒子中，PCR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、 Taq DNA聚合酶、純水和四對PCR專用擴(kuò)增引物；LDR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、 Taq DNA連接酶、純水和四組LDR專用探針。所述的PCR試劑組，dNTP混合液的濃度為10mM，Taq DNA聚合酶的濃度為2unit/ ul，四對PCR擴(kuò)增引物為20D的干粉，使用時，先8000rpm離心十分鐘，然后加入純水溶解， 震蕩均勻后可以使用。所述的LDR試劑組，Taq DNA聚合酶的濃度為40unit/ul，四對PCR擴(kuò)增引物為20D 的干粉，使用時，先SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后可以使用。
本發(fā)明還涉及如上述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，包括以下步驟①PCR引物的設(shè)計及合成PCR引物采用引物設(shè)計軟件raiMER3進(jìn)行引物設(shè)計，TM 值選擇60度左右；②LDR探針的設(shè)計及合成LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’ 端探針；③Taq DNA聚合酶和iTaq DNA連接酶采用TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs 的產(chǎn)品。所選用市售TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs的產(chǎn)品(配套試劑，包括緩沖液，dNTP等均選用市售常用試劑之)。所述的LDR探針兩條5’端探針長度相差2個堿基，反映在該探針的5’端。所述的LDR探針兩條5’端探針的3’端的最后一個堿基根據(jù)SNP位點的基因型確定。所述的LDR探針兩條5’端探針在距5’端6個堿基的位置認(rèn)為引入與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的一個堿基，目的是增大檢測的準(zhǔn)確度。所述的LDR探針5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列，目的是使產(chǎn)物達(dá)到利于檢測的長度。所述的LDR探針除上述三點描述外，5’端探針的其他位置與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。所述的LDR探針3’端探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)，且在其5’端加磷酸修飾，其3’ 端加FAM熒光修飾。所述的PCR引物的設(shè)計及合成中每個位點對應(yīng)的引物的序列如下
權(quán)利要求
1.一種檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，其特征在于，包括PCR試劑組和LDR試劑組， 兩個試劑組包裝在同一個盒子中，PCR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、 純水和四對PCR專用擴(kuò)增引物；LDR試劑組，包括緩沖液、dNTP混合液、Taq DNA連接酶、純水和四組LDR專用探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，其特征是，所述的PCR試劑組，dNTP混合液的濃度為10mM，Taq DNA聚合酶的濃度為2unit/ul，四對PCR擴(kuò)增引物為 20D的干粉，使用時，先SOOOrpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，震蕩均勻后使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1中所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒，其特征是，所述的LDR 試劑組，Taq DNA聚合酶的濃度為40unit/ul，四對PCR擴(kuò)增引物為20D的干粉，使用時，先 8000rpm離心十分鐘，然后加入純水溶解，混合均勻后使用。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①PCR引物的設(shè)計及合成PCR引物采用引物設(shè)計軟件raiMER3進(jìn)行引物設(shè)計，TM值選擇60度左右；②LDR探針的設(shè)計及合成LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；③iTaqDNA聚合酶和iTaq DNA連接酶采用TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs的產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所述的LDR探針兩條5’端探針長度相差2個堿基，反映在該探針的5’端。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所述的LDR探針兩條5’端探針的3’端的最后一個堿基根據(jù)SNP位點的基因型確定。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所述的LDR探針兩條5’端探針在距3’端6個堿基的位置認(rèn)為引入與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的一個堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所述的LDR探針5’端探針的5’末端及3’端探針的3’末端均采用polyT的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所述的LDR探針除上述三點描述外，5’端探針的其他位置與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒的制備方法，其特征是，所述的LDR探針3’端探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)，且在其5’端加磷酸修飾，其3’端加FAM熒光修飾。
全文摘要
一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測重度抑郁關(guān)聯(lián)基因的試劑盒及其制備方法。試劑盒PCR試劑組和LDR試劑組，其中PCR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA聚合酶，純水，四對PCR專用擴(kuò)增引物；LDR試劑組包括緩沖液，dNTP混合液，Taq DNA連接酶，純水，四組LDR專用探針。制備方法包括PCR引物的設(shè)計及合成PCR引物采用引物設(shè)計軟件PRIMER3進(jìn)行引物設(shè)計，TM值選擇60度左右；LDR探針的設(shè)計及合成LDR探針每個位點包括三條，兩條5’端探針和一條3’端探針；Taq DNA聚合酶和Taq DNA連接酶采用TAKARA的產(chǎn)品或New England Biolabs的產(chǎn)品。本發(fā)明可以實現(xiàn)對重度抑郁關(guān)聯(lián)基因內(nèi)特定SNP位點的快速、高效、準(zhǔn)確的分型。
文檔編號C12Q1/68GK102191329SQ20111010993
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者師詠勇, 王倜, 賀林, 陳培華 申請人:上海交通大學(xué), 上海佰真生物科技有限公司