專利名稱：改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)明，改良的檢測(cè)方法準(zhǔn)確率比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，節(jié)省時(shí)間，提高DNA檢出效率，同時(shí)，可減少基因組DNA的上樣量。這種改良的溴化乙啶(EB)染色方法適用于大規(guī)?；蚪MDNA樣本的快速檢測(cè)，但不能用來確定DNA片段大小。
背景技術(shù)：
近年來，基因組DNA提取已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)的許多領(lǐng)域。人類基因組計(jì)劃的完成，更為人類利用基因組DNA遺傳密碼破解疾病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，成百上千例DNA樣本量的病例-對(duì)照相關(guān)性研究越來越多的被用于發(fā)現(xiàn)疾病致病基因和相關(guān)變異位點(diǎn)。
傳統(tǒng)的基因組DNA提取后的檢測(cè)方法是通過瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙啶染色，但這種檢測(cè)方法的靈敏度和重復(fù)性較差，需要樣本DNA上樣量較大，通常為5-10μ 1，當(dāng)提取的基因組DNA含量低時(shí)，通常不易觀察到陽性結(jié)果。此外，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法用于檢測(cè)大量基因組DNA樣本時(shí)，顯的有些費(fèi)時(shí)，費(fèi)材，費(fèi)力。考慮到瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙啶染色的這些缺點(diǎn),本發(fā)明介紹一種改良的溴化乙啶染色快速檢測(cè)樣本基因組DNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種改良的溴乙啶染色快速檢測(cè)樣本基因組DNA的方法。此改良方法節(jié)省時(shí)間，敏感性比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，并可減少基因組DNA的上樣量，節(jié)省DAN樣本。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法為剪切20 X 40mm的PARAFILM “M”封口膜，按照檢測(cè)樣本數(shù)在封口膜上間隔50mm間距均勻點(diǎn)樣2 μ I O. 5 μ I/ml溴化乙錠，分別吸取2 μ I待檢DNA樣本與封口膜上溴化乙啶充分混合，同時(shí)每張封口膜預(yù)留1-2處溴乙錠陰性對(duì)照，室溫下靜置l-2mins，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察，記錄或拍攝封口膜上點(diǎn)樣的亮度，DNA陽性點(diǎn)樣呈橙紅色，DNA陰性點(diǎn)樣呈無色。封口膜大小依檢測(cè)樣本數(shù)量多少而定，點(diǎn)樣保留適當(dāng)間隔即可。每次點(diǎn)樣溴化乙錠用量可O. 5-5 μ 1，DNA用量可O. 5-5 μ I。對(duì)點(diǎn)樣明亮度的觀察，以同時(shí)設(shè)定的溴化乙啶陰性對(duì)照對(duì)基準(zhǔn)。改良的溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，可用于初略估計(jì)DNA濃度。本發(fā)明通過對(duì)滅菌蒸餾水、溴化乙啶、DNA和溴化乙啶+DNA分組對(duì)比觀察，溴化乙啶+DNA組與其他組存在明顯亮度差。(如圖I)本發(fā)明將DNA樣本稀釋2χ、4χ、8χ、16χ、32χ后，同時(shí)進(jìn)行改良法與傳統(tǒng)凝膠電泳法檢測(cè)。改良法在稀釋32χ后仍可見點(diǎn)樣亮度；而凝膠電泳檢測(cè)法在8χ稀釋后即不能檢出。(如圖2)本發(fā)明對(duì)161例正常人采集末梢靜脈血，提取基因組DNA。對(duì)改良溴化乙啶染色法和凝膠電泳法檢測(cè)基因組DNA的敏感度進(jìn)行比較(如圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改良法的陽性檢出率明顯高于凝膠電泳法(P = O. 000005)(如圖4)本發(fā)明可用于制作DNA檢測(cè)芯片和日常科研工作中的DNA檢測(cè)。


圖I、改良法檢測(cè)基因組DNA圖2、改良法和電泳法檢測(cè)稀釋的基因組DNA結(jié)果
圖3、改良法和電泳法檢測(cè)基因組DNA結(jié)果比較圖4、改良法和電泳法檢測(cè)161例樣本基因組DNA結(jié)果
具體實(shí)施例方式剪切20 X 40mm的PARAFILM “Μ”封口膜，按照檢測(cè)樣本數(shù)在封口膜上間隔50mm間距均勻點(diǎn)樣2 μ I O. 5 μ I/ml溴化乙錠，分別吸取2 μ I待檢DNA樣本與封口膜上溴化乙啶充分混合，同時(shí)每張封口膜預(yù)留1-2處溴乙錠陰性對(duì)照，室溫下靜置l-2mins，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察，對(duì)比溴化乙啶陰性對(duì)照，明亮點(diǎn)樣為DNA陽性。
權(quán)利要求
1.一種改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，敏感度比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，節(jié)省時(shí)間，提高DNA檢出效率，同時(shí)，可減少基因組DNA的上樣量。
2.這種改良的溴化乙啶(EB)染色方法適用于大規(guī)?；蚪MDNA樣本的快速檢測(cè)，但不能用來確定DNA片段大小。
3.如權(quán)利要求I中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，方法如下剪切20X40mm的PARAFILM “M”封口膜，按照檢測(cè)樣本數(shù)在封口膜上間隔50mm間距均勻點(diǎn)樣O.5 μ I/ml溴化乙錠2 μ 1，分別吸取2 μ I待檢DNA樣本與封口膜上溴化乙啶充分混合，同時(shí)每張封口膜預(yù)留1-2處溴化乙錠陰性對(duì)照(不加DNA)，室溫下靜置l-2mins，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察，對(duì)比溴化乙啶陰性對(duì)照，明亮點(diǎn)樣為DNA陽性。
4.如權(quán)利要求3中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，封口膜大小依檢測(cè)樣本數(shù)量多少而定，點(diǎn)樣保留適當(dāng)間隔即可。每次點(diǎn)樣溴化乙錠用量可O. 5-5μ 1，DNA用量可 O. 5~5 μ I。
5.如權(quán)利要求3中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，對(duì)點(diǎn)樣明亮度的觀察，以同時(shí)設(shè)定的溴化乙啶陰性對(duì)照對(duì)基準(zhǔn)。
6.如權(quán)利要求1-5中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，可用于初略估計(jì)DNA濃度。
7.如權(quán)利要求I至6中所述的改良溴化乙啶染色法快速檢測(cè)基因組DNA，可用于制作DNA檢測(cè)芯片和日?？蒲泄ぷ髦械腄NA檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改良的溴化乙啶染色快速檢測(cè)樣本基因組DNA的方法，屬于生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)明。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，改良的檢測(cè)方法準(zhǔn)確率比瓊脂糖凝膠電泳法有顯著提高，并節(jié)省時(shí)間，提高了DNA檢出效率。同時(shí)，可減少基因組DNA的上樣量，節(jié)省樣本DNA的用量。這種改良的溴化乙啶染色方法適用于基因組DNA樣本的快速檢測(cè)，但不能用來確定DNA片段大小。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102634569SQ20111007337
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者劉健, 劉澤輝, 朱志強(qiáng), 王有亮, 蘆秀麗, 鄧智先, 高兵 申請(qǐng)人:沈陽醫(yī)學(xué)院