專利名稱：用于快速恒溫基因突變檢測的聚合酶鏈反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科技和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種簡單、敏感且快速的實時核酸擴增的聚合酶鏈反應(yīng)恒溫基因擴增方法、以及用于該方法的特殊引物組及試劑盒。本方面的方法、引物及試劑盒可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床診斷中的血液、細胞組織等各種生物樣品中特定DNA基因野生型或突變樣本的檢測(例如包括但不限于EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、PDGFR、ABL或其它癌基因等野生型或突變基因)，也可用于特定基因的恒溫擴增。
背景技術(shù)：
A.基因檢測的臨床意乂基因檢測主要是用于疾病的診斷，疾病的預(yù)防和指導(dǎo)個體化用藥。例如，對結(jié)核桿菌感染的診斷，以前主要依靠痰、糞便或血液培養(yǎng)，整個檢驗流程需要在兩周以上，現(xiàn)在采用基因診斷的方法，不僅敏感性大大提高，而且在I小時內(nèi)就能得出結(jié)果。疾病的預(yù)防，就是檢測健康人群的基因型，預(yù)測個人患病的風(fēng)險，并向受檢者提出生活上的指導(dǎo)，避免疾病的發(fā)生。比如結(jié)腸癌，APC基因、DCC基因和P53基因的缺陷與腸癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。這幾個基因存在缺陷的人具有患上結(jié)腸癌的高風(fēng)險。通過基因檢測，在上皮細胞的增生還沒有真正演化成結(jié)腸癌的時候，就能夠發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的苗頭，及早采取措施進行預(yù)防，就有可能防止結(jié)腸癌的產(chǎn)生。臨床上研究發(fā)現(xiàn)基因UGTlAl啟動子區(qū)域的多態(tài)性與藥物伊立替康的毒副作用有相關(guān)性。如果盲目用藥可造成中性粒細胞減少及腹瀉的副作用。美國FDA已建議病人在使用伊立替康前要進行UGTlAl基因型的檢測。中國國家衛(wèi)生部在新的臨床檢驗項目目錄中也增列了 “化學(xué)藥品個體化用藥基因檢測項目”。UGTlAl基因型檢測對于臨床正確用藥，減少毒副作用，提高療效具有明確的臨床意義。因此，從臨床角度而言，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)出更為簡便、靈敏且快速的基因檢測方法以及適用于該方法的引物和試劑盒。B.基因突變檢測的臨床意義隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的不斷深入，對疾病發(fā)病機制、診斷及防治的研究已達到分子水平，從基因水平診斷和防治疾病已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要課題。突變基因改變了原有的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致原有的遺傳性狀發(fā)生改變，其中一部分基因突變可導(dǎo)致遺傳病或具有遺傳傾向的病甚至腫瘤。如血友病是凝血因子基因的突變、地中海貧血是珠蛋白的基因突變等。具有遺傳傾向的高血壓病、糖尿病、潰瘍病等系多基因變異與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。腫瘤是體細胞基因突變的結(jié)果?；蛟\斷(gene diagnosis)就是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法?；蛟\斷的檢測目的物是DNA或RNA，前者反映基因的存在狀態(tài)，后者反映基因的表達狀態(tài)。傳統(tǒng)的診斷方 法主要以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，生物個體的表型性狀是基因在一定條件下的體現(xiàn)，基因的改變可導(dǎo)致各種表型的改變而出現(xiàn)疾病。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使開展基因診斷成為可能。因此，基因突變的檢測對于基因突變相關(guān)疾病的發(fā)病機理研究、診斷、易感性評估、患者用藥選擇、和/或預(yù)后評估具有非常重要的意義。以表皮生長因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor, EGFR)和 KRAS 基因為例。目前，EGFR與KRAS基因靶向治療已成為晚期非小細胞肺癌(Non-small cell lungcancer, NSCLC)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)易瑞沙和特羅凱藥物治療的研究的熱點。研究表明，易瑞沙和特羅凱治療效果顯著的患者中EGFR基因突變的發(fā)生率明顯高于治療無效者。在有EGFR基因突變的患者中易瑞沙和特羅·凱的腫瘤客觀緩解率明顯高于無突變的患者。EGFR基因突變率為33%，且突變部位90%左右位于編碼酪氨酸激酶區(qū)的外顯子19及外顯子21 (如L858R)，為雜合突變。EGFR的突變表達對選擇酪氨酸激酶抑制劑治療有著重要的指導(dǎo)意義，目前用于檢測EGFR基因突變的標本多為手術(shù)切除的腫瘤組織標本，但晚期病人很難獲得腫瘤組織，尋找一種易獲得的腫瘤組織替代標本進行EGFR基因突變的檢測，從中篩選出適合酪氨酸激酶抑制劑治療的患者，實現(xiàn)個體化治療，對臨床工作非常重要。KRAS基因是EGFR信號通路中的重要分子之一，它是位于12號染色體pl2. I位置上的21kD大小的蛋白。突變型KRAS不依賴刺激信號的激活，即突變型KRAS基因不受上游EGFR基因狀態(tài)的影響，始終處于激活狀態(tài)，只有野生型KRAS基因受上游EGFR信號刺激的影響，這也是具有突變型KRAS基因患者對抗EGFR藥物(例如愛必妥(Erbitux)、維克替比(Vectibix, Panitumumab)等)治療無效的理論基礎(chǔ)。KRAS基因的點突變主要集中在特定的氨基酸密碼子(第12、13、61密碼子)上，占所有突變的90%以上。KRAS基因突變可以導(dǎo)致細胞逃逸凋亡，這種異常在胰腺癌、大腸癌、肺癌等腫瘤中的發(fā)生率較高。在胰腺癌中，KRAS基因的點突變發(fā)生率高達90%以上。檢測KRAS基因突變，對判斷這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后以及了解腫瘤的治療效果具有積極的意義。在正常人血中檢出KRAS基因突變則提示存在腫瘤易感性；良性腫瘤患者若檢出KRAS基因突可能提示有惡變的可能；KRAS基因突變陽性則預(yù)示著癌癥復(fù)發(fā)的可能性也很高，預(yù)后差基因突變的肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤患者，經(jīng)抗EGFR靶向藥物治療療效明顯。目前KRAS基因突變檢測已被寫入美國最新版《NCCN結(jié)直腸癌臨床實踐指南》。因此，通過檢測KRAS基因突變狀態(tài)可以篩選出針對抗EGFR靶向藥物治療有效的結(jié)直腸癌患者，幫助臨床醫(yī)生選擇制定對腫瘤患者最有效的治療方法。在通常情況下，60%左右結(jié)直腸癌患者的KRAS基因都是野生型的，如果都接受了 KRAS基因突變檢測，通過個體化的綜合治療方案，有效率可顯著增加。因此，從臨床角度而言，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)出更為簡便、靈敏且快速的基因突變檢測方法以及適用于該方法的引物和試劑盒。C.基因突變的檢測技術(shù)基因突變，主要是指DNA分子發(fā)生的可遺傳的變異，是基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變。基因突變的形式可以是核酸置換、插入、缺失和重疊等多種。在當(dāng)今生命科學(xué)研究中，基因突變與各種疾病(例如腫瘤)的相關(guān)性已成為研究熱點之一，檢測方法也隨之迅速發(fā)展。聚合酶鏈反應(yīng)擴增技術(shù)(PCR)的應(yīng)用使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，并且由于PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，分析結(jié)果的準確性、敏感性也有較大的提高。在這些方法中具有代表性的方法包括PCR聯(lián)合核酸序列分析、Taqman探針實時PCR法、突變體富集PCR法、DNA芯片技術(shù)、擴增阻礙突變系統(tǒng)等。PCR聯(lián)合核酸序列分析:這是一種基于PCR的核酸序列測定方法，是所有其它快速簡便檢測變異技術(shù)的基礎(chǔ)，也是檢測點突變最直接、最基本的一種方法。序列測定的模板主要來源于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，最后都需用序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達到100%。測序方法的基本原理是Sanger發(fā)明的雙脫氧DNA鏈末端終止法。這種直接測序是檢測基因突變的經(jīng)典方法，但敏感性低，只有當(dāng)變異基因占總基因的25%以上時才能被檢測到。突變體富集PCR法:該方法利用癌基因或抑癌基因某個編碼子部位存在已知的限 制性內(nèi)切酶位點(如KRAS基因第12密碼子的BstNI位點)，用連續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括存在酶位點編碼子的DNA片段(例如包括KRAS第12密碼子的DNA片段)，在兩次擴增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。該方法的敏感性在10%左右。DNA芯片技術(shù):該方法是90年代后發(fā)展的一項DNA分析新技術(shù)，它集合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標記探針和DNA合成等先進技術(shù)。其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在I塊集成電路板上，彼此之間重疊I個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標記的正常DNA和突變DNA分別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在I個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變。該方法快速簡單、自動化程度高。擴增阻石導(dǎo)突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System, ARMS):用于對已知突變基因進行檢測。該方法是基于引物3'端錯配PCR的方法，如引物3'端堿基與模板錯配會導(dǎo)致Taq酶擴增效率下降。該法通過設(shè)計兩個5'端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3'端引物進行兩個平行PCR，與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3'端則導(dǎo)致PCR不能延伸，ARMS技術(shù)借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點，但優(yōu)點是反應(yīng)將選擇性擴增單鏈基因。該技術(shù)的敏感性提高到I %左右。上述不同的方法在特異性方面上比起傳統(tǒng)的PCR都有所提高，但靈敏度、性價比、臨床應(yīng)用高通量等方面有待于進一步加強。由此，本領(lǐng)域中仍迫切需要開發(fā)出更為簡便、靈敏且快速的基因突變檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就在于提供一種簡便、靈敏且快速的基因檢測方法。本發(fā)明的另一目的在于提供適用于該方法的引物，以及包含適用于本發(fā)明方法的引物和其它試劑的試劑盒。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種用于基因檢測的恒溫聚合酶鏈式反應(yīng)方法，所述方法包括
A)針對待檢測的靶基因DNA序列，圍繞其擴增基因片段周圍的5個不同區(qū)域提供如下5種引物(a)基于靶基因3’端的外部引物；(b)基于靶基因3’端的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物；(c)基于靶基因中間部位的激勵擴增引物；(d)基于靶基因外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和(e)基于靶基因5’端的外部引物；B)提供包含A)中所述引物的聚合酶鏈式反應(yīng)體系，并將待測DNA樣品加入所述反 應(yīng)體系中，其中如果該樣品所含為雙鏈DNA，則在將其加入所述反應(yīng)體系之前，對該樣品進行變性；C)在50 70°C的恒溫下進行聚合酶鏈式反應(yīng)；D)通過將待檢測DNA的恒溫基因擴增反應(yīng)數(shù)據(jù)或圖譜與陽性對照比較，獲得基因檢測結(jié)果。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述待測DNA樣品來自血液、組織或組織切片、培養(yǎng)細胞。在一個優(yōu)選例中，所述待測DNA樣品來源于人的細胞和外周血(如全血、血清或血漿)。在另一個優(yōu)選例中，所述待測DNA樣品可獲自人的新鮮獲取的或固定的手術(shù)樣品、內(nèi)鏡活檢樣品、或穿刺胸腹水樣品。在另一個優(yōu)選例中，所述待測DNA樣品來源于人、動物或病原菌。在另一個優(yōu)選例中，所述靶基因選自EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、TOGFR、和ABL基因或它們的突變體。在另一個優(yōu)選例中，所述靶基因是野生型基因或突變基因。在另一個優(yōu)選例中，所述突變基因為純合突變或雜合突變，且突變區(qū)位于擴增基因片段中。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述引物是合成的核酸引物或肽核酸合成的弓I物。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述反應(yīng)體系包含DNA、水、MgCl2、4種dNTP、緩沖液、以及脂肪芽胞桿菌聚合酶。在一個優(yōu)選例中，所述脂肪芽胞桿菌聚合酶的用量為2 12U，優(yōu)選4 10U，更優(yōu)選4 6U。在另一個優(yōu)選例中，所述脂肪芽胞桿菌聚合酶購自NEB。在另一個優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包含核酸染料(優(yōu)選SYBR Green I)或標記分子。在另一個優(yōu)選例中，所述雙鏈DNA的變性是在90 110°C，優(yōu)選98±0. 5°C的溫度下，處理3 10分鐘，優(yōu)選5分鐘。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述反應(yīng)在55 65 °C的溫度下進行20 60分鐘。在一個優(yōu)選例中，所述反應(yīng)在60 ±0. 5 °C的溫度下進行，反應(yīng)時間為20 50分鐘。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述反應(yīng)數(shù)據(jù)或圖譜是通過選自下組的方法獲得的生物標記物的定量分析或突光標記物的定量分析。在一個優(yōu)選例中，所述的基因檢測結(jié)果選自確定樣品中靶基因的存在與否、靶基因中是否存在突變、或突變?yōu)殡s合突變還是純合突變。在另一個優(yōu)選例中，所述陽性對照是已知的靶基因序列、和/或包含已知突變的序列，所述序列可通過人工合成制得、基因工程化方法獲得、或通過本領(lǐng)域常規(guī)方法從生物樣品中分離而得。
在另一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的方法用于判定靶基因序列的存在與否，陽性對照為靶基因序列，如果結(jié)果持續(xù)顯示陽性信號(即出現(xiàn)與陽性對照相同或相似的信號)，則表明樣品中存在祀基因序列。在另一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的方法用于判定靶基因中是否存在特定突變時，陽性對照為包含該特定突變的靶基因序列，如果突變靶點引物反應(yīng)結(jié)果持續(xù)顯示陽性信號時，表明靶基因中存在基因突變；如果結(jié)果未顯示陽性信號時，表明靶基因中無基因突變。在另一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的方法用于判定靶基因中的突變?yōu)榧兒贤蛔冞€是雜合突變，陽性對照分別為包含該特定突變的靶基因序列和不包含突變的正常靶基因序列，當(dāng)檢測結(jié)果顯示無正?；虬悬c引物反應(yīng)信號而只有突變靶點引物反應(yīng)結(jié)果時，表明靶基因中存在的是純合突變；當(dāng)結(jié)果顯示正?；虬悬c引物反應(yīng)結(jié)果和突變靶點引物反應(yīng)結(jié)果都時存在時，表明靶基因中所存在的基因突變是雜合突變。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種引物組，其包括(a)基于靶基因3’端DNA序列的外部引物；(b)基于靶基因3’端DNA序列的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物；(c)基于靶基因DNA序列中間部位的激勵擴增引物；(d)基于靶基因DNA序列外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和(e)基于靶基因DNA序列5’端的外部引物。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種試劑盒，其包括單獨或混合的本發(fā)明的引物組中的各成員；一個或多個容器。在一個優(yōu)選例中，所述試劑盒還任選包含選自下組物質(zhì)中的一種或多種DNA、水、MgCl2,4種dNTP、核酸染料、PCR緩沖液、以及脂肪芽胞桿菌聚合酶。在另一個優(yōu)選例中，所述脂肪芽胞桿菌聚合酶的量為2 12U，優(yōu)選4 10U，更優(yōu)選4 6U。在另一個優(yōu)選例中，所述核酸染料為任何能與dsDNA結(jié)合的，優(yōu)選SYBRGreen。在本發(fā)明的第四方面中，提供了本發(fā)明的引物組在制備用于恒溫基因擴增或檢測的聚合酶鏈反應(yīng)的試劑盒中的用途。在一個優(yōu)選例中，所述試劑盒如前所述。在另一個優(yōu)選例中，所述試劑盒用于檢測樣品中靶基因的存在與否、靶基因中是否存在突變、或靶基因中的突變?yōu)榧兒贤蛔冞€是雜合突變。在另一個優(yōu)選例中，所述試劑盒用于遺傳或基因突變相關(guān)疾病的診斷、易感性評估、患者用藥選擇、和/或預(yù)后評估。在另一個優(yōu)選例中，所述遺傳或基因突變相關(guān)疾病選自癌癥、血液病或先天性遺傳性疾病，所述癌癥優(yōu)選直腸癌、胃腸道癌、非小細胞肺癌、胃腸間質(zhì)瘤、白血病(優(yōu)選慢性粒細胞性白血病)、腺癌等。在本發(fā)明的第五方面中，提供了本發(fā)明的引物組在聚合酶鏈式反應(yīng)中的用途，所述反應(yīng)選自聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、環(huán)介導(dǎo)恒溫聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、對稱或不對稱的單鏈聚合酶鏈式反應(yīng)擴增。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I :采用本發(fā)明的核酸基因恒溫擴增方法所獲得的陽性結(jié)果的典型熒光峰圖，其中橫坐標為反應(yīng)時間(單位分鐘)，縱坐標為標準化的熒光強度值(Fluorescence(norm))。圖2 :采用本發(fā)明的核酸基因恒溫擴增方法所獲得的陰性結(jié)果的典型熒光峰圖，其中橫坐標為反應(yīng)時間(單位分鐘)，縱坐標為標準化的熒光強度值。圖3 :采用本發(fā)明的核酸基因恒溫擴增方法對不同拷貝數(shù)DNA進行檢測的結(jié)果，其中A 3000拷貝；B 600拷貝；C :300拷貝；D :60拷貝；E :30拷貝；F 6拷貝；G 3拷貝；H 0拷貝；橫坐標為反應(yīng)時間(單位分鐘)，縱坐標為標準化的熒光強度值。圖4 :采用現(xiàn)有技術(shù)的熒光探針即時PCR擴增方法對不同拷貝數(shù)DNA進行檢測的結(jié)果，其中A 3000拷貝；B 600拷貝；C :300拷貝；D :60拷貝；E :30拷貝；F 6拷貝；G 3拷貝0拷貝；橫坐標為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標為標準化的熒光強度值。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究開發(fā)出一種簡單、靈敏且快速進行核酸擴增的聚合酶鏈反應(yīng)恒溫基因擴增技術(shù)方法，該方法可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床診斷中檢測血液、細胞、組織中正?；蚝?或突變基因。如本文所用，術(shù)語“核酸基因恒溫擴增方法”、“核酸聚合酶反應(yīng)”、“本發(fā)明的聚合酶鏈式反應(yīng)”可互換使用，均是指本發(fā)明中采用特定引物組、在恒溫下進行的核酸擴增反應(yīng)。本發(fā)明的用于恒溫基因擴增的聚合酶鏈反應(yīng)方法包括如下步驟A)針對待檢測的靶基因DNA序列，圍繞其擴增基因片段周圍的5個不同區(qū)域提供如下引物(a)基于靶基因3’端的外部引物；(b)基于靶基因3’端的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物；(c)基于靶基因中間部位的激勵擴增引物；(d)基于靶基因外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和(e)基于靶基因5’端的外部引物；B)提供包含A)中所述引物的聚合酶鏈式反應(yīng)體系，并將待測DNA樣品加入所述反應(yīng)體系中，其中如果該樣品所含為雙鏈DNA，則在將其加入所述反應(yīng)體系之前，對該樣品進行變性；C)在50 70°C，優(yōu)選55 65°C的恒溫下進行聚合酶鏈式反應(yīng)。在本發(fā)明的方法用于恒溫基因檢測時，其在上述擴增的基礎(chǔ)上還進一步包括步驟D)通過將待檢測DNA的恒溫基因擴增反應(yīng)數(shù)據(jù)或圖譜與陽性對照比較，獲得基因檢測結(jié)果。本發(fā)明的一個示例性但非限制性的實施方式如下步驟I.樣本采集從人類全血、經(jīng)皮膚穿刺采集的組織、手術(shù)中采集的組織、以及冰凍和石蠟包埋組織等組織獲得樣品，作為DNA檢測的來源。步驟2.基因組DNA提取根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法或采用市售試劑盒，提取基因組DNA (例如采用市售離心柱或溶液型全血提取試劑盒來提取全血DNA)。步驟3. DNA純度和濃度檢測檢測DNA純度和濃度(例如采用分光光度法)，并進行變性處理。步驟4.引物設(shè)計主要是針對靶基因圍繞擴增點周圍的5個不同的區(qū)域設(shè)計5種不同引物和探針基于靶基因3’端的外部引物和外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物、5’端的外部引物和外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物、以及中間部位的激勵擴增引物。步驟5.聚合酶鏈式擴增反應(yīng)體系配制在聚合酶鏈擴增反應(yīng)管中配制包含5種不同引物和探針、dNTP、緩沖液、熒光標記物試劑、樣本DNA、聚合酶(優(yōu)選脂肪芽胞桿菌聚合酶)等試劑的反應(yīng)體系。步驟6.實時聚合酶鏈擴增反應(yīng)對反應(yīng)體系進行實時聚合酶鏈擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為60 65 °C、20 60分鐘。步驟7.結(jié)果分析和評價通過觀察比較各待測樣品與采用相同檢測方法所得的陽性對照的實時熒光曲線圖結(jié)果，分析判斷是否存在靶基因、或基因中是否存在突變、或所·存在的突變?yōu)榧兒贤蛔冞€是雜合突變。應(yīng)理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明之后，可基于現(xiàn)有技術(shù)和/或?qū)嶋H情況對該具體實施方式
進行必要的改進或改變。DNA樣品的準備用于本發(fā)明方法中的待測DNA樣品，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)制備和獲得。可從例如血液樣品(如全血、血清或血漿)、經(jīng)皮膚穿刺采集的組織、手術(shù)中采集的組織、培養(yǎng)物、冰凍、固定(例如福爾馬林固定)或石蠟包埋組織中獲得樣品，作為DNA的來源，優(yōu)選從血液樣品中獲得DNA。在本發(fā)明的一個實施方式中，DNA樣品來源于人、動物或病原菌?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法(如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989))或采用市售試劑盒提取樣品中的基因組DNA (例如采用市售離心柱或溶液型全血提取試劑盒來提取全血DNA)，并對所得DNA的純度和濃度進行檢測(例如采用分光光度法)。引物設(shè)計在本發(fā)明中采用了特定的引物組，其中包括(a)基于靶基因3’端的外部引物；(b)基于靶基因3’端的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物；(c)基于靶基因中間部位的激勵擴增探針；(d)基于靶基因外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和(e)基于靶基因5’端的外部引物。如本文所用，術(shù)語“靶基因”是指待檢測的目標基因，該基因可為野生型基因或其中包含突變的特定基因，該靶基因的存在與否或其中是否存在突變可與疾病的易感性、疾病的發(fā)生、針對疾病的用藥選擇、和/或疾病的預(yù)后等相關(guān)。所述靶基因可選自(但不限于):EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、PDGFR、ABL基因或其它癌基因的野生型或突變型。如本文所用，術(shù)語“外部引物”是指針對基因片段端部的特異性引物。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)折引物”是指位于兩外部引物之間，且其末端的序列本身互補，可自身對折的引物。如本文所用，術(shù)語“折疊引物”是指位于兩外部引物之間，與靶基因片段上有相對應(yīng)互補的序列，可與基因片段互補的引物。如本文所用，術(shù)語“激勵擴增引物”是指位于轉(zhuǎn)折引物和折疊引物之間，并與轉(zhuǎn)折引物或折疊引物為上下游關(guān)系的引物。例如，當(dāng)本發(fā)明的方法用于檢測表皮生長因子(EGF)受體基因(NM_001982)外顯子21區(qū)突變時，可采用SEQ ID NOs :1-5的引物組來檢測突變基因，而采用SEQ ID NOs 6-10的引物組來檢測正?；颉Ｓ掷?，當(dāng)本發(fā)明的方法用于檢測KRAS (NM_033360) 12外顯子突變基因時，可采用SEQ ID NOs 11-15的引物組來檢測突變基因，而采用SEQ ID NOs 16-20的引物組來檢
測正?；?。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的說明書之后，可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的引物設(shè)計方法，針對各種靶基因設(shè)計并制得這些引物。反應(yīng)體系和反應(yīng)過程本發(fā)明的反應(yīng)體系中包含常規(guī)用量的模板DNA、7jC、MgCl2,4種dNTP、PCR緩沖液、以及DNA聚合酶。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)常識選擇這些組分的用量。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選采用脂肪芽胞桿菌聚合酶，所述脂肪芽胞桿菌聚合酶的用量為2 12U，優(yōu)選4 10U，更優(yōu)選4 6U?？赏ㄟ^市售獲得市售脂肪芽胞桿菌聚合酶，例如購自NEB公司。在本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系中還可包含任何能與dsDNA結(jié)合的核酸染料、標記分子。所述的核酸染料包括但不限于SYBR Green I。可在將待測DNA加入本發(fā)明的PCR體系之前，對DNA進行變性處理，例如在90 Iio0C (優(yōu)選98±0. 5°C )的溫度下，處理3 10分鐘(優(yōu)選5分鐘)。本發(fā)明的恒溫擴增反應(yīng)可采用本領(lǐng)域常規(guī)的PCR儀或可提供恒溫的其它儀器或設(shè)備進行。反應(yīng)溫度通常為50 70°C，優(yōu)選55 65°C，更優(yōu)選60±0.5°C。反應(yīng)的時間通常為20 60分鐘，優(yōu)選30 40分鐘。反應(yīng)結(jié)果及分析可通過本領(lǐng)域中常規(guī)的方法獲取實驗結(jié)果(如數(shù)據(jù)或圖譜)，例如(但不限于)生物標記物的定量分析或突光標記物的定量分析。在獲得實驗結(jié)果后，可通過將待測樣品與采用相同方法檢測的陽性和/或陰性對照DNA樣本的檢測結(jié)果進行比較，分析待測樣品中靶基因的情況(如定量、存在與否、是否有突變、突變?yōu)榧兒线€是雜合突變)。所述陽性對照可為例如已知的靶基因序列、和/或包含已知突變的序列，所述序列可通過人工合成制得、基因工程化方法獲得、或通過本領(lǐng)域常規(guī)方法從生物樣品中分離而得。陰性對照可采用無DNA樣品和/或已知不含突變的樣品。當(dāng)用于判定靶基因序列的存在與否時，陽性對照為靶基因序列，如果結(jié)果持續(xù)顯示陽性信號(即出現(xiàn)與陽性對照相同或相似的信號)，則表明樣品中存在靶基因序列。當(dāng)用于判定靶基因中是否存在特定突變時，陽性對照為包含該特定突變的靶基因序列，如果突變靶點引物反應(yīng)結(jié)果持續(xù)顯示陽性信號時，表明靶基因中存在基因突變；如果結(jié)果未顯示陽性信號時，表明靶基因中無基因突變。
當(dāng)用于判定靶基因中存在的突變?yōu)殡s合突變還是純合突變時，陽性對照分別為包含該特定突變的靶基因序列和不包含突變的正常靶基因序列，當(dāng)結(jié)果顯示無正?；虬悬c引物反應(yīng)信號而只有突變靶點引物反應(yīng)結(jié)果時，表明靶基因中存在的是純合突變；當(dāng)結(jié)果顯示正常基因靶點引物反應(yīng)結(jié)果和突變靶點引物反應(yīng)結(jié)果都時存在時，表明靶基因中所存在的基因突變是雜合突變。引物組和試劑盒本發(fā)明中還提供了用于本發(fā)明方法的引物組，所述引物組包含針對特定靶基因設(shè)計的(a)基于靶基因3’端的外部引物；(b)基于靶基因3’端的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物；(C)基于靶基因中間部位的激勵擴增探針；(d)基于靶基因外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和(e)基于靶基因5’端的外部引物。這些引物可單獨存在或以2、3、4或5種混合的方式存在?？梢员绢I(lǐng)域中常規(guī)的方式制備(如人工合成)、提供(如溶液或固體)和保存(如低溫冷藏)所述引物?？稍谑褂们坝眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液將引物配制成所需的使用濃度。本發(fā)明中還提供了一種試劑盒，其至少包含本發(fā)明的引物組和一個或多個容器。·所述試劑盒還任選包含選自下組的試劑中的一種或多種溶劑(如水)、MgCl2、dNTP、核酸染料(如SYBR Green I)、分子標記物、PCR緩沖液、DNA聚合酶(優(yōu)選脂肪芽胞桿菌聚合酶)。本發(fā)明方法、引物組和試劑盒的用途本發(fā)明的方法、引物組和試劑盒可通過對靶基因或基因突變的檢測，為遺傳或基因突變相關(guān)疾病的診斷、易感性評估、患者用藥選擇、和/或預(yù)后評估提供中間信息。在本發(fā)明中，術(shù)語“遺傳或基因突變相關(guān)疾病”包括但不限于癌癥、血液病、先天性遺傳型疾病。例如，本發(fā)明的方法可用于癌癥患者的用藥選擇、易感性評估和/或預(yù)后評估，所述癌癥包括但不限于直腸癌、胃腸道癌、非小細胞肺癌、胃腸間質(zhì)瘤、白血病(優(yōu)選慢性粒細胞性白血病)、腺癌等。此外，本發(fā)明的引物組和試劑盒也可用于靶基因的擴增反應(yīng)、或用于其它方式的聚合酶鏈式反應(yīng)中，例如聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、環(huán)介導(dǎo)恒溫聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、對稱或不對稱的單鏈聚合酶鏈式反應(yīng)擴增。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點I.檢測靈敏度明顯增強，且根據(jù)反應(yīng)結(jié)果可明確判定樣品中是否存在靶基因或突變基因，可廣泛應(yīng)用于臨床，為遺傳或基因突變相關(guān)疾病的診斷、易感性評估、患者用藥選擇、和/或預(yù)后評估提供相關(guān)信息；2.檢測流程簡單，步驟少，且無需頻繁變化溫度，對操縱者和反應(yīng)儀器的要求也由此降低；3.反應(yīng)時間較現(xiàn)有技術(shù)中的I至數(shù)天乃至一周大大縮短，整個過程(包括DNA分離純化)僅需2小時左右，實現(xiàn)了快速檢測；4.本發(fā)明的方法可對血液樣品進行檢測，從而無需進行組織取樣等復(fù)雜操作，降低了對取樣人員的要求、且提高了被檢測對象的順應(yīng)性，在臨床上具有更為廣泛的應(yīng)用前
旦
o
實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I. EFGR突變基因的實時檢測本實施例中提供了一種表皮生長因子(EGF)受體基因(NM_001982)外顯子21區(qū)突變的檢測方法，其可做為臨床上選擇酪氨酸激酶抑制劑治療的方法。A.檢測方法步驟I.樣品采集按照衛(wèi)生部頒布的《人類常見腫瘤新鮮組織標本采集、處理和保存的技術(shù)規(guī)程》中所規(guī)定的方法進行全血、手術(shù)組織標本采集。采集200iU至Iml新鮮全血，置于含EDTA抗凝劑的采血管中，保存于-20 °C至_80°C，一般2 3年內(nèi)均可以提取，保存時間越短，提取的質(zhì)量越高，最好在2個月內(nèi)提取。陽性對照的樣本可采用含有E21位點突變的1970細胞株(購自中科院上海生科院)；陰性對照的樣本為無DNA樣本。步驟2.基因組DNA的分離采用Tiangen Inc公司的DNA提取試劑盒。取步驟I中的抗凝血200 ii I,加入20 ill蛋白酶K混勻。然后加入200 ill緩沖液GB (Tiangen Inc試劑盒)，在56 °C放置10分鐘至溶液變清亮。加入200 u I無水乙醇至出現(xiàn)絮狀沉淀。把含絮狀沉淀的溶液總體加入至吸附柱CB3中(Tiangen Inc試劑盒)，并以12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 U I緩沖液⑶(Tiangen Inc試劑盒)，以12000rpm離心30秒。向吸附柱CB3中分別加入三次700 漂洗液PW洗滌DNA (TiangenInc試劑盒)，以12000rpm離心30秒。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 洗脫液TB，室溫放置2-5分鐘，以12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。將離心得到的溶液再加入同一個吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，以12000rpm離心2分鐘，即得到基因組DNA溶液。此DNA可以存放在2 8°C，如果要長時間存放，可以放置在_20°C。陽性對照和陰性對照樣品的基因組DNA提取操作過程同上。步驟3. DNA純度檢測
利用分光光度法(Nanodrop2000, Thermo Scientific)檢測DNA純度和濃度來測定DNA濃度，要求0D26Q/0D28Q ^ I. 8，統(tǒng)一將各樣品稀釋成25ng/ U I。
步驟4. DNA奪件取100 ii g的DNA放至PCR管中，加熱至98°C 3分鐘使DNA變性，以用于后續(xù)的聚合酶鏈反應(yīng)。步驟5. PCR體系的配制在用于檢測突變基因的PCR管中配制0. 5 ill的IOOiiM 3/端外部引物(各引物購自上海生工)、0. 5 ill的IOOiiM 3'端轉(zhuǎn)折引物，0. 5 ill的50 ii M 5'端外部引物，0. 5u I的50iiM 5'端折疊引物，0. 5iil的12. 5yM激勵引物。這些引物的序列如表I所示表I.突變基因檢測引物
權(quán)利要求
1.一種用于基因檢測的恒溫聚合酶鏈式反應(yīng)方法，所述方法包括 A)針對待檢測的靶基因DNA序列，圍繞其擴增基因片段周圍的5個不同區(qū)域提供如下5種引物 (a)基于靶基因3’端的外部引物； (b)基于靶基因3’端的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物； (C)基于靶基因中間部位的激勵擴增引物； (d)基于靶基因外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和 (e)基于靶基因5’端的外部引物； B)提供包含A)中所述引物的聚合酶鏈式反應(yīng)體系，并將待測DNA樣品加入所述反應(yīng)體系中，其中如果該樣品所含為雙鏈DNA，則在將其加入所述反應(yīng)體系之前，對該樣品進行變性； C)在50 70°C的恒溫下進行聚合酶鏈式反應(yīng)； D)通過將待檢測DNA的恒溫基因擴增反應(yīng)數(shù)據(jù)或圖譜與陽性對照比較，獲得基因檢測結(jié)果。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述待測DNA樣品來自血液、組織或組織切片、培養(yǎng)細胞。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述引物是合成的核酸引物或肽核酸合成的引物。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系包含DNA、水、MgCl2、4種dNTP、緩沖液、以及脂肪芽胞桿菌聚合酶。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)在55 65°C的溫度下進行20 60分鐘。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)數(shù)據(jù)或圖譜是通過選自下組的方法獲得的生物標記物的定量分析或突光標記物的定量分析。
7.ー種引物組，其包括 (a)基于靶基因3’端DNA序列的外部引物； (b)基于靶基因3’端DNA序列的外部引物內(nèi)側(cè)的轉(zhuǎn)折引物； (c)基于靶基因DNA序列中間部位的激勵擴增引物； (d)基于靶基因DNA序列外部引物內(nèi)側(cè)的折疊引物；和 (e)基于靶基因DNA序列5’端的外部引物。
8.ー種試劑盒，其包括単獨或混合的權(quán)利要求8所述引物組中的各成員；ー個或多個容器。
9.權(quán)利要求7所述的引物組在制備用于恒溫基因擴增或檢測的聚合酶鏈反應(yīng)的試劑盒中的用途。
10.權(quán)利要求7所述的引物組在聚合酶鏈式反應(yīng)中的用途，所述反應(yīng)選自聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、環(huán)介導(dǎo)恒溫聚合酶鏈式反應(yīng)擴增、對稱或不對稱的單鏈聚合酶鏈式反應(yīng)擴増。
全文摘要
本發(fā)明中提供了一種用于快速恒溫基因突變檢測的聚合酶鏈反應(yīng)方法，所述方法包括A)針對待檢測的靶基因DNA序列提供特定引物組；B)提供包含該引物組的反應(yīng)體系，并加入待測DNA樣品；C)在恒溫下進行聚合酶鏈式反應(yīng)；D)獲得基因檢測結(jié)果。本發(fā)明中還提供了所述的特定引物組、試劑盒、以及它們的用途。本發(fā)明的方法和產(chǎn)品可用于簡單、敏感且快速的基因擴增和檢測(尤其是突變基因檢測)，在臨床上具有廣闊的前景。
文檔編號C12Q1/68GK102690881SQ20111007363
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者李立新, 楊毅, 胡西陵 申請人:李立新, 楊毅, 胡西陵