專利名稱：一種提高豆科樹種抗干、熱能力的t49ma菌株及其根瘤化種苗的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物菌種資源，尤其是一種能有效提高干熱河谷地區(qū)豆科樹種快速生長(zhǎng)及具有優(yōu)良抗逆性即抗干、熱能力的菌株及其根瘤化種苗的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
在自然界中，普遍存在著由根瘤菌(root nodule bacteria)與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮?dú)夤┲参餇I(yíng)養(yǎng)的共生體系，可以增加土壤中的氮素來源。提高宿主吸收磷、鉀等多種營(yíng)養(yǎng)元素及水分，因此，增強(qiáng)了宿主植株的抗逆性和抗病性，使宿主產(chǎn)量增加和品種提高，促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育。豆科樹種具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其本身對(duì)不良環(huán)境抗逆性強(qiáng)，在改良土壤、提高土壤肥力、保持水土和改善生態(tài)環(huán)境中具有顯著優(yōu)勢(shì)。原因在于豆科植物可以與細(xì)菌中的共生固氮菌如根瘤菌共生，起到固氮作用，為植物提供的氮素營(yíng)養(yǎng)，有利于植物的生長(zhǎng)。豆科植物與根瘤菌的共生固氮量可以滿足豆科植物三分之一到二分之一的氮素需要。在我國(guó)，固氮的豆科樹種和根瘤菌的資源是十分豐富的。而豆科樹種中又有很多具有速生、耐瘠薄、耐干旱的樹種。與豆科樹種共生固氮的根瘤菌除了能夠和豆科植物共生提高豆科植物的固氮能力外，其本身也具有一定的抗逆性，因此，在造林時(shí)選用能夠固氮的豆科樹種以及人工篩選出具有抗逆性強(qiáng)、適宜干熱河谷地區(qū)造林用的根瘤菌接種到豆科樹種上，則可以提高豆科樹種的結(jié)瘤和固氮能力，且在受到不利于植物生存的環(huán)境壓力時(shí)也可以讓植物更好的生存。干熱河谷是西南橫斷山脈地區(qū)河谷深切所形成的特有氣候類型，在中國(guó)西南地區(qū)分布非常廣泛。其氣候特征是年平均溫21—23度，最冷月均溫14一15度，不小于10 度，積溫7900— 8700度，年均降水量600— 800mm，年均蒸發(fā)量2700— 3800mm，其蒸發(fā)量大于降水量3—6倍，降水集中，年均降水量有80%—90%集中于雨季，干季更加干旱。由于干熱河谷地區(qū)的氣候特征使得該地區(qū)的植被一旦破壞就極難恢復(fù)，因此在對(duì)該地區(qū)造林時(shí)， 需要重視樹種的選擇以保證植被在受到干熱環(huán)境脅迫時(shí)能夠安全度過危險(xiǎn)期。然而到目前為止，國(guó)內(nèi)對(duì)此問題的研究還處于初期階段，尚未取得突破性進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高干熱河谷地區(qū)豆科樹種生長(zhǎng)及具有高效抗旱性能的菌株，使之能在干熱河谷地區(qū)造林恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)中得到有效的應(yīng)用，同時(shí)提供一種該菌株根瘤化種苗的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株是日本慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)CGMCC No :4590，保藏日期2011年02 月18日。
該菌株是在干熱河谷野外選擇采集的具有抗干、熱能力的山毛豆根瘤中經(jīng)過分離純化、鏡檢、回接獲得的菌株。該菌株在YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天，菌落呈圓形，表面光滑、邊緣整齊，隆起形狀低凸，透明度較好。液體培養(yǎng)的培養(yǎng)液渾濁、無可溶性色素及菌內(nèi)分化。本發(fā)明T49MA菌株根瘤化種苗的培養(yǎng)方法如下
(1)選擇豆科植物為宿主；
(2)將本發(fā)明的菌株^ra辦力i腫japonicum,CGMCC No :4590在YMA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)繁；
(3)將選擇的豆科植物種子進(jìn)行常規(guī)消毒后待用，或是將消毒的種子進(jìn)行催芽使其長(zhǎng)出小苗；
(4)在經(jīng)擴(kuò)繁后的本發(fā)明W^Bmdyrhizobiumjaponicum的菌液中加入按重量份計(jì)分別為1份泥炭或草炭、1份蛭石、1份經(jīng)滅菌的干腐質(zhì)土和1份經(jīng)滅菌的泥土，并進(jìn)行攪拌形成根瘤菌劑基質(zhì)；
(5)將步驟(3)中的種子或是小苗根用根瘤菌劑基質(zhì)包裹后種植于穴盤中，管護(hù)中保持適度溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間只需葉部噴灑水，3周后移入溫室中，進(jìn)行正常水、肥管理，3. 5月后即可得根瘤化種苗。所述的YMA培養(yǎng)基配方為，在IOOOmL培養(yǎng)基中分別含有甘露醇10. 0g，K2HPO4 0. 25g, KH2PO4 0. 25g, MgSO4 · 7H20 0. 20g, NaCl 0. IOg, CaCl2 · 6H20 0. 10g，酵母粉 0. 80g, 瓊脂 15. 0g;其 pH 值為 6. 8 -7.0。本發(fā)明菌株是在對(duì)野外干熱河谷地區(qū)的絕大數(shù)的豆科樹種根瘤進(jìn)行采集分離培養(yǎng)，并將該菌株與宿主共生培養(yǎng)，經(jīng)過抗干熱實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后篩選出來的。該菌株適合絕大多數(shù)的豆科植物，具有較高的結(jié)瘤和固氮能力，同時(shí)具有較強(qiáng)的抗干、熱能力。對(duì)干熱河谷地區(qū)從未種植過豆科植物的土壤，由于其缺乏甚至沒有相應(yīng)的土著根瘤菌，因此必須予以接種根瘤菌才能有效地提高干熱河谷地區(qū)豆科樹種快速生長(zhǎng)及抗旱能力。本發(fā)明的這種菌株是在干熱河谷地區(qū)篩選出的抗干、熱的優(yōu)良菌株，能有效地提高干熱河谷地區(qū)豆科樹種快速生長(zhǎng)及抗旱能力，因此，對(duì)干熱河谷地區(qū)的植被恢復(fù)以及受到干、熱環(huán)境脅迫時(shí)豆科樹種能夠安全度過危險(xiǎn)期，保證大面積在干熱河谷地區(qū)造林的成活率具有重要的利用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明的菌株是在經(jīng)過選用2004年在云南省元某、元江及東川三個(gè)干熱河谷地區(qū)野外采集具有抗干熱的豆科樹種，如臺(tái)灣相思等的根瘤進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過對(duì)不同豆科樹種無菌種苗的共生培養(yǎng)試驗(yàn)，待根瘤化后，對(duì)根瘤化種苗進(jìn)行抗干、熱試驗(yàn)，通過生物量測(cè)定、根瘤形態(tài)觀察及根瘤數(shù)量等指標(biāo)，選擇能明顯促進(jìn)樹木生長(zhǎng)和抗干熱能力、 并與對(duì)照生物量達(dá)到顯著差異的優(yōu)良菌株進(jìn)行分子鑒定后篩選出的。該菌株的特點(diǎn)是抗干熱能力強(qiáng)，對(duì)多個(gè)樹種具有結(jié)瘤能力，接種成功后能提高宿主的抗干熱能力。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程從2004年6月份開始在西南林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室和溫室大棚內(nèi)進(jìn)行，本發(fā)明菌株培養(yǎng)的抗干、 熱種苗成活率達(dá)到了 98%以上，具體的種苗繁育過程如下
豆科樹種根瘤菌的篩選首先采集干熱河谷野外具有抗干熱的豆科重要樹種，如山毛豆的飽滿、圓潤(rùn)的根瘤，將根瘤在4度冰箱中冷藏1周，用流水沖洗20分鐘，在70 75%的酒精中表面消毒30 50秒，無菌水漂洗一次，又用m的次氯酸鈉消毒20分鐘，用無菌水沖洗4 5次，再以0.1%的升汞溶液消毒10 15分鐘，最后用無菌水沖洗5次。取滅菌的培養(yǎng)皿3-4個(gè)，每皿加滅菌水0. 5ml，將以上根瘤放入第一皿中用滅菌玻棒搗碎，靜置30min 使組織內(nèi)細(xì)菌流入水中配成懸浮液，用接種環(huán)從第一皿內(nèi)移植2-3環(huán)到第二皿內(nèi)充分混合后再移植到第三皿，依次稀釋到最后一皿將熔化的YMA根瘤菌培養(yǎng)基冷卻到一定溫度后倒入每個(gè)皿中，使培養(yǎng)基與菌懸液混勻，冷卻后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿在30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到分離到純菌落進(jìn)行菌種保存(為一級(jí)菌種)。根瘤菌二級(jí)菌種培養(yǎng)將分離得到的純菌種在YMA液體中進(jìn)行培養(yǎng)。YMA液體培養(yǎng)基配方為在IOOOmL培養(yǎng)基中分別含有甘露醇10. 0g, K2HPO4 0. 25g, KH2PO4 0. 25g, MgSO4 · 7H20 0. 20g, NaCl 0. IOg, CaCl2 · 6H20 0. IOg,酵母粉 0. 80g,其 pH 值為 6. 8 _7· 0， 每50毫升三角瓶中加入2接菌環(huán)的根瘤菌，搖床培養(yǎng)7天，即得渾濁根瘤菌液體菌液。根瘤菌三級(jí)菌種培養(yǎng)取上述菌液1升與等重量的泥炭1kg、蛭石1kg、經(jīng)過121度 1. 5小時(shí)高壓滅菌的干腐殖土 Ikg和泥土 Ikg攪拌混勻，形成根瘤菌的三級(jí)菌種。接種試驗(yàn)和根瘤化過程選擇一種豆科植物，如相思樹種、山毛豆，種子消毒、催芽后，將其小苗用根瘤菌三級(jí)菌種基質(zhì)包裹種植于穴盤中，在適度溫度下，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間向葉部噴灑水，促進(jìn)種子萌發(fā)或新根生長(zhǎng)，3周后移入溫室中進(jìn)行正常水、肥、藥管理，3. 5月后即可得根瘤化種苗。
權(quán)利要求
1.一種提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株，其特征在于該菌株是日本慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum,保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)=CGMCC No :4590，保藏日期:2011年 02月18日。
2.如權(quán)利要求1所述的一種提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株根瘤化種苗的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)選擇豆科植物為宿主；(2)將本發(fā)明的菌株^ra辦力i腫japonicum,CGMCC No :4590在YMA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)繁；(3)將選擇的豆科植物種子進(jìn)行常規(guī)消毒后待用，或是將消毒的種子進(jìn)行催芽使其長(zhǎng)出小苗；(4)在經(jīng)擴(kuò)繁后的本發(fā)明W^Bmdyrhizobiumjaponicum的菌液中加入按重量份計(jì)分別為1份泥炭或草炭、1份蛭石、1份經(jīng)滅菌的干腐質(zhì)土和1份經(jīng)滅菌的泥土，并進(jìn)行攪拌形成根瘤菌劑基質(zhì)；(5)將步驟(3)中的種子或是小苗根用根瘤菌劑基質(zhì)包裹后種植于穴盤中，管護(hù)中保持適度溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間只需葉部噴灑水，3周后移入溫室中，進(jìn)行正常水、肥管理，3. 5月后即可得根瘤化種苗。
3.如權(quán)利要求2所述的根瘤化種苗的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的YMA培養(yǎng)基配方為，在 IOOOmL 培養(yǎng)基中分別含有甘露醇 10. 0g, K2HPO4 0. 25g，KH2PO4 0. 25g，MgSO4 · 7H20 0. 20g, NaCl 0. 10g，CaCl2 · 6H20 0. 10g，酵母粉 0. 80g，瓊月旨 15. Og ；其 pH 值為 6. 8 -7.0。
全文摘要
一種提高豆科樹種抗干、熱能力的T49MA菌株及其根瘤化種苗的培養(yǎng)方法，涉及一種生物菌種資源，尤其是一種能有效提高干熱河谷地區(qū)豆科樹種快速生長(zhǎng)及具有優(yōu)良抗旱能力即抗干、熱能力的菌株及其根瘤化種苗的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的T49MA菌株是Bradyrhizobiumjaponicum，CGMCCNo4590。根瘤化種苗的培養(yǎng)方法包括菌株的分離純化、鏡檢、回接和接種。本發(fā)明的這種菌株是在干熱河谷地區(qū)篩選出的抗干、熱的優(yōu)良菌株，能有效地提高干熱河谷地區(qū)豆科樹種快速生長(zhǎng)及抗旱性，因此，對(duì)干熱河谷地區(qū)的植被恢復(fù)以及受到干、熱環(huán)境脅迫時(shí)豆科樹種能夠安全度過危險(xiǎn)期，保證大面積在干熱河谷地區(qū)造林的成活率具有重要的利用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102181391SQ20111006969
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者伍建榕, 周利平, 張東華, 曾小紅, 郭瑞超, 馬煥成 申請(qǐng)人:西南林業(yè)大學(xué)