專利名稱：一種厭氧反應器中活性污泥dna的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及污水處理生化反應器中活性污泥DNA的提取方法，具體是一種厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法。
背景技術：
厭氧生物處理反應器是目前污水處理領域研究的熱門，研究厭氧生物處理反應器的微生物對于揭示厭氧處理的反應機理具有重要意思，傳統(tǒng)的微生物分離純培養(yǎng)技術很難全面客觀的研究其中的厭氧微生物，目前實驗室中可培養(yǎng)的微生物還不到自然界中微生物總數(shù)的1%，厭氧微生物更少，而且還有很多因無法培養(yǎng)而未被人們所認識的微生物。分子生物學技術的引入對于這個難題有了根本的解決辦法，使人們擺脫了對培養(yǎng)技術的依賴， 從分子角度研究微生物的特性，大大促進了厭氧技術的發(fā)展。從環(huán)境樣品中提取高質(zhì)量的總DNA，是做好PCR、DGGE等的前提條件，DNA提取的質(zhì)量對于菌群多樣性的分析起著至關重要的作用。從環(huán)境樣品中提取的DNA要求必須能夠代表該樣品中遺傳多樣性的實際情況，PCR、DGGE等對DNA都有很高的要求，因此有針對性的選擇合適的DNA提取方法并提取出高質(zhì)量的DNA是十分重要的。由于厭氧反應器污泥中的厭氧微生物較為復雜，并且難以破壁，普通的DNA提取方法往往得率較少，而且由于厭氧反應器污泥中所含腐植酸、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)較多，因此通常難以提取到純度較高的DNA，而這些物質(zhì)會對后續(xù)的PCR反應產(chǎn)生抑制性和干擾性的影響，進而影響后面的DGGE、連接和轉(zhuǎn)化等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法存在提取難度大、雜質(zhì)多、產(chǎn)量低的缺點，提供一種厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法。本發(fā)明提取厭氧反應器污泥DNA的方法按如下步驟進行(1)取大約30ml污水樣品，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀；(2)加入5倍沉淀體積的TENP緩沖液和3粒滅菌玻璃珠充分震蕩5分鐘，在4°C 下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀(重復此步驟直到上清夜較為澄清)；(3)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液，充分震蕩，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀(此步驟重復2次)；(4)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液懸?。?5)收集Ig預處理好的污泥樣品，加200 μ L提取緩沖液，加2粒玻璃珠，充分震蕩 5分鐘，使樣品充分懸??；(6)將懸浮液放在-25°c冰箱中冷凍30分鐘后放入65 70°C水浴中加熱30分鐘，每隔10分鐘搖晃一次，使細胞充分裂解(此步驟重復3次)；
(7)加入4 μ L溶菌酶(50mg/mL)，室溫放置5分鐘，然后置于94°C水浴中放置1分鐘；(8)加入 400 μ L SDS 緩沖液，1 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)，1· 5μ L RNA 水解酶(20mg/ ml)，混合后置于37°C水浴中放置1小時；(9)加入與混合液等體積Tris-飽和酚，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分
鐘，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；(10)加入與上清液等體積混合液，混合液組成為苯酚/氯仿/異戊醇，苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25 24 1，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上清液至另一的離心管中；(11)加入0. 6倍上清液體積的異丙醇混勻，室溫放置2小時，在室溫下，12000轉(zhuǎn) /分鐘離心10分鐘，棄上清液；(12)沉淀用70%的乙醇洗滌3次，室溫干燥后加入滅菌蒸餾水溶解沉淀，所得即為 DNA。本發(fā)明厭氧反應器污泥DNA的提取方法步驟⑵中所用到的TENP緩沖液中的 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的主要功能是去除腐殖質(zhì)，因為厭氧反應器中的腐殖質(zhì)含量大，腐殖質(zhì)中所含的腐植酸對后面的PCR反應會起到抑制作用，TENP緩沖液可以有效的去除腐殖質(zhì)，提高DNA的純度。本發(fā)明厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法步驟(6)中將懸浮液放在_25°C冰箱中冷凍30分鐘后放入65 70°C水浴中加熱30分鐘，每隔10分鐘搖晃一次，重復此步驟3次，反復凍融的原理是在_25°C時由于細胞內(nèi)形成冰粒而使剩余細胞液的鹽濃度增大而引起細胞破碎。本發(fā)明的積極效果是，通過加入TENP緩沖液與玻璃珠對厭氧污泥樣品的預處理和反復凍融法的使用，使厭氧污泥的DNA提取效率大大提高，運用本方法提取的DNA產(chǎn)量大、易提取、純度高。另外，本方法可操作性強，TENP緩沖液配制方法簡單，玻璃珠價格便宜， 冰箱和水浴鍋都是實驗室常用儀器，不需要特殊儀器，實驗成本較低。


圖1為本方法提取的厭氧反應器中活性污泥DNA與具體實施方式
二提取的厭氧反應器中活性污泥DNA的瓊脂糖凝膠電泳對比圖，圖2為本方法提取的厭氧反應器中活性污泥DNA與具體實施方式
二提取的厭氧反應器中活性污泥DNA的變形梯度凝膠電泳(DGGE) 對比圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體試驗對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
具體實施方式
一(1)分別取厭氧反應器中前中后3個格室中的污水樣品大約30ml，分別編號1、2 和3，在4°C下， 以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀；(2)加入5倍沉淀體積的TENP緩沖液和3粒滅菌玻璃珠充分震蕩5分鐘，在4°C 下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀；(重復此步驟直到上清夜較為澄清) (3)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液，充分震蕩，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀(此步驟重復2次)；(4)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液懸??；(5)收集Ig預處理好的污泥樣品，加200μ 1提取緩沖液，加2粒玻璃珠，充分震蕩 5分鐘，使樣品充分懸?。?6)將懸浮液放在_25°C冰箱中冷凍30分鐘后放入65 70°C水浴中加熱30分鐘，每隔10分鐘搖晃一次，使細胞充分裂解(此步驟重復3次)；(7)加入4 μ L溶菌酶(50mg/mL)，室溫放置5分鐘，然后置于94°C水浴中放置1分鐘；(8)加入 400 μ L SDS 緩沖液，1 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)，1· 5μ L RNA 水解酶(20mg/ ml)，混合后置于37°C水浴中放置1小時；(9)加入與混合液等體積Tri s_飽和酚，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；(10)加入與上清液等體積混合液，混合液組成苯酚氯仿異戊醇體積比 25 24 1，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上清液至另一的離心管中；(11)加入0. 6倍上清液體積的異丙醇混勻，室溫放置2小時，在室溫下，12000轉(zhuǎn) /分鐘離心10分鐘，棄上清液；(12)沉淀用70%的乙醇洗滌3次，室溫干燥后加入滅菌蒸餾水溶解沉淀，所得即為 DNA。
具體實施方式
二 (1)分別取厭氧反應器中前中后3個格室中的污水樣品大約30ml，分別編號1’、2’ 和3’，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀；(2)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液，充分震蕩，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀；(此步驟重復2次)(3)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液懸浮。(4)收集Ig預處理好的污泥樣品，加200μ 1提取緩沖液，加2粒玻璃珠，充分震蕩 5分鐘，使樣品充分懸浮；(5)加入4 μ L溶菌酶(50mg/mL)，室溫放置5分鐘，然后置于94°C水浴中放置1分鐘；(6)加入 400 μ L SDS 緩沖液，1 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)，1· 5μ L RNA 水解酶(20mg/ ml)，混合后置于37°C水浴中放置1小時；(7)加入與混合液等體積Tris-飽和酚，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分
鐘，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；(8)加入與上清液等體積混合液，混合液組成苯酚/氯仿/異戊醇，體積比為 25 24 1，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上清液至另一的離心管中；(9)加入0. 6倍上清液體積的異丙醇混勻，室溫放置2小時，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心10分鐘，棄上清液；(10)沉淀用70%的乙醇洗滌3次，室溫干燥后加入滅菌蒸餾水溶解沉淀，所得即為 DNA。 從圖1可以看出，本實施方式提取的DNA條帶(條帶1、2和3)清晰明亮，無明顯雜帶，而用現(xiàn)有方法提取的DNA條帶(1’、2’和3’ )幾乎不可見，可見，本實施方式提取的 DNA產(chǎn)量比現(xiàn)有方法有明顯提高。從圖2可以看出，以本實施方式提取的DNA為模版所做的DGGE條帶清晰可見，條帶數(shù)量多，多樣性好，能較好的體現(xiàn)厭氧反應器中的微生物豐富度，以現(xiàn)有方法提取的DNA 為模版所做的DGGE條帶不清晰，條帶數(shù)量少，多樣性差，不能較好地體現(xiàn)厭氧反應器中的微生物豐富度。
權(quán)利要求
1.一種污水處理厭氧反應器活性污泥DNA的提取方法，其特征在于提取厭氧反應器活性污泥DNA的方法按如下步驟進行(1)取大約30ml污水樣品，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體， 收集沉淀；(2)加入5倍沉淀體積的TENP緩沖液和3粒滅菌玻璃珠充分震蕩5分鐘，在4°C下，以 9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀，重復此步驟直到上清夜較為澄清；(3)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液，充分震蕩，在4°C下，以9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去掉液體，收集沉淀，此步驟重復2次；(4)加入5倍沉淀體積的PBS緩沖液懸??；(5)收集Ig預處理好的污泥樣品，加200μ1提取緩沖液，加2粒玻璃珠，充分震蕩5分鐘，使樣品充分懸?。?6)將懸浮液放在_25°C冰箱中冷凍30分鐘后放入65 70°C水浴中加熱30分鐘，每隔10分鐘搖晃一次，使細胞充分裂解，此步驟重復3次；(7)力Π入4μL濃度為50mg/mL的溶菌酶，室溫放置5分鐘，然后置于94°C水浴中放置 1分鐘；(8)加入400μ L SDS緩沖液，IyL濃度為20mg/mL的蛋白酶1(，1.5“1^農(nóng)度為2011^/1^ 的RNA水解酶，混合后置于37°C水浴中放置1小時；(9)加入與混合液等體積Tris-飽和酚，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘， 將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；(10)加入與上清液等體積混合液，混合液組成為苯酚/氯仿/異戊醇，苯酚/氯仿/異戊醇體積比為25 24 1，混勻，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上清液至另一的離心管中；(11)加入0.6倍上清液體積的異丙醇混勻，室溫放置2小時，在室溫下，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清液；(12)沉淀用70%的乙醇洗滌3次，室溫干燥后加入滅菌蒸餾水溶解沉淀，所得即為DNA。
2.按權(quán)利要求1所述的一種厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于步驟(2)中加入5倍沉淀體積的TENP緩沖液和3粒滅菌玻璃珠充分震蕩5分鐘，重復此步驟直到上清夜較為澄清。
3.按權(quán)利要求1所述的一種厭氧反應器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于步驟(2)中所用的TENP緩沖液中個組分的濃度分別為50mM Tris, 20mM EDTA, IOOmM NaCl, 0. 01g/ml PVP, TENP 緩沖液的 ρΗ 值為 10。
4.按權(quán)利要求1所述的一種厭氧反應器活性污泥DNA的提取方法，其特征在于步驟 (6)中將懸浮液放在_25°C冰箱中冷凍30分鐘后放入65 70°C水浴中加熱30分鐘，每隔 10分鐘搖晃一次，重復此步驟3次。
全文摘要
一種污水處理反應器中污泥DNA的提取方法，具體是一種厭氧反應器污泥DNA的提取方法。DNA的提取是分子生物學技術研究的基礎，DNA提取的質(zhì)量對后續(xù)的研究影響非常大，高質(zhì)量的DNA可以為分子生物學研究提供準確的信息，現(xiàn)有厭氧污泥的DNA提取方法普遍存在提取難度大、雜質(zhì)多、產(chǎn)量低的缺點，在一定程度上限制了人們對厭氧污泥的研究。本發(fā)明針對現(xiàn)有厭氧反應器污泥DNA的提取方法存在提取難度大、雜質(zhì)多、產(chǎn)量低的缺點，提供一種厭氧反應器污泥DNA的有效提取方法。本發(fā)明提取的DNA具有產(chǎn)量大、易提取、純度高的特點。
文檔編號C12N15/10GK102220309SQ20111008915
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者李慶亮, 林英姿, 王蕾, 辛明 申請人:吉林建筑工程學院, 李慶亮, 林英姿