專利名稱：一種長非編碼rna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種新的腫瘤標(biāo)志物及其用途等。
背景技術(shù)：
人體中編碼蛋白質(zhì)的基因大約有2-3萬個(gè)，僅占人類基因組的2%，其余98%不編碼蛋白質(zhì)的基因組DNA最初被認(rèn)為是沒有功能的，是生物體中的垃圾，通常被稱為“垃圾DNA。但目前的研究表明，這些垃圾DNA大多可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。根據(jù)成熟轉(zhuǎn)錄本大小的不同，ncRNA可分為小分子ncRNA (如siRNA，miRNA, piRNA 等)，中等長度 ncRNA (70-200nt)和長 ncRNA (long ncRNA, IncRNA, > 200nt)。目前，ncRNA 領(lǐng)域研究較多的是小分子ncRNA，而對hcRNA的研究還處于起步階段。由于序列內(nèi)部存在過多的終止密碼子，IncRNA不能被翻譯成蛋白質(zhì)，他們通常是以RNA轉(zhuǎn)錄本的形式行使其生物學(xué)功能，如發(fā)育過程中的細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和類固醇代謝等，越來越多的證據(jù)表明hcRNA在細(xì)胞中起著調(diào)控基因表達(dá)的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)hcRNA與細(xì)胞的癌變有著極為密切的聯(lián)系，起腫瘤抑制基因作用的^cRNA表達(dá)下降或者缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IncRNA與肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病等腫瘤疾病有關(guān)。這些研究結(jié)果都表明hcRNA在細(xì)胞增殖、分化和癌變中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤相關(guān)^cRNA的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)對腫瘤的診斷及基因治療產(chǎn)生重大的影響。通過大范圍分析腫瘤和正常組織的hcRNA，可以鑒定與腫瘤特異相關(guān)的hcRNA，使其成為潛在的病理診斷標(biāo)記。通過引入針對具有癌基因特性的hcRNA的shRNA可以有效地表達(dá)特異性的 siRNA并抑制^cRNA作用的發(fā)揮，比其他的治療手段的毒副作用會(huì)更低。相反，通過病毒載體或質(zhì)粒載體過表達(dá)具有腫瘤抑制基因作用的hcRNA，進(jìn)而抑制其調(diào)控的特定靶基因的表達(dá)，也可以達(dá)到抑制腫瘤生長的效果。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性表達(dá)的hcRNA對基于hcRNA 的腫瘤診斷和治療具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及以下按順序編號(hào)的段落中定義的主題1. 一種分離的寡聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子選自1)序列表中SEQ ID Nol所示的核酸分子；2)與序列表中SEQ ID Nol所示的核酸序列具有90%或以上同源性的寡聚核酸分子。2.段落1所述的寡聚核酸分子作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用。3.根據(jù)段落2所述的寡聚核酸分子作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。4. 一種在分離的樣本中檢測段落1所述的寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述方法為雜交法、擴(kuò)增法或測序法。5.根據(jù)段落4所述的檢測寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述雜交法為Northern雜交或者基因芯片雜交。6. 一種探針，其特征在于，該探針能夠檢測段落1所述的寡聚核酸分子。7.根據(jù)段落6所述的探針，其特征在于，所述探針具有SEQ ID No 6所示的核酸序列。8.段落6或7所述探針在制備腫瘤檢測試劑中的應(yīng)用。9. 一種診斷腫瘤的檢測系統(tǒng)，其特征在于該檢測系統(tǒng)包含段落6或7所述的探針。10.根據(jù)段落4所述的檢測寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述擴(kuò)增法為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。11. 一組寡聚核酸分子，其特征在于，所述寡聚核酸分子為逆轉(zhuǎn)錄引物6堿基隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物；上游引物5，-AGATTCCCATTTTGGCTTTG；下游引物5，-GGTGACATGGTGCTGTTTCA；12.段落11所述的寡聚核酸分子組合在制備腫瘤檢測試劑中的應(yīng)用。13. 一種診斷腫瘤的檢測系統(tǒng)，其特征在于所述檢測系統(tǒng)包含段落11中所述的寡聚核酸分子。14.根據(jù)段落13所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)還包括逆轉(zhuǎn)錄酶及其反應(yīng)緩沖液、四種脫氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、人工合成的內(nèi)參及正常人對照品。15.根據(jù)段落4所述的檢測寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述測序法為高通
量測序。16. 一種診斷腫瘤的方法，其特征在于，該方法包含以下步驟1)測定離體樣本中段落1所述的寡聚核酸分子的水平；2)比較被測定樣本中段落1所述的寡聚核酸分子的水平與參考樣本中的段落1所述的寡聚核酸分子的水平，如果與參考樣本相比，被測定樣本中該寡聚核酸分子的水平有顯著改變，說明腫瘤的存在。17.根據(jù)段落16所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述方法為雜交法、擴(kuò)增法或測序法。18.根據(jù)段落17所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述雜交法為Northern雜交或者基因芯片雜交。19.根據(jù)段落17所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述擴(kuò)增法為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。20.根據(jù)段落17所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述測序法為高通量測序。21.根據(jù)段落16-20任一項(xiàng)所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述顯著改變?yōu)轱@著增加。22.根據(jù)段落16-20任一項(xiàng)所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述離體樣本選自分離的體液、淋巴結(jié)樣本或組織樣本。23.根據(jù)段落16-22任一項(xiàng)所述的診斷腫瘤的方法，其特征在于所述腫瘤選自肝
癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。24. 一種試劑，其特征在于能夠降低SEQ ID Nol所示寡聚核酸分子的水平。
25.根據(jù)段落M所述的試劑，其特征在于所述試劑為小干擾核酸。26.根據(jù)段落M所述的試劑，其特征在于所述試劑為反義核酸。27.根據(jù)段落25所述的試劑，其特征在于所述小干擾核酸選自SEQ ID Nol514所示的序列或所示序列的修飾產(chǎn)物。28.根據(jù)段落沈所述的試劑，其特征在于所述反義核酸選自SEQ ID No 2546所示的序列或所示序列的修飾產(chǎn)物。29.根據(jù)段落27或觀所述的試劑，其特征在于所述修飾為如下修飾中的至少一種1)對核酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；2)對核酸序列中核苷酸的核糖的2’ -OH的修飾；3)對核酸序列中核苷酸的堿基的修飾。30. 一種腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑，其特征在于包含有效量的段落M-四任一項(xiàng)所述的試劑。31. 一種藥物組合物，其特征在于包含有效量的段落M-四任一項(xiàng)所述的試劑及藥學(xué)上可接受的載體。32.段落24- 任一項(xiàng)所述的試劑在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。33.根據(jù)段落32所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。34. 一種治療腫瘤的方法，其特征在于包含步驟給需要治療的對象應(yīng)用 0. l-50mg/kg體重/天的段落M-四任一項(xiàng)所述的試劑。35.根據(jù)段落34所述的治療腫瘤的方法，其特征在于所述腫瘤為高表達(dá)SEQ ID Nol所示序列的腫瘤類型。36.根據(jù)段落35所述的治療腫瘤的方法，其特征在于所述腫瘤為高表達(dá)SEQ ID Nol所示序列的肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是根據(jù)個(gè)體樣本中非編碼RNA的表達(dá)水平進(jìn)行腫瘤的診斷，特別是乳腺癌、肝癌、肺癌、食管癌等的診斷。本發(fā)明要解決的問題還涉及提供用于腫瘤診斷的方法及相應(yīng)診斷試劑。本發(fā)明要解決的另一個(gè)問題是提供用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖的抑制劑及用于腫瘤治療的藥物組合物。本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)并分離出新的可做為腫瘤標(biāo)志物的寡聚核酸分子Yiya。該寡聚核酸分子在正常組織或者癌旁組織中不表達(dá)或表達(dá)量很低，在腫瘤組織中廣泛表達(dá)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種新穎的分離的寡聚核酸，它包含具有SEQ ID NO 1所示序列的寡聚核酸；或者與序列表中SEQ ID NO 1所示的核酸序列具有90%或以上同源性的寡聚核酸序列。上述寡聚核酸可通過雜交法、擴(kuò)增法或測序法進(jìn)行檢測。具體地說， 擴(kuò)增法包括熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，雜交法包括芯片雜交和Northern雜交，測序法包括高通量測序法。本發(fā)明第二方面提供了檢測SEQ ID Nol所示序列寡聚核酸的探針或者特異性引物。優(yōu)選的，所述檢測探針具有下述序列(SEQ ID No 6)
5， -ATCACTTCTCATCTAGATTCCCATTTTGGCTTTGTCATCTTTCTCCCCACTACATTCCAGCTATGT AGTCCTTCATATAGTTTCTAGAACGTGCCAAGATTTCTCTTCTAGATCTTTGCATTTGAAATTCCCTTTGCTTATAA TGCTCTTGCCTAGCTCTTCATATATCTGGCTTGAGGGCATCTCTTAAGAGAGGACTTCGACTTCACCAATCTGAAAC AGCACCATGTCAC-3，；所述檢測引物具有如下序列逆轉(zhuǎn)錄引物6堿基隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物；Yiya 正向引物(SEQ ID No 7) :5，-AGATTCCCATTTTGGCTTTG ；Yiya 反向引物(SEQ ID No 8) :5，-GGTGACATGGTGCTGTTTCA。本發(fā)明第三方面提供了一種診斷腫瘤的檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含上述檢測探針；或該系統(tǒng)包含上述檢測引物，在較佳的實(shí)施方式中，該系統(tǒng)還包括逆轉(zhuǎn)錄酶及其反應(yīng)緩沖液、 四種脫氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、人工合成的內(nèi)參及正常人對照品。本發(fā)明第四方面提供了一種診斷腫瘤的方法，該方法包含以下步驟1)測定離體樣本中SEQ ID Nol寡聚核酸分子的表達(dá)水平；2)比較被測定樣本中SEQ ID Nol寡聚核酸分子的水平與參考樣本中的SEQ IDNol 寡聚核酸分子的水平，如果與參考樣本相比，被測定樣本中該寡聚核酸分子的水平有顯著改變，說明腫瘤的存在。測定離體樣本中SEQ ID Nol寡聚核酸分子的表達(dá)水平的方法，可以為雜交法、擴(kuò)增法或測序法。具體地說，擴(kuò)增法包括熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，雜交法包括芯片雜交和Northern雜交，測序法包括高通量測序法。如果通過上述方法測定的離體樣本中SEQID Nol寡聚核酸分子的表達(dá)水平比參考樣本中該寡聚核酸分子的表達(dá)水平升高，則說明有腫瘤的存在?！吧摺痹诖酥傅氖荢EQ ID Nol寡聚核酸分子的表達(dá)水平至少增加5%，包括例如至少6%，7%，8%，9%，10%，15%，20%，30%，40%，50%或更多。所述離體樣本可選自分離的體液、淋巴結(jié)樣本或組織樣本。上述的診斷腫瘤的方法，所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、 卵巢癌或食管癌。第五方面，本發(fā)明還提供了一種試劑(稱為Yiya拮抗劑或Yiya抑制劑)，該試劑能夠降低SEQ ID Nol所示寡聚核酸分子的水平。較佳地，該試劑是Yiya的反義核酸或者小干擾RNA(siRNA)。這些化合物不僅能夠抑制Yiya的表達(dá)，也能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 具體來講，所述小干擾核酸選自SEQ ID Nol5-M所示的序列或所示序列的修飾產(chǎn)物；所述反義核酸選自SEQ IN No 2546所示的序列或所示序列的修飾產(chǎn)物。上述修飾為如下修飾中的至少一種1)對核酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；2)對核酸序列中核苷酸的核糖的2’ -OH的修飾；3)對核酸序列中核苷酸的堿基的修飾。反義核酸研究中，各種化學(xué)修飾方法很多。本發(fā)明采用選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種組合修飾的反義核酸，硫代、甲氧修飾方式的反義核酸的藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)等臨床前研究是各種化學(xué)修飾反義核酸中研究最為全面的，修飾的反義核酸在體內(nèi)可以有效地防止人體內(nèi)大量核酸外切酶對反義核酸的酶切而降解，從而避免反義核酸失去應(yīng)有的生物學(xué)活性。此外硫代反義核酸還可激發(fā)RNA酶的活性，降解與其雜交的RNA鏈，因此優(yōu)選這兩種修飾方式的反義核酸在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)明確的是，任何能夠增加反義核酸穩(wěn)定性和生物利用度的修飾方法都可以應(yīng)用，如膽固醇修飾、PEG修飾等。優(yōu)選本發(fā)明反義核酸修飾選自硫代修飾、2’ -甲氧基修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。對于小干擾核酸(SiRNA)來講，所述化學(xué)修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進(jìn)行修飾，包括硫代磷酸修飾，如式1所示；和硼烷化磷酸鹽修飾，如式2所示。兩種修飾都能穩(wěn)定siRNA結(jié)構(gòu)，保持堿基配對的高特異性和高親和力。
權(quán)利要求
1.一種分離的寡聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子選自1)序列表中SEQID Nol所示的核酸分子；2)與序列表中SEQID Nol所示的核酸序列具有90%或以上同源性的寡聚核酸分子。
2.權(quán)利要求1所述的寡聚核酸分子作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡聚核酸分子作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。
4.一種在分離的樣本中檢測權(quán)利要求1所述的寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述方法為雜交法、擴(kuò)增法或測序法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述雜交法為 Northern雜交或者基因芯片雜交。
6.一種探針，其特征在于，該探針能夠檢測權(quán)利要求1所述的寡聚核酸分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的探針，其特征在于，所述探針具有SEQID No 6所示的核酸序列。
8.權(quán)利要求6或7所述探針在制備腫瘤檢測試劑中的應(yīng)用。
9.一種診斷腫瘤的檢測系統(tǒng)，其特征在于該檢測系統(tǒng)包含權(quán)利要求6或7所述的探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述擴(kuò)增法為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的、分離的長非編碼RNA，該長非編碼RNA具有SEQ ID No1所示的序列。本發(fā)明還提供了該長非編碼RNA用作腫瘤標(biāo)志物的用途，以及檢測該長非編碼RNA的探針和引物。本發(fā)明還提供了該長非編碼RNA的抑制劑，該抑制劑能夠抑制長非編碼RNA的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞增殖。本發(fā)明還提供了包含該抑制劑的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102433326SQ201110102758
公開日2012年5月2日 申請日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者丁先鋒, 杜權(quán), 梁子才 申請人:北京大學(xué)