專利名稱：為了測定糖化胺的樣品前處理方法和糖化胺的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為了測定糖化胺的樣品前處理方法和糖化胺的測定方法。
背景技術(shù)：
以往，利用氧化還原反應(yīng)測定樣品中的測定對象的量已廣泛實施，其也適用于生化分析、臨床檢查等中糖化胺(糖化蛋白質(zhì)、糖化肽、糖化氨基酸等)的測定。特別地，血液中的糖化蛋白質(zhì)，特別是其中的紅細胞中的糖化血紅蛋白反映機體血糖值的過去的歷史，因此是糖尿病診斷、治療等中的重要指標。例如，如下所示，用前述氧化還原反應(yīng)，測定這種紅細胞中的糖化蛋白質(zhì)。首先，將紅細胞溶血以制備樣品，將果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為“FA0D”)加到此溶血樣品中，其作用于糖化蛋白質(zhì)的糖化部分，從而通過氧化還原反應(yīng)生成過氧化氫。此過氧化氫量對應(yīng)于前述糖化蛋白質(zhì)量。然后，將過氧化物酶(以下稱為“POD”)和通過氧化而顯色的還原劑加到此樣品中，從而以前述POD為催化劑在前述過氧化氫和前述還原劑之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)。通過前述反應(yīng)使前述還原劑顯色，通過測定這種顯色而可以測定前述過氧化氫量，結(jié)果是，可以得知紅細胞中的糖化蛋白質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
但是，用這種氧化還原反應(yīng)測定糖化蛋白質(zhì)的方法有這樣的問題，例如，生成比對應(yīng)于樣品中實際所含糖化蛋白質(zhì)的過氧化氫更多的過氧化氫。而且，取決于患者，糖化蛋白質(zhì)的測定值暫時急劇升高，從而無法進行可信的測定。因此，前述方法需要進一步提高測定精度。而且，不限于在用前述氧化還原反應(yīng)的測定方法，例如，在用抗原抗體反應(yīng)的糖化胺測定方法中也同樣需要提高測定精度。因此，本發(fā)明的目的是提供用于測定糖化胺的樣品前處理方法，借此使糖化胺的高度可信的測定成為可能。為了達成前述目的，本發(fā)明提供以糖化胺為測定對象的樣品的前處理方法，所述方法包括使FAOD作用于前述樣品中存在的除測定對象糖化胺以外的糖化氨基酸或糖化肽而分解之，以除去前述糖化氨基酸或糖化肽。前述“FA0D”是一般名稱，其底物不限于糖化氨基酸，例如，其還作用于糖化肽。而且，在本發(fā)明中，“糖化肽”指FAOD起作用的長度的肽，例如，氨基酸殘基數(shù)在2-6范圍內(nèi)的肽。因此，在本發(fā)明中，F(xiàn)AOD不起作用的長度的糖化肽和糖化蛋白質(zhì)總稱為“糖化蛋白質(zhì)”。 這樣，作為測定對象的前述糖化胺，例如，包括糖化蛋白質(zhì)、糖化肽和糖化氨基酸。本發(fā)明的發(fā)明人進行了深入研究以提高測定精度，并最終發(fā)現(xiàn)以下的事實。S卩，在全血中，除本來存在測定對象糖化胺以外，還存在測定對象以外的游離糖化氨基酸和糖化肽，前述FAOD也對這種糖化氨基酸和糖化肽起作用。因此，如果如上述用FAOD進行糖化胺的測定，則不僅在測定對象糖化胺和FAOD之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而且在測定對象以外的糖化氨基酸、糖化肽和FAOD之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而在表面上增加測定對象的測定值。而且，關(guān)于前述問題，即就同一患者的全血樣品而言，即使在完全相同的條件下通過前述測定方法進行測定，從患者采血時間不同時測定值也顯著變化，還發(fā)現(xiàn)了以下事實。艮口， 這個問題是主要見于接受點滴等的患者的現(xiàn)象，作為點滴成分，例如，含有葡萄糖等糖類和各種氨基酸時，由這些外來成分形成糖化氨基酸，糖化氨基酸暫時增加，導(dǎo)致上述測定值變化。這種現(xiàn)象不僅存在于前述通過氧化還原反應(yīng)的測定中，例如，在前述用抗原抗體反應(yīng)的測定方法中也同樣出現(xiàn)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使全血樣品中存在正常的糖化氨基酸或糖化肽、暫時的外來糖化氨基酸或糖化肽等除測定對象以外的糖化物，如果如本發(fā)明那樣預(yù)先對樣品進行前處理，使分解用FAOD作用于除測定對象以外的糖化氨基酸、糖化肽，就可以抑制如前述的表面上的測定值升高。通過其可以提高測定精度，此外，例如，由于與是否接受點滴無關(guān)，采血可以在任何時間進行，因此可以減少患者的負擔(dān)。因此，這樣的樣品前處理方法，例如，如果應(yīng)用于前述的糖化血紅蛋白的測定，則糖化血紅蛋白作為糖尿病診斷指標的可靠性得以提高，從而成為臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中的有用方法。其次，本發(fā)明提供通過使FAOD作用于樣品中的糖化胺，測定其氧化還原反應(yīng)而測定糖化胺的量的方法，所述方法包括在前述氧化還原反應(yīng)之前，預(yù)先用前述本發(fā)明的前處理方法處理前述樣品而分解前述樣品中存在的除糖化胺以外的糖化氨基酸或糖化肽，以除去前述糖化氨基酸或糖化肽。由于如前述的理由，可以通過這種測定方法提高測定精度。在下文中，在本發(fā)明中，用于分解前述糖化氨基酸、糖化肽的FAOD稱為“分解用FA0D”，而用于作用于前述糖化胺的FAOD稱為“測定用FA0D”。而且，存在的除測定對象糖化胺以外的糖化氨基酸和糖化肽在下文中稱為“非測定對象糖化物”。本發(fā)明的測定方法，例如，可以是使用對前述非測定對象糖化物和前述測定對象糖化胺具有不同底物特異性的FAOD的第一測定方法，和使用相同的FAOD的第二測定方法。在FAOD中，如后述，例如，存在作用于α-氨基的糖化部分的FA0D，作用于賴氨酸、精氨酸等氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基的糖化部分的FA0D，和作用于前述兩者的糖化部分的 FA0D，它們的底物特異性取決于FAOD的種類而不同。因此，在糖化胺的測定中，通過使FAOD 作用于前述α-氨基的糖化部分、前述側(cè)鏈氨基的糖化部分或兩者的糖化部分，可能測定其量。在本發(fā)明的第一測定方法中，優(yōu)選作用于前述非測定對象糖化物的分解用FAOD 和作用于測定對象糖化胺的測定用FAOD具有不同的底物特異性。由此，用分解用FAOD分解前述非測定對象糖化物的糖化部分，而糖化胺的未經(jīng)前述分解用FAOD作用的糖化部分然后受到具有不同底物特異性的測定用FAOD的作用，因此，可以不受前述非測定對象糖化物的影響，從而提高測定精度。具體而言，例如，如果非測定對象的α-氨基被糖化，而測定對象糖化胺的α-氨基糖化部分和側(cè)鏈氨基被糖化，則優(yōu)選前述分解用FAOD是特異性作用于糖化α -氨基的酶，而前述測定用FAOD是特異性作用于糖化α-氨基和糖化氨基酸殘基側(cè)鏈的酶。由于前述測定用FAOD作用于α -氨基糖化部分和側(cè)鏈氨基糖化部分二者，因此如果是以往的方法，它還作用于如前述的α-氨基被糖化的非測定對象糖化物。但是，在本發(fā)明中，由于預(yù)先用特異性作用于前述糖化α -氨基的分解用FAOD分解前述非測定對象糖化物的糖化部分，因此測定用FAOD不作用于它們，從而抑制了表面上的測定值增加，提高了精度。而且， 由于測定用FAOD如前述作用于α -氨基糖化部分和側(cè)鏈氨基糖化部分二者，通過分解用 FAOD分解糖化胺的α -氨基糖化部分，因此測定用FAOD能夠僅作用于糖化胺的側(cè)鏈氨基糖化部分。因此，其特別地是以側(cè)鏈氨基的糖化量為特征的糖化胺的測定中的有用方法。這種糖化胺的實例是糖化賴氨酸和糖化白蛋白等。當使用這種不同的FAOD時，優(yōu)選在使FAOD作用于前述非測定對象糖化物之前或之后，用蛋白酶分解糖化胺，并使測定用FAOD作用于這種糖化胺分解物，從而進行前述氧化還原反應(yīng)。分解糖化胺是因為，當測定對象為糖化蛋白質(zhì)時，F(xiàn)AOD難以作用于前述糖化蛋白質(zhì)，而作用于如前述的糖化肽和糖化氨基酸，并且，對前述糖化氨基酸的作用比對前述糖化肽的作用更為容易。而且，蛋白酶處理的順序不受非測定對象糖化物的分解處理前后的限制的原因是，由于測定用FAOD可以作用于不同于如前述的分解用FAOD的糖化部分，因此糖化胺本身的測定不受影響。而且，當測定對象是糖化肽時，因為如果分解成更短的糖化肽或糖化氨基酸，則FAOD更容易地作用，因此優(yōu)選進行蛋白酶處理。在本發(fā)明中，除非特別指出，“非測定對象糖化物糖化氨基酸和糖化肽”指在分解處理前樣品中包含的物質(zhì)，例如，它不包括測定對象糖化蛋白質(zhì)和糖化肽的分解物。接著，作為本發(fā)明的第二測定方法，優(yōu)選在使分解用FAOD作用于非測定對象糖化物之后，用蛋白酶分解測定對象糖化胺，接著加入與前述分解用FAOD相同的FA0D，使之作用于前述蛋白酶分解物，從而進行前述氧化還原反應(yīng)。這種方法，例如，在被測定對象糖化物為糖化氨基酸，而測定對象糖化胺為糖化蛋白質(zhì)或糖化肽時有用。具體而言，優(yōu)選通過前述蛋白酶使前述分解用FAOD失活。如上述，F(xiàn)AOD具有難以作用于糖化蛋白質(zhì)，且作用于糖化氨基酸比作用于糖化肽更容易的性質(zhì)。因此，當非測定對象糖化物為糖化氨基酸時，例如，即使添加分解用FA0D，從酶的反應(yīng)速度論而言，在分解糖化氨基酸的處理時間內(nèi)，它也不作用于糖化蛋白質(zhì)，并且?guī)缀醪蛔饔糜谔腔摹５?，如果在隨后的蛋白酶處理期間前述分解用FAOD的活性殘存，則與蛋白酶處理并行，前述分解用 FAOD可能作用于通過蛋白酶得到的糖化蛋白質(zhì)分解物(糖化肽或糖化氨基酸)或糖化肽分解物(較短的糖化肽或糖化氨基酸)。因此，當隨后添加測定用FAOD時，前述糖化蛋白質(zhì)分解物等的一部分已經(jīng)成為受到分解用FAOD的作用的狀態(tài)，反而有測定精度下降的危險。 但是，如果通過如前述那樣用于分解糖化蛋白質(zhì)等的蛋白酶處理使同時殘存的前述分解用 FAOD失活，則由蛋白酶處理得到的糖化蛋白質(zhì)分解物等保持與前述分解用FAOD未反應(yīng)的原樣，可以與隨后添加的測定用FAOD反應(yīng)。因此，測定精度得到提高。此外，例如，也可以測定對象為糖化蛋白質(zhì)，而非測定對象糖化物為糖化肽。這是因為，當使分解用FAOD作用于糖化肽時，在作用期間它不作用于糖化蛋白質(zhì)。另一方面，即使沒有如前述那樣通過蛋白酶處理使分解用FAOD失活，例如，還可以通過調(diào)節(jié)前述分解用FAOD的添加量和測定用FAOD的添加量實現(xiàn)高精度的測定。在這種情況下，例如，前述分解用FAOD(A)與測定用FAOD(B)的添加比例(活性比A B)優(yōu)選在 A B = 1 10-1 50000的范圍內(nèi)。當存在這樣的添加比例時，即使在進行蛋白酶處理期間前述分解用FAOD殘存，從酶的反應(yīng)速度論而言，不用說糖化蛋白質(zhì)，與非測定對象糖化物糖化氨基酸相比，對測定糖化胺糖化肽的作用更難。此外，在非測定對象糖化物為糖化肽，而測定糖化胺為糖化蛋白質(zhì)時也是一樣的。在本發(fā)明的測定方法中，作為前述蛋白酶，例如，可以使用選自金屬蛋白酶、菠羅蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶和氨基肽酶的至少一種蛋白酶， 但沒有特別的限制。當測定對象為如下述的糖化血紅蛋白時，前述蛋白酶為選擇性分解糖化血紅蛋白的蛋白酶，并優(yōu)選為選自金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬胰腺的胰蛋白酶和來源于枯草桿菌的蛋白酶的至少一種蛋白酶，更優(yōu)選為金屬蛋白酶和來源于枯草桿菌的蛋白酶，特別優(yōu)選為金屬蛋白酶。如果使這種蛋白酶作用，則因為分解除糖化血紅蛋白以外的糖化蛋白質(zhì)困難，因而FAOD作用于前述其他糖化蛋白質(zhì)困難，使僅測定糖化血紅蛋白成為可能。在本發(fā)明中，對測定樣品沒有特別的限制，例如，本發(fā)明的測定方法可以應(yīng)用于全血、血漿、血清、血細胞、尿和脊髓液等生物樣品、果汁等飲料、醬油、沙司等食品。其中，例如，對全血、血漿、血清、血細胞等的血液樣品和其他生物樣品有用。而且，例如，即使前述全血樣品包含外來的糖化氨基酸等，也可以高精度地測定。 例如，如前述外來糖化氨基酸是暫時的，在它包含在全血中時仍對糖化蛋白質(zhì)等的測定值有顯著影響。但是，通過本發(fā)明，可以避免這種影響。雖然對前述全血樣品沒有特別的限制，但本發(fā)明的測定方法，例如，對從點滴后的患者采集的全血樣品有用。這是因為，特別是在點滴后的樣品中，由于形成的外來糖化氨基酸而導(dǎo)致測定值的變化。在本發(fā)明的測定方法中，作為測定對象，只要利用氧化還原反應(yīng)，對其沒有特別的限制。例如，可以是全血中成分、紅細胞中成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、脊髓液成分等，優(yōu)選為紅細胞中成分。例如，當測定前述紅細胞成分時，可以使全血本身溶血，將其作為樣品，或者可以從全血中分離紅細胞，并將前述紅細胞溶血，將其作為樣品。在本發(fā)明的測定方法中，作為前述測定對象糖化胺，包括如前述的糖化蛋白質(zhì)、糖化肽和糖化氨基酸等。具體而言，例如，可以是糖化血紅蛋白、糖化白蛋白等糖化蛋白質(zhì)。例如，當測定紅細胞成分糖化血紅蛋白時，可以將全血本身溶血，將其作為樣品，或者從全血中分離紅細胞，并將前述紅細胞溶血，將其作為樣品。


圖1是顯示在本發(fā)明的測定方法的一個實施例中，通過用FAOD的測定方法得到的 HbAlc量和通過自動分析裝置得到的HbAlc量的相關(guān)關(guān)系。
具體實施方案在本發(fā)明的測定方法中使用的FAOD優(yōu)選是催化下式(1)所示的反應(yīng)的FA0D， 例如，可以是特異性作用于α-氨基被糖化的糖化胺的FA0D(以下稱為“FAOD-α ”)，特異性作用于氨基酸側(cè)鏈的氨基被糖化的糖化胺的FA0D(以下稱為“FA0D-S”)，和特異性作用于α-氨基被糖化的糖化胺和氨基酸的氨基被糖化的糖化胺二者的FAOD (以下稱為
6"FAOD-a S，，)。R1-C0-CH2-NH-R2+H20+02 — Ri-CO-CHCHNH2-R^H2O2 …(1)在前述式(1)中，R1表示羥基或來源于糖化前的糖的殘基(糖殘基)。前述糖殘基 (R1)在反應(yīng)前的糖為醛糖時是醛糖殘基，而在反應(yīng)前的糖為酮糖時是酮糖殘基。例如，當反應(yīng)前的糖為葡萄糖時，通過阿馬多里(Amadori)重排，反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)為果糖結(jié)構(gòu)，在這種情況下，糖殘基(R1)變成葡萄糖殘基(醛糖殘基)。例如，這種糖殘基(R1)可以由下式表示-[CH(OH)Jn-CH2OH其中η為0-6的整數(shù)。在前述式(1)中，對R2沒有特別的限制，但是，在糖化胺為糖化氨基酸或糖化肽時，在α-氨基被糖化的情況下和在其以外的氨基(氨基酸側(cè)鏈的氨基)被糖化的情況下是不同的。在前述式(1)中，當α-氨基被糖化時，R2是下式( 所示的氨基酸殘基或肽殘基。在這種情況下，前述FAOD-α和FAOD-a S特異性地催化前述式(1)的反應(yīng)。-CHR3-CO-R4— (2)在前述式O)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基，R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如， 可以由下式(3)表示。在下式(3)中，η為0或0以上的整數(shù)，而R3表示與前述相同的氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全都相同，也可以不同。-(NH-CR3H-CO)n-OH ...(3)在前述式(1)中，當α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸側(cè)鏈基被糖化)時，R2可以由下式(4)表示。在這種情況下，前述FAOD-S和FAOD-a S特異性地催化前述式(1)的反應(yīng)。-R5-CH (NH-R6) -CO-R7 …在前述式(4)中，R5表示氨基酸側(cè)鏈基中糖化氨基以外的部分。例如，當糖化氨基酸為賴氨酸時，R5為-CH2-CH2-CH2-CH2-例如，當糖化氨基酸為精氨酸時，R5為CH2-CH2-CH2-NH-CH (NH2)-在前述式(4)中，R6表示氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如，可以由下式( 表示。在下式(5)中，η表示0或0以上的整數(shù)，R3表示與前述相同的氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全都相同，也可以不同。-(CO-CR3H-NH)n-H ...(5)在前述式中，R7表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如，可以由下式(6)表示。 在下式(6)中，η為0或0以上的整數(shù)，R3表示與前述相同的氨基酸側(cè)鏈基，氨基酸側(cè)鏈基可以全都相同，也可以不同。-(NH-CHR3-CO)n-OH ...(6)特異性作用于前述糖化α-氨基的FAOD-a，例如，可以是市售的商品果糖基氨基酸氧化酶(FAOX-E) ( * 〃 二一>社制)和來源于青霉屬的FAOD (特開平8-336386號公報)。特異性作用于前述糖化氨基酸側(cè)鏈的FA0D-S，例如可以是來源于鐮刀菌屬的FA0D(日本生物工學(xué)會大會平成12年度"Fusarium oxysporum由來7彡7酸才* *夕■一七Θ基質(zhì)特異性Q変換；藤原真紀等”)等。而且，特異性作用于前述糖化α -氨基和糖化氨基酸側(cè)鏈基二者的FAOD- α S，例如，可以是市售的商品FOD (旭化成社制)、來源于赤霉屬的FAOD (特開平8-154672號公報)、來源于鐮刀菌屬的FAOD (特開平7489253號公報)和來源于曲霉屬的 FAOD (W0 99/20039)等。下面，將以用含有非測定對象糖化物糖化氨基酸的全血樣品，測定來源于血細胞的糖化蛋白質(zhì)為例說明本發(fā)明的測定方法。在本發(fā)明中，除非特別指出，“非測定對象糖化物糖化氨基酸”指測定前包含在樣品中的物質(zhì)，例如，不包括測定對象糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物。(第一實施方案)本實施方案是使用FAOD-α分解前述糖化氨基酸，并用FAOD-α S測定糖化蛋白質(zhì)的前述第一測定方法的一個實例。首先，使全血溶血而制備溶血樣品。對此溶血方法沒有特別的限制，例如，可以使用用表面活性劑的方法、用超聲波的方法、利用滲透壓差的方法和用冷凍融解的方法。其中，由于操作的簡便性等的理由，用表面活性劑的方法是優(yōu)選的。作為前述表面活性劑，例如，可以使用聚氧乙烯基對叔辛基苯基醚(Triton系表面活性劑等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween系表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚 (Brij系表面活性劑等)等，具體而言，可以為商品iTriton X-100、商品Tween-20、商品Bri j 35等。用前述表面活性劑處理的條件通常如下當處理溶液中的血細胞濃度為1-10體積％ 時，加入表面活性劑以使前述處理溶液中的濃度為0. 1-1重量％，并在室溫下攪拌約5秒至 1分鐘。在前述利用滲透壓差時，例如，添加2-100倍于全血的體積的純化水，以進行溶血。接著，對前述溶血樣品進行蛋白酶處理。通過這種蛋白酶處理而分解糖化蛋白質(zhì)使后述FAOD作用更容易。對前述蛋白酶的種類沒有特別的限制，可以使用如上述的蛋白酶 K、枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、氨基肽酶、木瓜蛋白酶、金屬蛋白酶等。前述蛋白酶處理通常在緩沖液中進行，其處理條件根據(jù)使用的蛋白酶的種類、測定對象糖化蛋白質(zhì)的種類和濃度等適宜地確定。當用胰蛋白酶作為蛋白酶處理前述樣品時，例如，反應(yīng)液中蛋白酶濃度為 100-6000U/L，反應(yīng)液中血細胞濃度為0. 2-5體積％，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為10分鐘至20小時，pH為6-9。這種處理通常在緩沖液中進行，對能夠使用的緩沖液沒有特別的限制，例如，可以是Tris-HCl緩沖液、磷酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液等。接著，用催化前述式(1)的反應(yīng)，具體為下式(7)的反應(yīng)的FAOD-α處理前述經(jīng)蛋白酶處理的溶血樣品。 r1-co-ch2-nh-chr3-cooh+h2o+o2— Ri-CO-Chchnh2-CHR3-COO^H2O2…(7)在前述式(7)中，R1表示與前述相同的糖殘基，R3表示與前述相同的氨基酸側(cè)鏈。通過這種處理，將前述溶血樣品中包含的α-氨基被糖化的糖化氨基酸，和前述糖化蛋白質(zhì)分解物中的α-氨基的糖化部分分解。通過前述FAOD-α處理，糖化氨基酸中，側(cè)鏈氨基被糖化的殘存而不被分解。但是，考慮到這種側(cè)鏈被糖化的氨基酸相對于全部糖化氨基酸的比例，及其相對于糖化蛋白質(zhì)中具有糖化側(cè)鏈氨基的糖化氨基酸的比例，殘存的糖化氨基酸的影響是小的，測定精度得到充分提高。作為處理條件，例如，反應(yīng)液中FAOD- α的濃度為10-5000U/L，反應(yīng)液中血細胞的濃度為0. 5-20體積％，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為1分鐘至1小時，pH為6_9。這種處理通常在緩沖液中進行，可以使用與前述蛋白酶處理相同的緩沖液。接著，將經(jīng)前述FAOD-α處理的前述溶血樣品用FAOD-a S進一步處理。如上述，這種FAOD-a S作用于糖化a -氨基和糖化側(cè)鏈氨基二者。但是，由于預(yù)先已用分解用FAOD-a 處理糖化蛋白質(zhì)分解物，因而可以使測定用FAOD-a S僅作用于糖化側(cè)鏈氨基。這種FAOD-a S處理，與前述蛋白酶處理相同，優(yōu)選在緩沖液中進行，對前述緩沖液沒有特別的限制，可以使用與前述蛋白酶處理相同的緩沖液。作為處理條件，例如，反應(yīng)液中的FAOD-a S濃度為10-30000U/L，反應(yīng)液中的血細胞濃度為0. 1-5體積％，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為1分鐘至1小時，pH為6_9。接著，通過用POD和前述顯色底物進一步的氧化還原反應(yīng)而測定由前述FAOD-a S 處理形成的過氧化氫。作為顯色底物，例如，可以是N-(羧甲基氨基羰基)_4，4'-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉、鄰亞苯基二胺(OPD)、Trinder試劑和4-氨基安替比林組合的底物。作為前述 Trinder試劑，例如，可以是苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺和萘胺衍生物。而且，除前述氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在這些顯色底物中，特別優(yōu)選如前述的N-(羧甲基氨基羰基)-4，4'-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉。前述氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進行。其條件根據(jù)前述形成的過氧化氫的濃度等而適宜地確定。通常，反應(yīng)液中的POD濃度為10-100000IU/L，顯色底物濃度為 0. 005-30mmol/L，反應(yīng)溫度為15_37°C，反應(yīng)時間為0. 1-30分鐘，pH為5-9。而且，對前述緩沖液沒有特別的限制，例如，可以使用與前述蛋白酶處理和FAOD處理等相同的緩沖液。在前述氧化還原反應(yīng)中，例如，當使用前述顯色底物時，可以通過用分光光度計測定前述反應(yīng)液的顯色程度(吸光度)來測定過氧化氫的量。然后，例如，可以用此過氧化氫濃度和校正曲線等求出樣品中糖化蛋白質(zhì)的量。在本實施方案中，根據(jù)氨基酸殘基側(cè)鏈氨基的糖化量測定糖化蛋白質(zhì)的量。通過添加的分解用FAOD-a形成的過氧化氫首先與血液樣品(溶血樣品)中存在的過氧化氫酶反應(yīng)而消失，因此對通過FAOD-a S形成的來源于測定對象的過氧化氫的測定沒有任何影響。此外，另一方面也可以通過添加過氧化氫酶而除去。當如前述通過過氧化氫酶除去時，為了防止后來進行的FAOD-a S處理形成的過氧化氫被除去，優(yōu)選在加入 FAOD- a S時加入過量的POD和顯色底物。在這種情況下，相對于前述過氧化氫酶的添加量 (U)，例如，優(yōu)選添加5-100倍的活性(U)量的POD。前述過氧化氫量不僅可以用前述POD等酶法測定，而且例如，可以通過電方法測定。在此測定中，前述蛋白酶處理不限于如前述在前述分解用FAOD-a處理之前，例如，也可以在FAOD-a處理之后進行。如上述，進行前述蛋白酶處理以使FAOD可以容易地作用，但是由于進行前述FAOD-α處理是為了分解糖化氨基酸，因此即使在FAOD-α處理之前沒有用蛋白酶分解糖化蛋白質(zhì)，也可以充分地實現(xiàn)本發(fā)明的效果。例如，本實施方案的測定方法還適用于當非測定對象糖化物為α -氨基被糖化的糖化氨基酸，測定對象糖化胺為α-氨基被糖化的糖化蛋白質(zhì)的時候。在這種情況下，即使分解用FAOD難以作用于糖化蛋白質(zhì)，例如，殘存的分解用FAOD也可能作用于由蛋白酶處理得到的蛋白酶分解物，因此，例如，優(yōu)選如下述第二實施方案那樣通過蛋白酶分解而使殘存的FAOD失活，或者如第三實施方案那樣調(diào)節(jié)分解用FAOD與測定用FAOD的添加比例。(第二實施方案)本實施方案是將相同的FAOD用于非測定對象糖化物糖化氨基酸的分解和測定對象糖化蛋白質(zhì)的測定的前述第二測定方法的一個實例。對FAOD沒有特別的限制，例如可以使用 FAOD- α、FAOD-S 禾口 FAOD- α S 中的任一種。以與前述第一實施方案相同的方式制備溶血樣品，并將分解用FAOD加到此溶血樣品中。作為處理條件，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度為10-5000U/L，反應(yīng)液中的血細胞濃度為0. 5-20體積％，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為1分鐘至1小時，pH為6_9。這種處理通常在緩沖液中進行，可以使用與前述相同的緩沖液。接著，對經(jīng)FAOD處理的樣品進行蛋白酶處理。此蛋白酶處理的第一個目的，與前述相同，是分解來源于血細胞的糖化蛋白質(zhì)，以使后面的步驟中進一步添加的測定用FAOD 容易作用。第二個目的是通過消化使前述分解用FAOD失活。由于FAOD難以作用于糖化蛋白質(zhì)，而容易作用于糖化氨基酸，因此在前述分解用 FAOD處理中，樣品中的糖化氨基酸先被分解。但是，當在這種分解用FAOD殘存的狀態(tài)下用蛋白酶處理前述糖化蛋白質(zhì)時，有這樣的問題，即殘存的FAOD與糖化蛋白質(zhì)分解物的糖化部分反應(yīng)，從而不能正確地測定。因而，可以用蛋白酶使殘存的FAOD失活，從而防止其與前述糖化蛋白質(zhì)分解物反應(yīng)。為此目的，需要使開始加入的分解用FAOD快速失活，并且添加能夠只分解糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶。對前述蛋白酶沒有特別的限制，可以使用與前述相同的蛋白酶。此前，其處理條件，例如，根據(jù)使用的蛋白酶的種類、糖化蛋白質(zhì)的種類及其濃度、分解用FAOD的種類及其量等適宜地確定。蛋白酶處理的反應(yīng)液中蛋白酶的添加量相對于分解用FAOD為100U/L而言，例如在1-1000000KU/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選在10-300000KU/L的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為100-100000KU/L 的范圍內(nèi)。具體而言，當用胰蛋白酶作為蛋白酶處理前述樣品時，例如，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為1000-30000KU/L，反應(yīng)液中的血細胞濃度為0. 2-5體積％，反應(yīng)液中的FAOD濃度為 10-1000U/L,反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為10分鐘至20分鐘，pH為6_9。接著，再次添加與分解用FAOD相同的FAOD作為測定用FAOD來處理通過前述蛋白酶處理得到的糖化蛋白質(zhì)分解物。因為有通過前述蛋白酶而失活的可能性，因此加入足量的這種測定用FAOD是必要的。還優(yōu)選這種測定用FAOD處理與前述相同在緩沖液中進行，對緩沖液沒有特別的限制，可以使用與前述蛋白酶處理相同的緩沖液。
測定用FAOD處理的反應(yīng)溶液中測定用FAOD的添加量相對于蛋白酶為10000KU/ L而言，例如，在10-1000000U/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選在100-200000U/L的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在 500-50000U/L 的范圍內(nèi)。作為具體的處理條件，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度為500-20000U/L，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為100-30000KU/L，反應(yīng)液中的血細胞濃度為0. 01-1體積％，反應(yīng)溫度為 15-40°C，反應(yīng)時間為1分鐘至1小時，pH為6-9。根據(jù)本實施方案，即使在糖化氨基酸的分解和糖化蛋白質(zhì)的測定中使用的FAOD 相同，也可以不受前述糖化氨基酸的影響而以高精度測定。(第三實施方案)本實施方案是將在非測定對象糖化物糖化氨基酸的分解和測定對象糖化蛋白質(zhì)的測定中使用相同的FAOD的實例。但是，本實施方案不同于前述第二實施方案，它不總是必需要用蛋白酶將分解用FAOD失活。由于酶的底物特異性，根據(jù)蛋白酶和FAOD的組合，可能存在用蛋白酶難以使FAOD失活的情況。本實施方案的方法在這種情況下是有效的。如果首先加入的分解用FAOD與通過蛋白酶形成的糖化蛋白質(zhì)分解物反應(yīng)，則不能提高測定精度，因此，如下所述，調(diào)節(jié)FAOD的添加比例是重要的。首先，以與前述第一實施方案相同的方式制備溶血樣品，并將分解用FAOD加到此溶血樣品中。當難以用蛋白酶使分解用FAOD失活時，需要加入一定范圍內(nèi)的分解用FA0D，以使即使活性殘存，在蛋白酶處理期間，其也不作用于所形成的糖化蛋白質(zhì)分解物。由于FAOD 具有難以作用于糖化蛋白質(zhì)，而比作用于糖化肽更容易地作用于糖化氨基酸的性質(zhì)，因此， 例如，優(yōu)選添加量和反應(yīng)時間為僅作用于糖化氨基酸的程度。作為FAOD處理的條件，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度為10-5000U/L，反應(yīng)溶中的血細胞濃度為0. 2-20體積％，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為1分鐘至1小時，pH為6_9。 這種處理通常在緩沖液中進行，可以使用與前述相同的緩沖液。接著，對前述經(jīng)FAOD處理的樣品進行蛋白酶處理。由于本實施方案，如前述那樣， 是蛋白酶難以作用于前述FAOD的情況的實例，因而對蛋白酶的添加量沒有特別的限制。對前述蛋白酶沒有特別的限制，可以使用與前述相同的蛋白酶。其處理條件，與前述相同，根據(jù)使用的蛋白酶的種類、測定對象糖化蛋白質(zhì)的種類及其濃度、首先加入的FAOD 的種類及其濃度，以及使用的蛋白酶對FAOD的底物特異性等來適宜地確定。符合本實施方案內(nèi)的FAOD和蛋白酶的組合，例如，可以為商品FOD(旭化成社制) 和商品卜3 ★一 Λ (東洋紡社制)的組合，以及前述來源于赤霉屬的FAOD和商品蛋白酶 Κ( 口廠社制)的組合。當用胰蛋白酶作為蛋白酶處理前述樣品時，例如，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度為 100-6000U/L,反應(yīng)液中的血細胞濃度為0. 2-5體積％，反應(yīng)液中的FAOD濃度為0. 1-100U/ L，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時間為10分鐘至20小時，pH為6-9。然后，向前述通過蛋白酶處理得到的分解物中再次加入相同的FAOD作為測定用 FAOD0此測定用FAOD處理也優(yōu)選與前述相同在緩沖液中進行，對前述緩沖液沒有特別的限制，可以使用與前述蛋白酶處理相同的緩沖液。
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這樣，在本實施方案中，分解用FAOD⑷與測定用FAOD⑶的添加比例(活性比 A B)，例如，如前述那樣，在1 50000-1 10的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1 5000-1 25的范 圍內(nèi)，更優(yōu)選在1 500-1 50的范圍內(nèi)。如此設(shè)定，與前述第二實施方案不同，前述分解 用FAOD殘存在反應(yīng)液中，但是，由于這種殘存的FAOD的反應(yīng)速度非常低，因此在蛋白酶處 理步驟中殘存的FAOD作用于形成的糖化蛋白質(zhì)分解物沒有達到影響測定的程度。作為測定條件，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度為500-20000U/L，反應(yīng)液中的蛋白酶 濃度為100-30000KU/L，反應(yīng)液中的血細胞濃度為0. 01-1體積％，反應(yīng)溫度為15-40で，反 應(yīng)時間為1分鐘至1小吋，pH為6-9。實施例(實施例1和比較例1)對患者實施含氨基酸和葡萄糖的點滴，在1小時后，采集血液。將該血液離心分離 (lOOOg, 10分鐘)，分離血細胞和血菜，將0. 006mL前述血細胞部分、0. OOBmL前述血菜部分 和0. 45mL下述溶血試劑A混合，以使前述血細胞溶血而制備溶血樣品。(溶血試劑A :pH 8. 5)商品TAPS (同仁化學(xué)社制)140mmol/L甘氨酰胺(ナヵライテスク社制)60mmol/L聚氧乙烯月桂基醚(ナヵライテスク社制) Mg/L在25で下將0. 0023mL下述各種FAOD溶液(濃度200KU/L)加到前述溶血樣品中， 于37で下培養(yǎng)40分鐘。下述(1)來源于青霉屬的FAOD特異性作用于糖化a-氨基，(2) 來源于曲霉屬的FAOD特異性作用于糖化a-氨基和糖化￡-氨基，(3) FAOX-E是特異性作 用于糖化a-氨基的FAOD。(使用的FAOD)(1)來源于前述青霉屬的FAOD (特開平8-336386公報)(2)來源于前述曲霉屬的FAOD (WO 99/20039)(3)商品FAOX-E (キツコーマン社制，下文相同)接著，往0. OlmL前述添加了 FAOD的溶血樣品中加入0. OlmL純化水，并進一歩加 入0. 065mL下述蛋白酶試劑，于37で下培養(yǎng)5分鐘。然后加入0. 045mL下述顯色試劑，于 37°C下培養(yǎng)3分鐘，用測定裝置(商品JCA BM-8,日本電子社制)測定反應(yīng)液的吸光度(波 長751nm)。作為比較例，除將純化水而不是前述各種FAOD加到前述溶血樣品中以外，以與 前述實施例相同的方式進行測定。而且，作為對照，除了向前述血菜中而不是前述血球中加 入純化水以外，以與前述實施例相同的方式進行測定。其結(jié)果如下表1所示。(蛋白酶試劑pH6.5)
MOPS (同仁化學(xué)社制)5 mmol/L
四挫鶴化合物(商品WST-3，同仁化學(xué)社制)2 mmol/L NaNs (ナカライテスク社制)0.05 g/L
CaCl2 (ナカライテスク社制)5 mmol/L
NaCl (ナカライテスク社制)300 mmol/L
金屬蛋白酶3 g/L
權(quán)利要求
1. 一種糖化蛋白質(zhì)的含量的測定方法，其通過用蛋白酶對樣品中的糖化蛋白質(zhì)進行處理，然后用果糖基氨基酸氧化酶即FAOD對生成的糖化氨基酸和/或糖化肽進行處理，從而測定糖化蛋白質(zhì)的含量，其特征在于，包含下述前處理工序在用蛋白酶對糖化蛋白質(zhì)進行處理之前，通過使果糖基氨基酸氧化酶即FAOD作用于所述樣品中可能存在的非糖化蛋白質(zhì)來源的糖化氨基酸，從而對所述糖化氨基酸進行分解處理。
全文摘要
本發(fā)明提供以糖化胺為測定對象的樣品的前處理方法，并以可能進行可信的優(yōu)良糖化胺測定為目的。使果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)作用于樣品中的糖化氨基酸而將其分解后，進一步使FAOD作用于前述樣品中的測定對象糖化胺，通過測定其氧化還原反應(yīng)而測定糖化胺的量。作用于糖化氨基酸的FAOD和作用于糖化胺的FAOD可以具有相同的底物特異性，也可以具有不同的底物特異性。當使用相同的FAOD時，在使FAOD作用于糖化氨基酸而將其分解后，通過蛋白酶使前述FAOD失活，同時分解前述糖化胺，進一步添加相同的FAOD使之作用，測定其氧化還原反應(yīng)。
文檔編號C12Q1/37GK102207508SQ201110072029
公開日2011年10月5日 申請日期2002年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月11日
發(fā)明者小森胤樹, 米原聰 申請人:愛科來株式會社