專利名稱：八月紅梨果實(shí)單果重主效qtl的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，本發(fā)明涉及‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，可用于梨果實(shí)單果重性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
背景技術(shù)：
梨(Pyrus L.)原產(chǎn)我國，是我國第三大果樹樹種。梨因其果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高，香甜多汁，而深受消費(fèi)者喜愛。單果重不僅是影響梨果實(shí)外觀品質(zhì)和商品性的重要因素，也是構(gòu)成梨品種產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的重要因素之一，因此，梨果實(shí)單果重的大小對(duì)梨品種至關(guān)重要。 培育具有理想單果重的品種已經(jīng)成為梨育種的重要目標(biāo)之一。由于梨為多年生木本果樹作物，與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的性狀大都是由多基因控制、易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，在分離后代表現(xiàn)為廣泛的表型變異，其基因型與表現(xiàn)型間的對(duì)應(yīng)關(guān)系難以確定。而以往的傳統(tǒng)育種是基于經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)理論，把控制某一性狀的多個(gè)基因作為整體進(jìn)行研究和選擇，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上改良目標(biāo)性狀難度越來較大。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善， 使得數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位變成了現(xiàn)實(shí)，也為提高目標(biāo)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準(zhǔn)確性及預(yù)見性奠定了基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記定位數(shù)量性狀QTL，其實(shí)質(zhì)就是分析分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀QTL之間的連鎖關(guān)系，即利用已知座位的分子標(biāo)記來定位未知座位的QTL，通過計(jì)算分子標(biāo)記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置。基于獲得的標(biāo)記基因型分離與數(shù)量性狀的量之間的關(guān)系，可直接把握數(shù)量性狀基因，并開發(fā)可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular-assisted selection,MAS)育種的技術(shù)，這已在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應(yīng)用。目前有關(guān)梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對(duì)一些病害或生長(zhǎng)性狀，對(duì)重要品質(zhì)性狀之一的果實(shí)單果重的QTL定位及分子標(biāo)記的研究尚沒有開展。因此，開展梨果實(shí)單果重主效基因的QTL定位，篩選緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立雜交后代早期輔助選擇技術(shù)，對(duì)于提高梨果單果重改良效率，縮短育種進(jìn)程，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的在于提供一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記引物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的又一目的在于提供‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用。本發(fā)明定位梨果實(shí)單果重主效QTL，并提供與QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過檢測(cè)這些分子標(biāo)記可以預(yù)測(cè)梨果實(shí)單果重，為實(shí)現(xiàn)對(duì)該性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術(shù)支持。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，是通過下列步驟篩選的a)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；b)用SSR、SRAP和AFLP三種分子標(biāo)記方法分析兩個(gè)親本及其F1群體，統(tǒng)計(jì)分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，獲得多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，然后對(duì)其進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建了 ‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。對(duì)多態(tài)性標(biāo)記為點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析時(shí)采用 Jionmap3. 0作圖軟件。c)對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實(shí)單果重進(jìn)行測(cè)定，利用區(qū)間作圖法(可利用MapQTL5.0作圖軟件)，將&群體每個(gè)單株的果實(shí)單果重與‘八月紅’梨遺傳連鎖圖譜中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，以LOD值彡2. 5為標(biāo)準(zhǔn)，大于2. 5 說明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，檢測(cè)到在母本‘八月紅’的第7連鎖群上檢測(cè)到單果重的QTL位點(diǎn) Pfw-I，其LOD值為4. 77，是主效QTL，距離最近的一個(gè)AFLP分子標(biāo)記為EACAMCAC_2000m， 大小為2000bp JgPfV-I的距離為1.019cM，該標(biāo)記可以作為梨果實(shí)單果重的標(biāo)記，所獲得的分子標(biāo)記 EACAMCAC-2000m 的 AFLP 引物為E_ACA 5 ' -GACTGCGTACCAATTCACA-3 ‘和 M-CAC 5' -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。上述的‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記，所述主效QTL位點(diǎn)PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋30. 9%的單果重特征。一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的AFLP分子標(biāo)記引物，該引物序列為 E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3‘和 M_CAC:5' -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記方法，用梨基因組DNA，限制性內(nèi)切Bl為 EcoR I 禾Π Mse I, AFLP 弓|物為 E-ACA 5' —GACTGCGTACCAATTCACA—3‘禾Π M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個(gè)分子標(biāo)記大小為2000bp，則表明與梨果實(shí)單果重的主效QTL位點(diǎn) Pfw-I相連鎖的分子標(biāo)記存在，PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋30. 9%的單果重特征。上述的‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用。上述的‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用，用梨基因組DNA，限制性內(nèi)切酶為EcoR I和Mse I，AFLP引物為E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3 ’和 M-CAC :5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個(gè)分子標(biāo)記大小為 2000bp，則表明與梨果實(shí)單果重的主效QTL位點(diǎn)相連鎖的分子標(biāo)記存在，可預(yù)測(cè)該梨品種果實(shí)具有較高的單果重。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明首次對(duì)決定‘八月紅’梨果實(shí)單果重的數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行了 QTL定位， 這為實(shí)現(xiàn)基于分子育種的多基因控制性狀改良奠定了重要的基礎(chǔ)和必要的前提。(2)本發(fā)明中確定了 ‘八月紅’果實(shí)單果重的主效QTL位點(diǎn)，對(duì)該數(shù)量性狀決定的貢獻(xiàn)率較高，位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為30. 9 %。因此，基于此位點(diǎn)篩選連鎖分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀判斷的準(zhǔn)確性大大提高。
(3)目前普遍認(rèn)為可應(yīng)用于分子輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的距離需 <5cM，本發(fā)明中與主效QTL連鎖的標(biāo)記距離為1.019cM，與目標(biāo)位點(diǎn)表現(xiàn)為緊密連鎖，這對(duì)于提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性和效率具有重要意義。因此，以上標(biāo)記具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可加快對(duì)梨果實(shí)單果重性狀改良的進(jìn)度


圖1為‘八月紅’單果重QTL位點(diǎn)Pfw-I在Β 17上的位置。BYH代表的是‘八月紅’連鎖群，BYH后的數(shù)字代表連鎖群數(shù)。連鎖群上左側(cè)的數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位為cM，右側(cè)則表示的是分子標(biāo)記的名稱。共有3種分子標(biāo)記， “E-M-”為AFLP標(biāo)記，E和M分別指限制性內(nèi)切酶Eco I和Mse I酶切，其后的數(shù)字是該標(biāo)記多態(tài)性條帶的編號(hào)；其它為SRAP、SSR標(biāo)記。連鎖群右側(cè)的實(shí)心長(zhǎng)方形指示QTL作圖區(qū)間Pfw-I。圖2為AFLP弓丨物組合E-ACA/M-CAC對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’ F1后代PCR擴(kuò)增結(jié)果在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳檢測(cè)圖。箭頭所指的條帶即EACAMCAC-2000m。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 a)利用我國的兩個(gè)梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交組合，獲得其97株F1群體。b)用 SSR(Simple sequence repeat)、 SRAP(Sequence related amplified polymorphism)禾口AFLP(Amplified fragment length polymorphism)三禾中分子標(biāo)記方法分析兩個(gè)親本及其F1群體，統(tǒng)計(jì)分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型。 最終獲得了 23個(gè)SSRs、S基因位點(diǎn)、2 個(gè)SRAPs和482個(gè)AFLPs等共732個(gè)多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，然后利用Jionmap3. 0作圖軟件對(duì)其進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建了一張共包含240個(gè)多態(tài)性標(biāo)記的‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。利用SSR、SRAP、AFLP分子標(biāo)記方法，對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進(jìn)行分析， 并統(tǒng)計(jì)分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型。SSR標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)操作程序參考^mamoto T.等(Euphytica，2002，124 :129-137)的方法；SRAP標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)操作程序參考Li等(Theor Appl Genet, 2001,103 =455-461)的方法；AFLP標(biāo)記分別使用Eco I和Mes I兩種內(nèi)切酶，具體實(shí)驗(yàn)操作程序參考Vos等(Nucleic Acids Res，1995，23 :4407-4414)的方法。所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。 SSR和SRAP標(biāo)記用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠強(qiáng)堿銀染法檢測(cè)，AFLP標(biāo)記用6%變性聚丙烯酰胺凝膠銀染檢測(cè)。將SSR、SRAP、AFLP電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的多態(tài)性條帶記為“ 1 ”，無帶記為“0”，不清楚的帶或缺失記為“_”，根據(jù)已知分子量的Marker (IOObp DNA Ladder)計(jì)算各多態(tài)性條帶的分子量。將分離條帶按親本來源歸類，確定其來源及遺傳類型。利用χ 2測(cè)驗(yàn)分析各標(biāo)記分離是否符合3 1或1 1的孟德爾分離比例，偏分離的在標(biāo)記末尾用“*”標(biāo)注。c)用Joinmap3. O分析軟件構(gòu)建‘八月紅’梨的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)按Joinmap3. O分析軟件中適于cp群體構(gòu)圖的格式導(dǎo)入Joinmap3. 0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點(diǎn)和顯著偏分離的位點(diǎn)，以LOD = 4. 0 7. 0，重組率=0. 4，選擇Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖(Van Ooi jen, 2001)。d)對(duì)該F1群體單株的果實(shí)單果重進(jìn)行了測(cè)定。將單果重的表型值和‘八月紅’連鎖圖譜的相關(guān)文件導(dǎo)入MapQTL5. O作圖軟件，選擇區(qū)間作圖法，以LOD值> 2. 5為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)梨的單果重在‘八月紅’的連鎖圖譜上進(jìn)行QTL分析和定位。結(jié)果表明，在‘八月紅’的第3連鎖群上檢測(cè)到單果重的QTL位點(diǎn)Pfw-I (圖1)， LOD值為4. 77，與最近的AFLP分子標(biāo)記EACAMCAC_2000m的連鎖距離為1. 019cM，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為30.9%。該QTL位點(diǎn)為主效QTL，其最近標(biāo)記的距離也遠(yuǎn)小于可應(yīng)用于分子輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的所要求的最大距離。其中AFLP分子標(biāo)記方法為，以梨DNA為模板，雙酶切體系20 μ 1 :DNA 400ng，IXNEB Buffer, BSA 0· 2 μ 1，EcoR I 3U, Mse I 3U。充分混勻后37°C酶切證，然后在65°C放置20min以使內(nèi)切酶失活。將5 μ 1的下述連接液加到上步失活后的酶切產(chǎn)物中1 μ 1 Mse I adopter (50 μ mol · μ L-1)，1 μ 1 EcoR I adopter (5 μ mol · μ L-1)，1 μ 1 T4 Buffer (IOX),
0.9U T4 DNA ligase，ddH201. 7μ 1。充分混勻后16°C連接過夜，65°C放置IOmin終止反應(yīng)。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μ 1 1 μ 1連接產(chǎn)物10 X稀釋液，2 μ 1 dNTP (2. 5mmol ，
1.2 μ IMgCl2(25mmol ‘ L-1), 1 μ 1 Mse I 預(yù)擴(kuò)引物(50ng · μ Γ1)，1 μ 1 EcoR I 預(yù)擴(kuò)引物 (50ng
權(quán)利要求
1.一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記，其特征在于是通過下列步驟篩選的(1)利用梨品種‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交獲得F1后代單株；(2)用SSR、SRAP和AFLP三種分子標(biāo)記方法分析兩個(gè)親本及其F1群體，統(tǒng)計(jì)分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，獲得多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，然后對(duì)其進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建‘八月紅’梨的遺傳連鎖圖譜。(3)對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’雜交后代的F1群體單株的果實(shí)單果重進(jìn)行測(cè)定，利用 MapQTL5.0作圖軟件的區(qū)間作圖法，將&群體每個(gè)單株的果實(shí)單果重與‘八月紅’梨遺傳連鎖圖譜中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，以LOD值≥2. 5為標(biāo)準(zhǔn)，大于2. 5說明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，檢測(cè)到在母本‘八月紅’的第7連鎖群上檢測(cè)到單果重的QTL位點(diǎn)PfV-1， 其LOD值為4. 77，是主效QTL，距離最近的一個(gè)AFLP分子標(biāo)記為EACAMCAC_2000m，大小為 2000bp，距PfV-I的距離為1.019cM，該標(biāo)記可以作為梨果實(shí)單果重的標(biāo)記，所獲得的分子標(biāo)記 EACAMCAC-2000m 的 AFLP 引物為 E-ACA 5 ' -GACTGCGTACCAATTCACA-3 ‘和 M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記，其特征在于 所述主效QTL位點(diǎn)PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋30.9%的單果重特征。
3.一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的AFLP分子標(biāo)記引物，其特征在于該引物序列為 E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3‘和 M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3‘。
4.一種‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記方法，其特征在于用梨基因組 DNA,限制性內(nèi)切酶為 EcoR I 和 Mse I，AFLP 引物為 E-ACA 5' -GACTGCGTACCAATTCACA-3‘ 和M-CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個(gè)分子標(biāo)記大小為2000bp，則表明與梨果實(shí)單果重的主效QTL位點(diǎn)PfV-I相連鎖的分子標(biāo)記存在，PfV-I位于‘八月紅’梨第3連鎖群上，其解釋 30. 9%的單果重特征。
5.權(quán)利要求1或2所述的‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于用梨基因組DNA，限制性內(nèi)切酶為 EcoR I 和 Mse I，AFLP 引 物為 E-ACA 5 ' —GACTGCGTACCAATTCACA—3 ‘和 M—CAC 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAACAC-3 ‘，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6 %變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如果獲得一個(gè)分子標(biāo)記大小為2000bp，則表明存在與梨果實(shí)單果重的主效QTL 位點(diǎn)相連鎖的分子標(biāo)記，可預(yù)測(cè)該梨品種果實(shí)具有較高的單果重。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，提供了‘八月紅’梨果實(shí)單果重主效QTL的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。利用SRAP、SSR、AFLP構(gòu)建‘八月紅’的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合對(duì)果實(shí)單果重的表型鑒定，采用區(qū)間作圖法對(duì)此群體進(jìn)行分析，在‘八月紅’的第7連鎖群上檢測(cè)到主效QTL的存在，可解釋30.9％的單果重特征。距離主效QTL位點(diǎn)Pfw-1距離最近的標(biāo)記為EACAMCAC-2000m，其距離為1.019cM。所獲得的可滴定酸主效QTL分子標(biāo)記對(duì)于加快梨品種的遺傳改良進(jìn)程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154273SQ20111003186
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者吳俊 , 張瑞萍, 張紹鈴, 李秀根, 楊健 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)