專利名稱：一株高自溶度乳酸菌及其在干酪中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一株高自溶度乳酸菌及其在干酪中的應用。

背景技術(shù)：
細菌自溶是指菌體細胞在一定的條件，自身釋放可水解細胞壁肽聚糖網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)的自溶酶，這些酶的表達導致了細菌細胞壁質(zhì)的溶解和消失，形成一個細胞內(nèi)物質(zhì)向周圍環(huán)境釋放的過程。蛋白質(zhì)水解是在干酪成熟中發(fā)生最基本的生化反應中最復雜的一種，Law 研究表明在未成熟干酪中發(fā)酵劑自溶速率和自溶度與蛋白水解呈正相關(guān)，且對切達干酪的風味形成有積極作用，在成熟期間殘余的凝乳酶以及發(fā)酵劑菌株自溶釋放胞內(nèi)蛋白酶、肽酶等繼續(xù)對蛋白產(chǎn)生一定作用，小肽及氨基酸混合物將直接影響干酪的味道和口感。在成熟期間殘余的凝乳酶以及發(fā)酵劑菌株自溶釋放胞內(nèi)蛋白酶、肽酶等繼續(xù)對蛋白產(chǎn)生一定作用，使釋放的酶類對凝乳酶分解酪蛋白后產(chǎn)生的多肽進行進一步降解，并使凝塊的硬度，彈性產(chǎn)生一定變化，如果制作干酪時只加凝乳酶，其成熟過程中Ph4. 6時只含可溶性氮很少(有小肽和氨基態(tài)氮)，相反加入發(fā)酵劑和凝乳酶的干酪含有相對大量的游離態(tài)氮，釋放游離氨基酸，因而選擇快速自溶的發(fā)酵劑菌種是加速成熟的方法，選用具有選擇性的發(fā)酵劑或經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵劑生產(chǎn)干酪具有較強的應用前景。各種干酪中微生物菌群組成的不同，蛋白質(zhì)水解的程度和速度也不同。6個月成熟的切達干酪(次生菌群相對簡單)中游離氨基酸的氮只占總氮的3%。在干酪成熟過程中發(fā)酵劑對蛋白質(zhì)水解這一過程的重要性因次生菌群、霉菌、表面菌或乳酸菌產(chǎn)生蛋白酶和肽酶的量不同而不同。酶的專一性決定了肽產(chǎn)生的氨基酸含量，因此對干酪的風味形成具有重要作用；例如疏水性肽超過一定濃度閾值可能會產(chǎn)生苦味干酪。乳球菌和乳桿菌的蛋白酶系統(tǒng)包括胞外蛋白酶以及胞內(nèi)蛋白酶，而乳桿菌對蛋白水解有貢獻的極有可能是胞內(nèi)酶的作用，為了加速干酪成熟以及提高風味，已有許多將乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑加入到切達干酪中的報道，如Harmon等人將快速自溶的瑞士乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑添加制作切達干酪，可以加速干酪成熟且切達干酪風味強烈。嗜熱乳桿菌單獨或與嗜熱乳鏈球菌混合做發(fā)酵劑，與乳酸乳球菌的水解效果很相近，且嗜熱乳桿菌從干酪成熟期一開始就發(fā)生自溶。發(fā)酵劑和非乳酸菌發(fā)酵劑在干酪的制作和成熟階段影響很大。對于切達干酪而言，其成熟期較長，成本較高，若能縮短成熟期，將具有一定的經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei) LBl。本發(fā)明提供了副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei) LB1，保藏編號為 CGMCCNo. 4644。所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644在促進干酪蛋白質(zhì)水解中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述促進干酪蛋白質(zhì)水解體現(xiàn)在提高干酪pH4. 6可溶性氮含量和/或12 % (質(zhì)量百分含量)三氯乙酸可溶性氮含量。所述促進干酪蛋白質(zhì)水解具體為加入副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei) LB1CGMCC No. 4644得到的干酪的pH4. 6可溶性氮含量和/或12% (質(zhì)量百分含量)三氯乙酸可溶性氮含量高于不加入副干酪乳桿菌(Lactobacillu sparacasei) LBlCGMCCNo. 4644 得到的干酪。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備干酪的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟向原料乳中加入所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和發(fā)酵劑，進行培養(yǎng)，得到干酪。所述發(fā)酵劑為R704。上述發(fā)酵劑R704購自CHR HANSEN,產(chǎn)品目錄號為100096，其為 Lactococcuslactis sub sp. cremoris 禾口 Lactococcus lactis subsp. Iactis 的凍干粉；所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 是通過如下凝乳加入所述原料乳中用副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei) LB1CGMCC No. 4644 發(fā)酵脫脂乳得到的凝乳；所述用副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644發(fā)酵脫脂乳得到凝乳按照包括如下步驟的方法進行將副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) LBl CGMCC No. 4644在脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到凝乳。所述原料乳、所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 和所述 R704 的配比為 ikg (ixio6-ixio7)cfu (ο. ι-ο. 15)υ ；所述原料乳、所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) LBl CGMCC No. 4644 和 R704 的配比具體為 Ikg (1 X 106、5 X IO6 或 1 X IO7) CFU (0. 1、0. 12 或 0. 15)U。所述副干酪乳桿菌培養(yǎng)的溫度為30°C _32°C，所述副干酪乳桿菌培養(yǎng)的溫度具體為 30°C、31°C或 32°C ；所述副干酪乳桿菌培養(yǎng)的時間為5_6h，所述培養(yǎng)的時間具體為5h、5.證或他；所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為37°C ；所述發(fā)酵時間為36h_48h，所述發(fā)酵時間具體為48h ；每IL脫脂乳培養(yǎng)基按照如下方法制備將IOOg脫脂乳粉溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水補充至1L，得到的培養(yǎng)基。由上述的方法生產(chǎn)得到的干酪也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明第三個目的是提供一種制備干酪的組合物，由副干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei) LB1CGMCC No. 4644 和發(fā)酵劑組成。所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) LBl CGMCC No. 4644 和所述發(fā)酵劑的配比為(ixio6-IXIO7)CFU (ο. ι-ο. 15)υ ；所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) LBl CGMCC No. 4644 和所述發(fā)酵劑的配比具體為(1X106、5X106或1X107)CFU (0. 1、0. 12 或 0. 15)U ；所述發(fā)酵劑和所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644 均為獨立包裝。
所述發(fā)酵劑為R704 ；所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 是通過如下凝乳體現(xiàn)在所述菌劑中用副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644 發(fā)酵脫脂乳得到的凝乳；所述副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644 發(fā)酵產(chǎn)物按照如下方法制備將副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644在脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到凝乳。所述發(fā)酵的溫度為35°C _37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為37°C ；所述發(fā)酵時間為36h_48h，所述發(fā)酵時間具體為48h ；每IL脫脂乳培養(yǎng)基按照如下方法制備將IOOg脫脂乳粉溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水補充至1L，得到的培養(yǎng)基。菌株LBl已于2011年3月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4644，分類命名為副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei)。本實驗的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株高自溶度的副干酪乳桿菌LB1，將其作為附屬發(fā)酵劑添加至干酪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌LBl得到的干酪脂肪含量高，在pH4. 6SN和12% TCA SN的含量高，可有效提高蛋白分解程度，成熟周期短，可以節(jié)約貯藏成本。


圖1為菌株的自溶度圖2為成熟期間各干酪中乳酸菌總數(shù)變化圖3為成熟期間pH值變化圖4為干酪在成熟期內(nèi)非酪蛋白氮含量的變化圖5為干酪在成熟期內(nèi)非蛋白氮含量的變化
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。分離培養(yǎng)基(MRS瓊脂培養(yǎng)基)蛋白胨lO.Og、牛肉膏l(xiāng)O.Og、酵母浸出粉5.0g、葡萄糖20. 0g、醋酸鈉5. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、檸檬酸二銨2. 0g、吐溫-80 lg、硫酸鎂0. 58g、 硫酸錳0. 25g、碳酸鈣5. 0g，使用蒸餾水定容至IOOOmL,加入1. 2% 1. 5%瓊脂，121°C滅菌 15min。MRS計數(shù)培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母浸出粉5. 0g、葡萄糖20. 0g、醋酸鈉5. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、檸檬酸銨2. 0g、吐溫-80 lg、硫酸鎂0. 2g、硫酸錳0. 54g,使用蒸餾水定容至IOOOmLdjffpHG. 5，加入1. 2%~ 1. 5%瓊脂，121°C滅菌15min牛肉膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為01-009。酵母浸出粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為01-012。MRS肉湯培養(yǎng)基(購自北京路橋技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號CM187)。
實施例1、菌株的分離及鑒定、特性1、菌株的分離1)、樣品稀釋液的制備及細菌分離用Iml無菌槍頭吸取樣品液(來自于傳統(tǒng)發(fā)酵制品(酸奶)，來源于內(nèi)蒙古省。)1ml，放入9ml滅菌生理鹽水中，震蕩混勻即成KT1稀釋液。依次類推，連續(xù)稀釋至10_8。 在10-6、10_7、10-8梯度分別吸Iml稀釋液至于培養(yǎng)皿中，并到入45°C左右MRS瓊脂培養(yǎng)基， 混勻。37°C培養(yǎng)48h。2)、菌株初步純化用接種針挑取平皿表面及底部圓形或梭形的乳酸菌疑似單菌落，在MRS平板培養(yǎng)中劃線接種，37°C培養(yǎng)48h。3)、革蘭氏染色挑取單菌落，做革蘭氏染色實驗，在光學顯微鏡下觀察并記錄現(xiàn)象。將革蘭氏陽性菌平板純化四代，鏡檢后轉(zhuǎn)斜面貯藏，分離得到菌株LBl。2、菌株的耐酸和耐鹽特性將供試菌株LBl以2%的量分別接入pH為3、4、5、6的滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基(檢測耐酸性)以及氯化鈉濃度分別為0^,2% ,4^,6% ,8^,10%的滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基(檢測耐鹽性)中，于37°C恒溫培養(yǎng)Mh，觀察其生長情況。結(jié)果如表1、表2。菌株耐鹽性如下表1耐鹽性試驗
權(quán)利要求
1.副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LBl，保藏編號為 CGMCC No. 4644。
2.權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LB1CGMCC No. 4644在促進干酪蛋白質(zhì)水解中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述促進干酪蛋白質(zhì)水解體現(xiàn)在提高干酪PH4. 6可溶性氮含量和/或12% (質(zhì)量百分含量)三氯乙酸可溶性氮含量。
4.一種制備干酪的方法，包括如下步驟向原料乳中加入權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和發(fā)酵劑，進行培養(yǎng)，得到干酪。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于 所述發(fā)酵劑為R704 ；所述副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644是通過如下凝乳加入所述原料乳中用副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644發(fā)酵脫脂乳得到的凝乳；所述用副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644發(fā)酵脫脂乳得到的凝乳按照包括如下步驟的方法進行將副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)LBl CGMCC No. 4644在脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到凝乳。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述原料乳、所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和 R704 的配比為 Ikg (1 X 106-1 X 107) CFU (0. 1-0. 15) U ；所述原料乳、所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LBl CGMCC No. 4644和 R704 的配比具體為 Ikg (1X106、5X106或1X107)CFU: (0. 1、0. 12 或 0. 15)U。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的溫度為30°C _32°C，所述培養(yǎng)的溫度具體為30°C、31°C或32°C ； 所述培養(yǎng)的時間為5-6h，所述培養(yǎng)的時間具體為5h、5.證或他； 所述發(fā)酵的溫度為35-37°C，所述發(fā)酵的溫度具體為37°C ； 所述發(fā)酵時間為36h-48h，所述發(fā)酵時間具體為48h ；每IL脫脂乳培養(yǎng)基按照如下方法制備IOOg脫脂乳粉溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水補充至1L，得到的培養(yǎng)基。
8.由權(quán)利要求4-7中任一所述的方法生產(chǎn)的干酪。
9.一種制備干酪的組合物，由權(quán)利要求1所述的副干酪乳桿菌 (Lactobacillusparacasei)LBlCGMCC No. 4644 和發(fā)酵劑組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于所述副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) LBl CGMCC No. 4644和所述發(fā)酵劑的配比為(IXIO6-IXIO7)CFU (ο. ι-ο. 15)υ ；所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) LBl CGMCC No. 4644和所述發(fā)酵劑的配比具體為(1X106、5X106或1X107)CFU (0. 1、0. 12 或 0. 15)U ；所述發(fā)酵劑和所述副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LB1CGMCC No. 4644均為獨立包裝；所述發(fā)酵劑為R704。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高自溶度乳酸菌及其在干酪中的應用。本發(fā)明提供了一種副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LB1，保藏編號為CGMCC No.4644。還提供一種制備干酪的方法，包括如下步驟向原料乳中加入所述的副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)LB1 CGMCC No.4644和發(fā)酵劑，進行培養(yǎng)，得到干酪；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株高自溶度的副干酪乳桿菌LB1，作為附屬發(fā)酵劑添加至干酪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌LB1得到的干酪脂肪含量高，成熟周期短，可以節(jié)約貯藏成本。
文檔編號C12N1/20GK102181393SQ20111008968
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者劉鷺, 呂加平, 孫卓, 孫潔 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所