專利名稱：通過敲除phrC基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過敲除MrC基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌OfeCiBm ·5油^Vi1S)是目前公認(rèn)的安全微生物之一，其抗菌代謝產(chǎn)物豐富多樣，尤其是脂肽類抗菌物質(zhì)，不僅抗菌譜廣而且還具有生物表面活性劑的功能，因此不僅可以在農(nóng)業(yè)上用于進(jìn)行生物防治，而且在工業(yè)和環(huán)境保護(hù)上也有著廣泛的應(yīng)用。枯草芽孢桿菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一種可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物質(zhì)的枯草芽孢桿菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作為一種生物表面活性劑，與化學(xué)表面活性劑相比，其具有擁有生物降解能力，低毒，結(jié)構(gòu)豐富的優(yōu)點(diǎn)，隨著對工業(yè)原料的環(huán)境適應(yīng)性要求的提高， 其應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)，石油開采方面潛力將會越來越大。但實(shí)際中，其并未在工業(yè)以及環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用，究其原因，是因?yàn)樗a(chǎn)成本巨大，所以提高其產(chǎn)量便成為降低其生產(chǎn)成本的核心問題。目前，世界范圍內(nèi)，提高其產(chǎn)量的方法主要是篩選優(yōu)良菌株，以及優(yōu)化發(fā)酵條件， 而很少采用分子生物學(xué)技術(shù)對菌種進(jìn)行改良的方法來提高其產(chǎn)抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量。但隨著對抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已經(jīng)逐漸開始采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過改造其合成分泌中信號通路等方法來對原始菌種進(jìn)行基因改良，從而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。基因(Gene ID: 937009)，其表達(dá)產(chǎn)物枯草桿菌感受態(tài)芽孢因子(CSF)是枯草桿菌中十分重要的調(diào)控蛋白之一，在枯草芽孢桿菌各種生理代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，相關(guān)研究表明，CSF蛋白對于抗菌物質(zhì)的合成具有一定的阻礙作用。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC 9943為出發(fā)菌株，以大腸桿菌克隆載體pGEM_T 為骨架構(gòu)建一個(gè)基因敲除載體pCSF-EM，利用同源重組原理，通過雙交換過程敲除枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組中基因的方法構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)抗菌肽菌株FMB 25。三、發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建祐rC基因敲除載體，經(jīng)過電轉(zhuǎn)化通過同源重組將枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組中基因敲除，從而構(gòu)建一種高產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株FMB 25。技術(shù)方案
1、通過敲除祐rC基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于 (1)/^rC基因敲除載體pCSF-EM的構(gòu)建
根據(jù)枯草芽孢桿菌/^rC基因設(shè)計(jì)引物WirC5’ -F和WirC5’ -R,以枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增部分5，端/^rC基因及其上游基因，獲得500bp基因片段；根據(jù)枯草芽孢桿菌/^rC基因設(shè)計(jì)引物WirC3，-F和WirC3，-R,以枯草芽孢桿菌ATCC 9943 基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增部分3’端祐rC基因及其下游基因，獲得500bp基因片段；根據(jù)pMUTIM的DNA設(shè)計(jì)引物EM-F和EM-R，以pMUTIM質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增包括啟動(dòng)子和終止子的紅霉素抗性基因表達(dá)框，獲得850bp基因片段；擴(kuò)增得到的三個(gè)基因分別克隆至 PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(fecAericAia coli) DH5a,經(jīng)驗(yàn)證、測序正確后，分別命名為 VCSF5' -T、vCSF3' -T、ρΒΜ~ ,于 _20°C條件下保存?zhèn)溆茫?br> 權(quán)利要求
1.通過敲除祐rC基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于 (1)/^rC基因敲除載體pCSF-EM的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物 PhrC5，-F 和 PhrC5，-R，以枯草芽孢桿菌 UaciBw1S subtil is、KKL 9943 基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增部分5’端MrC基因及其上游基因，獲得500bp基因片段；設(shè)計(jì)引物WirC3，-F和WirC3，-R,以枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增部分3， 端WirC基因及其下游基因，獲得500bp基因片段；設(shè)計(jì)引物EM-F和EM-R，以pMUTIM質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增包括啟動(dòng)子和終止子的紅霉素抗性基因表達(dá)框，獲得850bp基因片段；擴(kuò)增得到的三個(gè)基因分別克隆至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Mscherichia coli ) DH5a,經(jīng)驗(yàn)證、測序正確后，分別命名為VCSF5，-T、VCSF3' -Τ、ρΒΜ~ ,于_20°C條件下保存?zhèn)溆?；名稱序列酶切位點(diǎn)PhrC5， -F5 ‘ GAATTCCATGGCCCAAGCAGAACAAAMGCC3 ‘EcoRIPhrC5， -R5 ‘ TCTAGACATGAAAGTCGAGTGCTTCCGCAT3‘XbaIPhrC3， -F5 ‘ MATCTAGATAAGAACAAGCCCCTTCTCATTAG3‘XbaIPhrC3， -R5 ‘ ACAGCATGCTTTATATCACCTTCATATAGCCG3‘SphIEM-F5 ‘ TGATCTAGATAGAAGCAMCTTAAGAGTGTGT3 ‘XbaIEM-R5 ‘ TGATCTAGAMTTATTTCCTCCCGTTMATAAT3 ‘XbaIvCSF5f~l用EcoRI/XbaI雙酶切后獲得phrC5，六啟,與經(jīng)過相同雙酶切處理的pGEM_T 載體，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建載體，酶切驗(yàn)證正確后于_20°C條件下保存VCSF3f -T用XbaI/SphI雙酶切后獲得phrC3 "片段，與經(jīng)過相同雙酶切處理的 ^m~phrC5'載體，用"Γ4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pGEM-/7ArC載體，酶切驗(yàn)證正確后于_20°C 條件下保存?zhèn)溆茫籔^F-T用XbaI酶切后獲得漲片段，與經(jīng)過相同酶切處理的pGEM-/7ArC載體，用T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建/^rC基因敲除載體pCSF-EM，酶切驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用于下一步轉(zhuǎn)化；(2) FMB 25突變菌株的構(gòu)建以枯草芽孢桿菌ATCC 9943制備感受態(tài)細(xì)胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將獲得的祐rC基因敲除載體pCSF-EM轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌ATCC 9943，在基因組/^rC位點(diǎn)發(fā)生雙交換，紅霉素平板上篩選得到紅霉素抗性菌株，命名為FMB 25 ；該菌株的祐rC基因被紅霉素抗性基因所取代，成為缺失了祐rC基因的突變菌株，即為所得到的菌株。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的敲除基因菌株FMB25。
3.權(quán)利要求2所述敲除MrC基因菌株FMB25在生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌肽中的應(yīng)用。
4.用權(quán)利要求2所述敲除MrC基因菌株FMB25生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過敲除phrC基因提高枯草桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC9943為出發(fā)菌株，以大腸桿菌克隆載體pGEM-T為骨架構(gòu)建一個(gè)基因敲除載體pCSF-EM，利用同源重組原理，通過雙交換過程敲除枯草芽孢桿菌ATCC9943基因組phrC基因的方法構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)抗菌肽菌株FMB25。經(jīng)過高效液相色譜分析，確定改良菌株產(chǎn)surfactin和fengycin的能力大大提高。
文檔編號C12P21/02GK102242142SQ20111010540
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 張充, 曹國強(qiáng), 鐘蕾, 陸兆新 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)