專利名稱：一種洛伐他汀的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種洛伐他汀的制備方法，尤其涉及一種通過發(fā)酵法制備洛伐他汀的方法。
背景技術(shù)：
洛伐他汀(lovastatin,也稱莫那可林K, monacolin K)是一種來源于微生物HMG-CoA(羥甲基戊二酰輔酶A)還原酶抑制劑，是用于治療高膽固醇癥的藥物，它能阻止動脈硬化發(fā)展，減少心肌梗塞等發(fā)病的危險，因此在醫(yī)學(xué)上具有重要意義。目前生產(chǎn)中普遍存在產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)成本偏高等問題。目前，生產(chǎn)洛伐他汀所采用的微生物主要有三大類青霉菌、紅霉菌和土曲霉，其中土曲霉是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的菌種。國內(nèi)對其研究主要集中在提取工藝研究和發(fā)酵碳源、氮源優(yōu)化方面及發(fā)酵過程中菌球形態(tài)變化。國外對其發(fā)酵過程研究主要集中在洛伐他汀生物合成途徑及其前體的研究。金屬離子及生物素對土曲霉菌(Aspergillus terreus)發(fā)酵產(chǎn)生洛伐他汀產(chǎn)量的影響尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種洛伐他汀的制備方法，從而有效提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的一種洛伐他汀的制備方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對土曲霉菌種進行發(fā)酵以獲得洛伐他汀的步驟，其特征在于，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和/或鋅離子溶液。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，在所述制備方法中，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液或鋅離子溶液，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為0. 00002%。-0. 0002%。(w/w)或鋅離子濃度為0. 5mM-9mM ;優(yōu)選為發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為 0. 00002% -0. 00012%。(w/w)或鋅離子濃度為 lmM-7mM。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，在所述制備方法中，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和鋅離子溶液，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為0. 00002-0. 0002%。(w/w)和鋅離子濃度為0. 5mM9mM ;優(yōu)選為發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為 0. 00006-0. 00012%。(w/w)和鋅離子濃度為 lmM-7mM。優(yōu)選的，在發(fā)酵開始后的0_36h過程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和/或鋅離子溶液，然后再繼續(xù)進行發(fā)酵。申請人發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初期加入已滅菌的生物素溶液和/或鋅離子溶液，效果較好。其它發(fā)酵的條件本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)常規(guī)發(fā)酵方法進行選擇。例如，可在發(fā)酵藥瓶中，以200r/min在26 土 1°C的旋轉(zhuǎn)式搖床中進行發(fā)酵180-230 小時。本發(fā)明的洛伐他汀的制備方法中，通常還包括在發(fā)酵之前將菌種在種子培養(yǎng)基中 進行培養(yǎng)的步驟，然后再將培養(yǎng)后獲得的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵。優(yōu)選的，在種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的條件為在在溫度26±1°C下培養(yǎng)90-96h。優(yōu)選的，將培養(yǎng)后獲得的種子液以5-15%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明的洛伐他汀的制備方法中，通常還包括在發(fā)酵之后對發(fā)酵液進行分離提純的步驟。例如對發(fā)酵液進行過濾、萃取、結(jié)晶、干燥，以獲得洛伐他汀成品。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，可以先將菌種接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度26土 1°C下培養(yǎng)90-96h，然后按10%接種量將培養(yǎng)后獲得的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，200r/min，26土 TC旋轉(zhuǎn)式搖床進行發(fā)酵，在發(fā)酵0-36h過程中，單獨添加已滅菌的生物素溶液或鋅離子溶液，使得發(fā)酵瓶培養(yǎng)基中生物素濃度為0. 00002%。-0. 00012%。(w/w)或鋅離子濃度為0. 5mM9mM，或者復(fù)合添加已滅菌的生物素溶液和鋅離子溶液，使得發(fā)酵瓶培養(yǎng)基中生物素濃度為0. 00006-0. 00012%。(w/w)和鋅離子濃度為0. 5mM9mM。培養(yǎng)216h ；將所得發(fā)酵液按常規(guī)處理，過濾、萃取、結(jié)晶、干燥，即得洛伐他汀成品。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以按照常規(guī)配制方法進行配制。例如，發(fā)酵培養(yǎng)基可以為(按重量百分比計):20%葡萄糖、4%豆柏、0. 5%麥精、1%蛋白胨、0. l%NaCl、0. 05% MgS04、0. 05% KH2P04、0. 1% NaN03、余量為水，pH6. 8。在洛伐他汀的生物合成過程中，首先是乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A經(jīng)LovB、LovC基因編碼的聚酮合成酶合成二氫莫那克林L，然后在LovA基因編碼的P450加氧酶的作用下將其氧化成中間體莫那克林J。同時LovF基因編碼的二酮合成酶則催化乙酸和丙二酸單位縮合為2-甲基丁酰側(cè)鏈，并在LOvD基因編碼的酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)的作用下，被轉(zhuǎn)移至莫那克林J分子的C-8位羥基上成為最終產(chǎn)物洛伐他汀。實驗發(fā)現(xiàn)金屬離子Zn2+影響洛伐他汀的生物合成過程中相關(guān)酶的活性。本發(fā)明中，可以通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸鋅來添加鋅離子，也可以通過添加氯化鋅等來實現(xiàn)。本申請的發(fā)明人在研究提高洛伐他汀產(chǎn)量的過程中驚奇的發(fā)現(xiàn)，向土曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入金屬離子Zn2+和生物素，能提高洛伐他汀的產(chǎn)量。使用本發(fā)明提供的方法，通過向洛伐他汀發(fā)酵培養(yǎng)基中加入金屬離子Zn2+和生物素，無論是單獨的加入金屬離子Zn2+或生物素，還是加入復(fù)合的金屬離子Zn2+和生物素，均能顯著提高洛伐他汀的生物合成。而且，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入金屬離子Zn2+和生物素時，金屬離子Zn2+和生物素之間能起協(xié)同作用，大幅提高洛伐他汀的產(chǎn)量。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。除特別說明外，以下實施例中所使用的％均為重量比。在本發(fā)明的實施例中，將斜面(即菌種)接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，26±0.5°C搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，周期90-96小時；按10%接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基按常規(guī)配制方法配制，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為20%葡萄糖、4%豆柏、0.5%麥精、1%蛋白胨、0. I % NaCUO. 05% MgS04、0. 05% KH2P04、0. I % NaNO3、余量為水，pH6. 8，發(fā)酵溫度為26±1°C。在本發(fā)明的實施例中，洛伐他汀的含量測定采用HPLC，照高效液相色譜法(中國藥典2000版二部附錄VD)進行檢測。
實施例I添加金屬離子Zn2+對洛伐他汀產(chǎn)量的影響配制洛伐他汀的發(fā)酵培養(yǎng)基，并向洛伐他汀發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加ZnSO4,使Zn2+在相應(yīng)的培養(yǎng)基中的重量比濃度分別為lmM、3mM、5mM、7mM，同時，以不加ZnSO4的洛伐他汀原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)發(fā)酵培養(yǎng)216小時后，取樣測定洛伐他汀的含量。結(jié)果如表I所示。 表I、添加ZnSO4對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種洛伐他汀的制備方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對土曲霉菌種進行發(fā)酵以獲得洛伐他汀的步驟，其特征在于，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和/或鋅離子溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，在所述制備方法中，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液或鋅離子溶液，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為O.00002%。-O. 0002%。(w/w)或鋅離子濃度為O. 5mM-9mM ;優(yōu)選為發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為 O. 00002% -O. 00012%。(w/w)或鋅離子濃度為 lmM-7mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在干，在所述制備方法中，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和鋅離子溶液，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為O.00002-0. 0002%。(w/w)和鋅離子濃度為O. 5mM-9mM ;優(yōu)選為發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度為O.00006-0. 00012%。(w/w)和鋅離子濃度為 lmM_7mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵條件為在26土TC下發(fā)酵180-230 小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，還包括在發(fā)酵之前將菌種在種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟，然后再將經(jīng)過培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法,其特征在于,菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為5-15%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法，其特征在于，在發(fā)酵開始后的0-36h過程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和/或鋅離子溶液，然后再繼續(xù)進行發(fā)酵。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法，其特征在于，所述洛伐他汀的制備方法，還包括在發(fā)酵之后對發(fā)酵液進行分離提純的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為(按重量百分比計):20%葡萄糖、4%豆柏、O. 5%麥精、1%蛋白胨、O. I % NaCUO. 05% MgS04、0. 05%KH2P04、0. 1% NaNO3、余量為水，pH6. 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的制備方法,其特征在于，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加鋅離子是通過添加硫酸鋅或者氯化鋅來實現(xiàn)的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種洛伐他汀的制備方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對土曲霉菌種進行發(fā)酵以獲得洛伐他汀的步驟，其特征在于，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已滅菌的生物素溶液和/或鋅離子溶液。本發(fā)明的制備方法有效提高洛伐他汀的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P17/06GK102676601SQ20111006542
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者劉守強, 張宏周, 時新生, 李武德, 李翠平, 毛全貴, 沈芳, 焦國華, 王文華 申請人:河南天方藥業(yè)股份有限公司