專(zhuān)利名稱(chēng)：一種中藥有效部位在抗hiv潛伏治療上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種活性中藥有效部位的發(fā)現(xiàn)及其制備方法，以及在抗HIV潛伏治療上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由HIV感染引起的一種嚴(yán)重危害人們生命健康的傳染性疾病。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)全球艾滋病患者已超過(guò)4000萬(wàn)，每年新增患者500萬(wàn)，而每年死亡約為300萬(wàn)。目前，艾滋病臨床治療方法主要是高效抗逆?zhèn)麂洸《警煼?Highlyactiveantiretroviral therapy, HAART),該療法不僅有效控制HIV復(fù)制，并且能重建AIDS患者的免疫功能，為AIDS的治療打開(kāi)了希望之門(mén)。人們?cè)南Ｍ趹{借HAART完全清除體內(nèi)的HIV，從而達(dá)到徹底治愈AIDS的目的。但隨后的實(shí)踐證明，雖然HAART可以最大限度地抑制患者體內(nèi)病毒復(fù)制，使血漿病毒載量(virus load)降低至現(xiàn)有常規(guī)檢測(cè)方法測(cè)不出的水平，但感染者體內(nèi)仍有病毒持續(xù)存在，一旦停止藥物治療，病毒載量又會(huì)反彈到治療前水平(Ho，D.D. Toward HIV eradication orremission the tasks ahead. Science,1998. 280 :1866-1867.)。HIV難以在體內(nèi)被完全清除的一個(gè)重要原因是HIV-I能夠潛伏在靜息的記憶⑶4+T細(xì)胞中，該潛伏感染細(xì)胞是由一小部分HIV感染的活化⑶4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的，其整合的前病毒缺乏轉(zhuǎn)錄活性，因此不會(huì)被免疫系統(tǒng)和抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的藥物攻擊。盡管感染個(gè)體攜帶潛伏感染細(xì)胞數(shù)量較少，但衰減率是如此之慢，以至于欲在個(gè)體生存期內(nèi)僅靠HAART治療將其徹底清除是不可能的。因此，HIV潛伏感染的靜息CD4+T細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體內(nèi)病毒儲(chǔ)藏庫(kù)(reservoir)的主要部分，同時(shí)也是目前臨床治療不能徹底清除HIV的巨大障石尋(Finzi,D. et al. Latent infection of CD4+T cells provides a mechanism forlifelongpersistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.Nature Med. 1999，5，512-517)。一般認(rèn)為，HIV-I潛伏感染細(xì)胞形成的分子機(jī)制與整合位點(diǎn)處的染色質(zhì)狀態(tài)、抑制性核小體nuc-1的存在、以乙?；癁榇淼谋碛^遺傳修飾、宿主轉(zhuǎn)錄因子如NF-k B以及病毒轉(zhuǎn)錄活化因子Tat等因素有關(guān)(Coiras, M.，M. R. et al. Understanding HIV-Ilatency provides clues for the eradication oflong-term reservoirs. Nat. Rev.Microbiol. . 2009.，7 :798-812)。據(jù)此機(jī)制，研究者提出了清除潛伏病毒儲(chǔ)存庫(kù)的治療策略，即試圖通過(guò)藥物誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)，使其潛伏病毒再次激活，同時(shí)結(jié)合高效抗逆?zhèn)麂洸《警煼霸谌嗣庖呦到y(tǒng)作用下，來(lái)殺死激活的潛伏感染的細(xì)胞，以此加速病毒儲(chǔ)藏庫(kù)的清除(Richman et al. The Challenge of Finding a Cure forHIVInfection, Science, 2009，1304，323)。盡管，該策略已在臨床上已有幾個(gè)治療方案，但其結(jié)果仍未盡人意，不是激活劑無(wú)效，就是雖有效但其毒副作用大。因而，研發(fā)安全有效的能消除病毒儲(chǔ)藏庫(kù)的試劑及相應(yīng)的治療方案已是當(dāng)務(wù)之急。
中藥作為我國(guó)所特有的醫(yī)藥資源，以其種類(lèi)繁多、臨床應(yīng)用廣泛、作用溫和、副作用少等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)的關(guān)注。中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根莖,為一常用的低毒中藥，有健脾益氣等功效?，F(xiàn)有的白術(shù)藥效研究主要集中于增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等方面。綜上所 述，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的、有效誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)的方法和藥物，從而用于抗HIV潛伏治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的、有效誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)的方法和藥物，及其在抗HIV潛伏治療中的應(yīng)用。 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種白術(shù)植物、或其中藥藥材、或白術(shù)提取物的用途，它們被(a)用于制備干預(yù)HIV病毒潛伏的組合物；(b)用于制備治療艾滋病的藥物；或(C)用于制備與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用從而治療艾滋病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的干預(yù)HIV病毒潛伏包括誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)、和/或激活潛伏的HIV病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的治療艾滋病包括抗HIV潛伏治療。在另一優(yōu)選例中，所述的白術(shù)提取物包括白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物。在另一優(yōu)選例中，所述的白術(shù)提取物包括白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物。在另一優(yōu)選例中，所述的提取物含有選自下組的一種或多種成分倍半萜、炔醇、單貼、雙倍半萜。在另一優(yōu)選例中，所述的提取物是通過(guò)溶劑提取法、萃取法、和色譜法而獲得的并且含有以下成分倍半萜、炔醇、單貼、和雙倍半萜。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還包括選自下組的額外組分抗逆?zhèn)麂洸《镜乃幬锖驮鰪?qiáng)免疫力的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物或藥物包括口服制劑和非口服制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的制劑包括粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、酊劑、口服液、片劑或含片。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種可用于預(yù)防/治療艾滋病的有效部位，所述的有效部位具有以下特征(a)該有效部位是提取自白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物；或提取自白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物；(b)該有效部位含有選自下組的一種或多種成分倍半萜、炔醇、單貼、雙倍半萜；和(c)該有效部位具有誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)、和/或激活潛伏的HIV病毒的功能。在另一優(yōu)選例中，該有效部位是通過(guò)溶劑提取法、萃取法、和色譜法而獲得的。在另一優(yōu)選例中，所述的有效部位是通過(guò)溶劑提取法、萃取法、和色譜法而獲得的并且含有以下成分倍半萜、炔醇、單貼、和雙倍半萜。在另一優(yōu)選例中，所述的萃取法用二氯甲烷進(jìn)行萃取。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發(fā)明第二方面中所述的有效部位和藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還包括選自下組的額外組分抗逆?zhèn)麂洸《镜乃幬铩?在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)的方法，包括步驟在白術(shù)提取物存在下，培養(yǎng)所述的HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中，使得潛伏的HIV前病毒表達(dá)，從而激活潛伏的HIV病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對(duì)被激活的HIV病毒進(jìn)行殺滅或抑制。在另一優(yōu)選例中，所述的白術(shù)提取物的濃度為0. 01-100微克/ml，較佳地為
0.1-10 微克 /ml。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種預(yù)防或治療艾滋病的方法，包括步驟給需要的對(duì)象施用本發(fā)明第二方面中所述的有效部位或第三方面中所述的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物，包括人。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種激活潛伏的HIV病毒的方法，包括步驟將HIV病毒潛伏感染細(xì)胞與白術(shù)提取物接觸，或者給需要的對(duì)象施用本發(fā)明第二方面中所述的有效部位或第三方面中所述的藥物組合物，從而激活潛伏的HIV病毒。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備用于治療艾滋病的藥物組合物的方法，包括步驟將本發(fā)明第二方面中所述的有效部位與藥學(xué)上可接受的載體混合，從而形成藥物組合物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中，白術(shù)有效部位的LC-MS組分分析圖，結(jié)果表明主要成分為倍半萜、雙倍半萜和單萜等。其中包括色譜圖(上，A)、負(fù)離子流圖(中，B)和正離子流圖(下，C)圖2顯示了在熒光顯微鏡下觀察下，白術(shù)有效部位對(duì)HIV潛伏的誘導(dǎo)激活作用。其中包括加有效部位組(圖2A為熒光照片，圖2B為同一視野白光照片)，未加有效部位(圖2C為熒光照片，圖2D為同一視野白光照片)。為了便于在打印文本上識(shí)別，熒光照片經(jīng)去色處理后，其熒光細(xì)胞為白色。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外發(fā)現(xiàn)白術(shù)或其白術(shù)提取物具有抗HIV潛伏的作用。具體地，本發(fā)明人采用獨(dú)創(chuàng)的活性篩選方法發(fā)現(xiàn)具有抗艾滋病中藥白術(shù)，并用溶劑提取法、梯度萃取、硅膠柱色譜等工藝，結(jié)合活性篩選確定和制備有效部位，制成的白術(shù)有效部位可作為抗艾滋病的活性成分。本發(fā)明的有效部位具有干預(yù)HIV潛伏的作用，與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，可清除被激活的潛伏感染的細(xì)胞，以此加速潛伏病毒儲(chǔ)藏庫(kù)的清除，將為艾滋病的徹底治愈提供新的途徑。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。白術(shù)如本文所用，術(shù)語(yǔ)“白術(shù)”指英文名為L(zhǎng)argehead Atractylodes Rh,拉丁名為Rhizoma Atractylodis Macrocephalae的藥材。白術(shù)藥材是為菊科植物白術(shù)Atractylodesmacrocephala Koidz.的根莖。白術(shù)的其他名稱(chēng)包括山薊、楊抱薊、山芥等。有效部位及其制法本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的提取物”、“本發(fā)明的有效部位”和“本發(fā)明的抗HIV潛伏 的有效部位”可互換使用，都指提取自中藥白術(shù)、植物白術(shù)或與白術(shù)同屬的植物的、具有誘導(dǎo)HIV潛伏感染細(xì)胞的前病毒表達(dá)，從而使?jié)摲《炯せ畹淖饔玫奶崛∥?。在本發(fā)明中，抗HIV潛伏的有效部位可用中藥白術(shù)、植物白術(shù)或與白術(shù)同屬的植物為原料進(jìn)行提取。此外，雖然抗HIV潛伏的有效部位可來(lái)自于植物白術(shù)的全部，優(yōu)選非果部分，其中包括根、莖等部位，但是也可從植物白術(shù)的枝、葉等部位提取。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“提取物”或“有效部位”包括水溶性的和/或脂溶性的提取物。該術(shù)語(yǔ)還包括醇提物、或水提物。此外，還包括有效部位群，即含有脂溶性有效部位和水溶性有效部位的萃取物或其混合物。經(jīng)分析，本發(fā)明有效部位所含的化學(xué)成分至少包括選自下組的一種或多種組分倍半萜、炔醇、單貼、雙倍半萜等?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的白術(shù)提取物的方法沒(méi)有特別限制?？梢杂贸Ｒ?guī)方法，以中藥白術(shù)、植物白術(shù)或與白術(shù)同屬的植物為原料，獲得水溶性的和/或脂溶性的提取物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，有效部位的制備通過(guò)溶劑提取法、萃取法、和/或色譜法進(jìn)行。在本發(fā)明中，對(duì)于溶劑提取法，其所用的溶劑沒(méi)有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或幾種溶劑的混合溶劑。提取次數(shù)可以是一次或多次。在本發(fā)明中，對(duì)于溶劑梯度萃取法，其所用的溶劑沒(méi)有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、環(huán)己烷、石油醚中的一種或幾種溶劑的混合溶劑。萃取次數(shù)可以是一次或多次；在本發(fā)明中，對(duì)于柱色譜法，其柱色譜沒(méi)有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)活性碳、硅膠、反相硅膠、大孔樹(shù)脂、葡聚糖凝膠中的一種或幾種的組合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，以中藥白術(shù)、植物白術(shù)或與白術(shù)同屬的植物為原料，以2-10倍藥材重的70-99%乙醇(或乙醇水溶液)提取1-5次，回收乙醇，得到乙醇提取物。乙醇提取物溶于0. 5-2倍重量的水(優(yōu)選50-99°C的熱水)，冷卻后以二氯甲烷萃取，經(jīng)過(guò)活性篩選，表明二氯甲烷提取物可有效干擾或干預(yù)HIV病毒潛伏。對(duì)二氯甲烷提取物經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚乙酸乙酯為洗脫溶劑，除去油脂等化學(xué)成分，得到脂溶性的部位，篩選發(fā)現(xiàn)具有最強(qiáng)活性，即為有效部位，有效部位經(jīng)LC-MS分析，其主要成分為倍半萜、雙倍半萜和單萜等。組合物和施用方法如本文所用，術(shù)語(yǔ)“組合物”包括(a)治療艾滋病的組合物，(b)激活潛伏的HIV病毒的組合物。此外，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。本發(fā)明的抗HIV潛伏的有效部位具有干預(yù)HIV潛伏的作用。因此，當(dāng)在治療上施用或給予本發(fā)明的抗HIV潛伏的有效部位時(shí)，可促進(jìn)潛伏的HIV病毒的表達(dá)，進(jìn)而激活潛伏的HIV病毒。通常，可將本發(fā)明的有效部位配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的有效部位以及藥 學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。作為預(yù)防和抗艾滋病藥物，可以制成口服和非口服制劑?？诜o藥可制成片劑、散齊U、顆粒劑、膠囊劑等常用劑型，所用的賦型劑可以為淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羥甲基纖維素等中的一種或幾種。崩解劑可以為馬鈴薯淀粉、羥甲基纖維素等中的一種或幾種。粘合劑可以為阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠、糊精等中的一種或幾種?？诜苿┏鲜鰟┬屯猓€可以制成乳劑、糖漿劑等。非口服制劑可以制成注射劑，可以與注射用水、生理鹽水、葡萄糖水制成注射劑，也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。此外，本發(fā)明的有效部位還特別適合與其他抗HIV的藥物聯(lián)用。尤其是本發(fā)明的有效部位可與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，清除潛伏感染的細(xì)胞，從而用于艾滋病的治療。作為預(yù)防和抗HIV的有效部位，白術(shù)有效部位的用量可以為成年人每日I lOOOmg，優(yōu)選10 800mg/天，每日服用I 5次。兒童的用量和次數(shù)需在成人的基礎(chǔ)上酌情遞減。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(a)發(fā)現(xiàn)了一種新的有效抗HIV潛伏的藥材及其提取物，該發(fā)現(xiàn)對(duì)于新型抗艾滋病藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。(b)白術(shù)早已長(zhǎng)期廣泛使用，是一種安全的低毒副作用的常用中藥材。(c)制備有效部位的工藝簡(jiǎn)單實(shí)用，獲得有效部位在低濃度時(shí)即能明顯干預(yù)HIV潛伏。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
實(shí)施例I白術(shù)抗HIV有效部位的制備中藥白術(shù)(1kg，切碎的藥材)以95%乙醇回流提取(8L x 3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. 19kg)。乙醇提取物溶于200mL熱水，冷卻后依次用石油醚(200mL x 3)、二氯甲烷萃取(200mL X 3)，得到二氯甲烷提取物(21g)。二氯甲烷提取物經(jīng)硅膠柱色譜(1kg，柱徑10cm)，以石油醚乙酸乙酯(100 I)(IOL)洗脫除去油脂部分，而后以石油醚乙酸乙酯(I I) (IOL)洗脫得到有效部位 (9. Ig)。對(duì)得到的有效部位進(jìn)行鑒定，方法如下分析色譜條件色譜柱為Zorbax SB_C18column (5 u m, 250mmX 4. 6mm ;AgilentTechnologies,USA);流動(dòng)相為A相0.5%醋酸水，B相為0.5%醋酸乙腈。梯度如下30min內(nèi)從25% B相到 40% B 相，30min-45min 從 40% B 相到 50% B 相，45min_125min 從 50% B 相到 70%B相，125min-130min從70% B相到80% Bffio流速為0. 5mL/min，柱溫為25°C，進(jìn)樣體積10 u L，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。質(zhì)譜條件流動(dòng)相及梯度同色譜條件；ESI離子源為正負(fù)離子檢測(cè)；毛細(xì)管電壓為-15V ;離子噴霧電壓為-4. 5V ;透鏡偏置電壓為-30V ;噴霧氣和鞘氣均為高純氮?dú)?N2),流速為30a. u.;輔助氣為高純氮?dú)?N2)，流速為10a. u.;碰撞氣為高純氦氣(He) ;MSn碰撞能量為30% -40% ;毛細(xì)管溫度為350°C ;質(zhì)荷比掃描范圍為m/z 100-2000 ;掃描寬度為3. OTh0LC-MS結(jié)果如圖I所示，包括色譜圖(上，A)、負(fù)離子流圖(中，B)和正離子流圖(下，C)。結(jié)果表明主要成分為倍半萜、炔醇、雙倍半萜和單萜等。實(shí)施例2有效部位對(duì)HIV潛伏誘導(dǎo)激活的影響一、方法Cll細(xì)胞是一種HIV潛伏感染細(xì)胞模型，是將攜帶EGFP報(bào)告基因的HIV-I的慢病毒感染人T淋巴細(xì)胞系Jurkat，通過(guò)細(xì)胞分選和HIV整合檢測(cè)，而獲得的具有HIV整合但未表達(dá)EGFP的T淋巴細(xì)胞系。Cll細(xì)胞是被攜帶報(bào)告基因GFP的HIV慢病毒感染同時(shí)又不表達(dá)的Jurkat穩(wěn)定株，因而用于篩選激活潛伏感染HIV-I藥物(參見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)?00810038851.X，發(fā)明名稱(chēng)“一種篩選激活潛伏感染HIV-I化合物的T淋巴細(xì)胞及其制備方法”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng))，保藏號(hào)為CCTCCNO. C200821。在本實(shí)施例中，按每孔2 X IO4個(gè)細(xì)胞，將Cl I細(xì)胞種植于96孔板，每孔加入100 ill含10% FBS(Gibco)的1640培養(yǎng)基(Gibco)。24小時(shí)后，加入實(shí)施例I中制備的有效部位至終濃度I U g/mL。每個(gè)濃度至少3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物處理細(xì)胞72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，并收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析熒光細(xì)胞所占比例。二、結(jié)果以終濃度為I U g/mL的有效部位處理HIV潛伏感染細(xì)胞模型，在藥物處理后的3天，通過(guò)對(duì)報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP的熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析HIV潛伏感染細(xì)胞的激活效率，從而獲得藥物作用的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)有效部位處理后綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例達(dá)高達(dá)43% ;未加有效部位處理的HIV潛伏感染細(xì)胞，其熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例僅有不到I %背景激活。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，有效部位對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞有極其顯著的干預(yù)作用。實(shí)施例3不同濃度的有效部位對(duì)HIV潛伏誘導(dǎo)激活的影響重復(fù)實(shí)施例2，不同點(diǎn)僅在于，用終濃度為0. g/mL、0. g/mL、2ii g/mL、或5 U g/mL的白術(shù)有效部位替換原終濃度為I U g/mL的白術(shù)有效部位。結(jié)果表明，在上述濃度下，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)不同白術(shù)有效部位處理后綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例為10-80%，遠(yuǎn)高于對(duì)照不到1%的背景激活。這表明，本發(fā)明的有效部位對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞有顯著的干預(yù)作用。實(shí)施例4白術(shù)的醇提取物對(duì)HIV潛伏誘導(dǎo)激活的影響本實(shí)驗(yàn)所用HIV潛伏細(xì)胞模型為攜帶綠色熒光蛋白基因的人T細(xì)胞10. 6克隆株(J-Lat Full Length Clone 10. 6)。該細(xì)胞模型可獲自美國(guó)國(guó)家健康衛(wèi)生研究院AIDS參考試劑計(jì)劃部。該細(xì)胞小，球形細(xì)胞被懸浮培養(yǎng)。由攜帶綠色熒光蛋白基因HIV-R7/E-/GFP反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染人T細(xì)胞Jurkat精細(xì)胞分選而來(lái)(Jordan A,Bisgrove D, Verdin E. HIVreproducibly establishes a latentinfection after acute infection of T cells invitro. EMBO J 22:1868-1877,2003)。在本實(shí)施例中，中藥白術(shù)(0. 5kg，切碎的藥材)以90%乙醇回流提取(4L x3)，回收乙醇得乙醇提取物(0. Ikg)。按每孔2X IO4個(gè)細(xì)胞，將10. 6克隆株細(xì)胞種植于96孔板，每孔加入100 含10% FBS(Gibco)的1640培養(yǎng)基(Gibco)。24小時(shí)后，加入本實(shí)施例制備的白術(shù)的乙醇提取物至終濃度10 u g/mL。每個(gè)濃度至少3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物處理細(xì)胞72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白6FP表達(dá)情況，并收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析熒光細(xì)胞所占比例。結(jié)果以終濃度為10 U g/mL的白術(shù)乙醇提取物處理HIV潛伏感染細(xì)胞模型，在藥物處理后的3天，通過(guò)對(duì)報(bào)告基因綠色熒光蛋白6FP的熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析HIV潛伏感染細(xì)胞的激活效率，從而獲得藥物作用的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，HIV潛伏感染細(xì)胞經(jīng)白術(shù)乙醇提取物處理后綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例達(dá)高達(dá)59% ;未加白術(shù)乙醇提取物處理的HIV潛伏感染細(xì)胞，其熒光陽(yáng)性的細(xì)胞比例僅有不到I %背景激活。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，白術(shù)乙醇提取物對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞有干預(yù)作用。實(shí)施例5藥物組合物用實(shí)施例I相同方法制備提取物50g與藥用淀粉IOOg為原料，不添加任何其他成分，灌制成膠囊，凈重每粒200mg。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理 解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種白術(shù)植物、或其中藥藥材、或白術(shù)提取物的用途，其特征在于，(a)用于制備干預(yù)HIV病毒潛伏的組合物；(b)用于制備治療艾滋病的藥物；或(c)用于制備與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用從而治療艾滋病的藥物。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的白術(shù)提取物包括白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物。
3.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的白術(shù)提取物包括白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物。
4.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的提取物含有選自下組的一種或多種成分倍半萜、炔醇、單貼、雙倍半萜。
5.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。
6.一種可用于治療艾滋病的有效部位，其特征在于，所述的有效部位具有以下特征 (a)該有效部位是提取自白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的水溶性的和/或脂溶性的提取物；或提取自白術(shù)植物或其同屬植物的枝、葉、根、和/或莖的醇提取物； (b)該有效部位含有選自下組的一種或多種成分倍半萜、炔醇、單貼、雙倍半萜；和 (c)該有效部位具有誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)、和/或激活潛伏的HIV病毒的功能。
7.—種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述的有效部位和藥學(xué)上可接受的載體。
8.—種體外非治療性誘導(dǎo)HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中HIV前病毒表達(dá)的方法，其特征在于，包括步驟在白術(shù)提取物存在下，培養(yǎng)所述的HIV病毒潛伏感染細(xì)胞中，使得潛伏的HIV前病毒表達(dá)，從而激活潛伏的HIV病毒。
9.一種激活潛伏的HIV病毒的方法，包括步驟將HIV病毒潛伏感染細(xì)胞與白術(shù)提取物接觸，或者給需要的對(duì)象施用權(quán)利要求6所述的有效部位或權(quán)利要求7所述的藥物組合物，從而激活潛伏的HIV病毒。
10.一種制備用于治療艾滋病的藥物組合物的方法，其特征在于，包括步驟將權(quán)利要求6所述的有效部位與藥學(xué)上可接受的載體混合，從而形成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種中藥有效部位在抗HIV潛伏治療上的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明采用獨(dú)創(chuàng)的活性篩選方法發(fā)現(xiàn)具有抗艾滋病中藥白術(shù)，并用溶劑提取法、梯度萃取、硅膠柱色譜等工藝，結(jié)合活性篩選確定和制備有效部位，制成的白術(shù)有效部位作為抗艾滋病的活性成分。本發(fā)明的有效部位具有干預(yù)HIV潛伏的作用，可與抗逆?zhèn)麂洸《舅幬锫?lián)合使用，加速潛伏病毒儲(chǔ)藏庫(kù)的清除，將為艾滋病的徹底治愈提供新的途徑。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102727551SQ201110086350
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者朱煥章, 馬忠俊 申請(qǐng)人:上海鑫昊生物科技有限公司