專利名稱：雞艾美耳球蟲卵囊批量制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種雞艾美耳球蟲卵囊批量制備方法，涉及生產(chǎn)雞艾美耳球蟲疫苗的卵囊(抗原)的分離純化方法。
背景技術(shù)：
關(guān)于雞艾美耳球蟲病艾美耳屬(Eimeria)球蟲(Coccidium)是寄生于雞腸道的一類專性寄生原蟲，引起雞球蟲病(Coccidiosis)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界已報(bào)道的雞球蟲共有15種，其中，有5種具有明顯的致病性，它們是柔嫩艾美耳球蟲(E. tenella)、毒害艾美耳球蟲(E. necatrix)、巨型艾美耳球蟲(E. maxima)、堆形艾美耳球蟲(E. acervulina)及和緩艾美耳球蟲(E.mitis)。 在5種具致病性的球蟲中，有3種對(duì)雛雞具危害性，它們是柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和堆形艾美耳球蟲。球蟲病是一種普遍存在的感染性疫病，世界上凡是有雞的地方就會(huì)有雞球蟲，就有球蟲病的發(fā)生，而規(guī)?；u場(chǎng)是雞球蟲病易發(fā)生的適宜場(chǎng)所，常常出現(xiàn)該病的爆發(fā)。雞球蟲病是一種感染迅速，傳播快而廣泛，且致病率、致死率極高的烈性感染病，在防治不當(dāng)?shù)那闆r下，感染率和死亡率均可高達(dá)50 %以上。因此，雞球蟲病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，全球每年因該病造成的損失高達(dá)數(shù)百億元人民幣，我國每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失不少于100億元。在養(yǎng)雞業(yè)集約化程度不斷提高的今天，雞球蟲病是養(yǎng)雞業(yè)疫病防控工作中不可缺少的環(huán)節(jié)。雞球蟲病的防治從上世紀(jì)80年代，雞球蟲病的防控取得了重大進(jìn)展，主要得益于大量抗球蟲藥物的出現(xiàn)，并取得令人滿意的成效。然而，大量的抗球蟲藥物多為化學(xué)類產(chǎn)品(如氯苯胍、尼卡巴嗪、二硝托胺、地克珠利、尼卡巴嗪和磺胺類藥物)和抗生素類產(chǎn)品(如莫能菌素、鹽霉素、拉沙菌素、那拉菌素、馬杜霉素、海南霉素)，這些產(chǎn)品的長(zhǎng)期使用必然導(dǎo)致抗藥性和藥物殘留現(xiàn)象的出現(xiàn)。而各種抗球蟲藥物的使用均為伴料給藥，實(shí)際上在上世紀(jì)90年代抗藥現(xiàn)象已十分普遍，在這種情況下新藥的研制壓力聚增，養(yǎng)雞企業(yè)的防控難度日益加大。進(jìn)入21世紀(jì)以來，全球范圍內(nèi)化學(xué)藥品和抗生素的使用受到限制，食品安全制度受到越來越多的關(guān)注，發(fā)達(dá)國家已基本禁止了化學(xué)抗球蟲藥物的使用，抗生素類抗球蟲藥物的使用也受到明顯的限制，在美國、日本和歐共體已明令禁止此類產(chǎn)品出現(xiàn)在飼料中。在我國由于各種抗球蟲藥物的不加限制的應(yīng)用，抗藥性已普遍產(chǎn)生，有的產(chǎn)品(如莫能菌素) 已無臨床使用價(jià)值。近年來我國的食品安全政策開始實(shí)施，同時(shí)消費(fèi)者自身的健康意識(shí)日益增強(qiáng)，抗球蟲藥物的市場(chǎng)日漸萎縮，而且，我國也將在近期實(shí)施禁止或限制使用抗球蟲藥物的市場(chǎng)政策，這樣雞球蟲病的防治形勢(shì)驟然緊張。為了有效防治雞球蟲病，確保養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展，迫切需要尋找新的防治方法，這其中疫苗接種預(yù)防是具有前途的途徑之一。然而，傳統(tǒng)的球蟲卵囊分離技術(shù)不適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，急切需要適用于規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)工藝。
現(xiàn)有卵囊分離技術(shù)雞球蟲卵囊須從雞糞便中分離，現(xiàn)有的分離技術(shù)有多種，但可歸納為2類，一類是漂浮法，另一類是密度梯度離心法，其中漂浮包括飽和鹽水漂浮法、蔗糖溶液漂浮法、飽和硫酸鎂漂浮法和飽和鉻硫酸漂浮法；梯度離心法只有一種即蔗糖密度梯度離心法。漂浮法由于球蟲卵囊的密度(1. 103 1. 064)介于水和飽和鹽水(蔗糖溶液、飽和硫酸鎂和飽和鉻硫酸)的密度之間，當(dāng)將含有雜質(zhì)的卵囊溶液放在水中離心機(jī)離心時(shí)，卵囊和少量的物質(zhì)比水密度大一起下沉，由于浮力作用，比水密度小的雜質(zhì)上浮，離心后，棄上清液，除去了比水密度小的雜質(zhì)；當(dāng)將含有雜質(zhì)的卵囊溶液放在飽和鹽水(蔗糖溶液、飽和硫酸鎂和飽和鉻硫酸)中離心時(shí)，由于浮力作用，卵囊和少量的物質(zhì)比飽和鹽水密度小一起上浮，離心后，棄沉淀，除去了比飽和鹽水密度大的雜質(zhì)。隨后，分離的卵囊用次氯酸鈉處理，去除細(xì)菌和卵囊表面的粘附物。飽和鹽水漂浮法操作步驟第1步取感染雞新鮮糞便10g，加水10倍混勻成糞液；第2步糞液經(jīng)60目分樣篩過濾，保留濾液；第3步濾液補(bǔ)足水量再經(jīng)200目分樣篩過濾，保留濾液；第4步濾液經(jīng)2000rpmX IOmin離心，棄上清液；第5步沉淀物加飽和鹽水，2000rpmX IOmin離心；第6步重復(fù)第5步；第7步取上浮液加水，3000rpmX 15min離心，沉淀物即為卵囊；第8步沉淀物加水，3000rpmX 15min離心洗去鹽分。蔗糖溶液漂浮法操作步驟第1步取感染雞新鮮糞便10g，加水2 5倍混勻成糞液；第2步糞液經(jīng)60目分樣篩過濾，保留濾液；第3步濾液補(bǔ)足水量再經(jīng)100或200目分樣篩過濾，保留濾液；第4步濾液加等量蔗糖溶液(sheather氏液)混合均勻，經(jīng)3000rpmX ;3min離心；第5步用20 25目撈網(wǎng)撈取上述離心管表面浮液于另一具水容器中；第6步3000rpmX ;3min離心，洗去糖溶液；第7步重復(fù)第6步，沉淀物即為卵囊。飽和硫酸鎂漂浮法操作步驟第1步取感染雞新鮮糞便10g，加水2 5倍混勻成糞液；第2步糞液經(jīng)60目分樣篩過濾，保留濾液；第3步濾液補(bǔ)足水量再經(jīng)100或200目分樣篩過濾，保留濾液；第4步濾液加等量飽和硫酸鎂溶液混合均勻，經(jīng)3000rpmX ;3min離心；第5步用20 25目撈網(wǎng)撈取上述離心管表面浮液于另一具水容器中；第6步3000rpmX ;3min離心，洗去飽和硫酸鎂溶液；第7步重復(fù)第6步，沉淀物即為卵囊。飽和鉻硫酸漂浮法操作步驟
第1步取感染雞新鮮糞便10g，加水10倍混勻成糞液；第2步1500rpmX5min離心，保留沉淀物；第3步沉淀物中加4 5倍量鉻硫酸液，冰浴條件下充分混勻，立刻進(jìn)行 1500rpmX5min 離心；第4步用吸管吸出上清液，加入20倍冰水，再1500rpmX5min離心；第5步重復(fù)1500rpmX5min離心2次，沉淀物即為卵囊。蔗糖密度梯度離心法基本原理根據(jù)球蟲卵囊的密度介于1. 103 1. 064之間，用蔗糖制成密度梯度，加入用飽和鹽水漂浮法分離的卵囊，經(jīng)過離心，收集兩個(gè)梯度之間的卵囊層，將密度大和密度小的雜質(zhì)與卵囊分開。操作步驟第1步按飽和鹽水漂浮法處理糞便，分離蟲卵；第2步蔗糖溶液梯度制備(按索勛，楊曉野，2005)；第3步取飽和鹽水漂浮法分離的濃縮卵囊液5ml，置于液面上，1500g離心 30min ；第4步分別收集檢查各梯度層和沉淀，有卵囊的各層分別收集，用生理鹽水或自來水離心洗滌，收集沉淀物；第5步沉淀物重懸于5ml水中，再次梯度離心，重復(fù)收集與洗滌過程?，F(xiàn)有制造技術(shù)的分析飽和鹽水漂浮法是實(shí)驗(yàn)室最常用的球蟲卵囊分離技術(shù)，該技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，易于掌握，可重復(fù)性好，結(jié)果可靠。但用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有嚴(yán)重缺陷。以日處理300kg雞糞為單班產(chǎn)能的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)為例，處理后的糞液量可達(dá)3300升，經(jīng)60目和200目篩分后，90%的糞液成為濾液(糞渣< 10% )，全部濾液達(dá)四70升。目前國內(nèi)最大容量的離心機(jī)為4X 500ml (轉(zhuǎn)速不低于3000rpm)，一次離心只能處理2000ml，要處理四70升濾液，一臺(tái)離心機(jī)需連續(xù)工作1485次；如1臺(tái)離心機(jī)一天工作10 次，則需要148臺(tái)大型離心機(jī)，這還不包括后續(xù)大量的離心分離與純化，因此，該項(xiàng)技術(shù)顯然不能用于規(guī)?；a(chǎn)，通過此種方法生產(chǎn)的疫苗由于成本過高也不適于生產(chǎn)中使用。以雞球蟲五價(jià)疫苗為例，3周齡肉雞日排糞按100克計(jì)，日產(chǎn)300kg糞便需3000只雞，每一個(gè)種600只，每只雞在一個(gè)周期內(nèi)(按7天計(jì))所排卵囊約可制備10000羽疫苗，每個(gè)周期可生產(chǎn)600萬羽疫苗，全年按300天生產(chǎn)計(jì)，共42個(gè)生產(chǎn)周期，總計(jì)可生產(chǎn)疫苗2. 52 億羽，這只是一個(gè)中等規(guī)模疫苗廠的產(chǎn)量。有鑒于此，雞球蟲疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝不能延用傳統(tǒng)技術(shù)，制定新的工藝流程是產(chǎn)業(yè)化的唯一出路。蔗糖溶液漂浮法的缺陷基本同飽和鹽水法，雖糞液量減少，但需加入與濾液等量的蔗糖溶液，仍然需大量反復(fù)的離心處理，不僅需大量的離心機(jī)，而且離心處理費(fèi)時(shí)過多， 此法也不能用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。飽和硫酸鎂漂浮法除具有上述缺陷外，本法多用于實(shí)驗(yàn)室中分離毀滅泰澤球蟲 (Tyzzeria perniciosa)禾口菲萊氏溫?fù)P球蟲(ffenyonella philiplevine)卵囊，不常用于雞致病性艾美耳球蟲卵囊的分離。飽和鉻硫酸漂浮法不僅需要大量的離心處理，還需要冰浴條件，這顯然不符合雞球蟲疫苗的生產(chǎn)條件，而且成本過高。蔗糖密度梯度離心法過程復(fù)雜，條件制備困難，分離過程包含了飽和鹽水漂浮法， 不足之處不再累述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)業(yè)化制備雞艾美耳球蟲卵囊的方法。本發(fā)明的方法為a、糞樣處理取感染雞新鮮糞便，加入其重量3倍的水稀釋混勻，加入胃蛋白酶充分混合后，靜置10分鐘后再加入7倍糞重量的水，混勻使成糞液，其中胃蛋白酶的加入量為 0. 05mg/克糞便；b、連續(xù)篩分處理糞液經(jīng)多層式振動(dòng)篩分過濾機(jī)處理，即從加料口勻速加入糞液， 由第1層至第4層連續(xù)分篩過濾，同時(shí)加水沖洗，后取下第4層篩網(wǎng)，用水將所有截留物洗出，至具刻度的容器中備用；多層式振動(dòng)篩分過濾機(jī)或稱多層式振動(dòng)篩分機(jī)，共設(shè)4層，第1層60目，第2層 200目，第3層325目，第4層1250目；c、飽和鹽水漂浮離心截留物加5倍體積的飽和鹽水充分混勻漂浮， 2500rpmX IOmin 離心；d、卵囊離心沉淀吸出離心管表面的漂浮物加至少于其體積10倍水混勻， 2500rpmX IOmin 離心；e、卵囊凈化去上清液，加水至離心管充滿混勻，2500rpmX IOmin離心，沉淀物即
為卵囊。本技術(shù)的特點(diǎn)(1)簡(jiǎn)化了工藝本技術(shù)實(shí)質(zhì)上是對(duì)飽和鹽水法的技術(shù)改良，整個(gè)卵囊分離過程減少了三個(gè)單元，工藝技術(shù)的工序簡(jiǎn)化了 37.5%。(2)適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以300kg雞糞為例，3300升糞液經(jīng)連續(xù)篩分處理，60目、 200目和325目篩截留了比卵囊大的糞渣，而小于卵囊的糞渣和水均流過1250目篩，留存于1250目篩的截留物只有卵囊和與卵囊大小相同的雜質(zhì)，其總量約為糞液總量的2%，即 66升。以上述大容量離心機(jī)離心處理，1臺(tái)離心機(jī)需33次，若使用6臺(tái)離心機(jī)，則每臺(tái)機(jī)單班工作5. 5次。符合中型疫苗廠的設(shè)備匹配與崗位設(shè)置，若要擴(kuò)大產(chǎn)量，只需增加6臺(tái)離心機(jī)，即可達(dá)到年產(chǎn)5億羽以上五價(jià)球蟲疫苗，如生產(chǎn)三價(jià)疫苗則產(chǎn)量可達(dá)到7億羽以上。(3)糞樣處理中加少量胃蛋白酶(0.05mg/克糞便)，其作用在于破壞糞便中的腸組織、有機(jī)雜物，有利于篩分過濾，同時(shí)，也可解除卵囊之間及卵囊與雜物的粘連。(4)縮短了卵囊分離用時(shí)，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，節(jié)省分離時(shí)間50%以上。減少了離心次數(shù)，傳統(tǒng)分離技術(shù)在經(jīng)過200目篩過濾后，卵囊與水及大量糞樣雜質(zhì)混凝土在一起，必須經(jīng)過離心處理才能使卵囊與水分離，然后再進(jìn)行鹽水漂浮。而新技術(shù)省去了漂浮前的離心， 原因是直接完成了 3項(xiàng)分離①比卵囊大的雜物；②比卵囊小的雜物和③水。對(duì)于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)來講，如沿用傳統(tǒng)工藝，此工序的離心分離同樣需要大量多次的反復(fù)離心，是行不通的，新技術(shù)完全消除了原有技術(shù)的“瓶頸”。(5)大大減少了飽和鹽水的使用量，降低了成本。由于連續(xù)篩分機(jī)增加了 325目除雜，減少了漂浮物總量，可降低飽和鹽水的使用量約30%。(6)提高了卵囊的分離率，由于連續(xù)篩分機(jī)可產(chǎn)生三元運(yùn)動(dòng)，增加了過濾物與篩網(wǎng)的接觸，可更有效的濾過卵囊，使卵囊的分離率提高10%，最終可增加疫苗的產(chǎn)量10%。
具體實(shí)施例方式取感染雞新鮮糞便20kg，加水60升充分混勻，加入胃蛋白酶lOOOmg，混勻，靜置 IOmin ；之后再加入140升水，混勻成糞液；糞液總量約220升；啟動(dòng)連續(xù)篩分機(jī)，把糞液自加料口勻速(10-15升/分)加入，糞液加完后再加入水20升，同時(shí)保持篩分機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)， 以盡量洗下截留于第1、2、3層篩網(wǎng)的未過濾卵囊，之后取下第4層分篩，用水沖洗截留物成堆，收集至具刻度的容器內(nèi)備用；按截留物量加5倍(V V)飽和鹽水混勻漂浮，分裝于500ml離心管中，2500rpmX IOmin離心；吸出離心管表面的漂浮物加至少10倍水混勻， 2500rpmX IOmin離心；取沉淀物加足量水(加滿離心管)2500rpmX IOmin離心，沉淀物即為卵囊。
權(quán)利要求
1. 一種雞艾美耳球蟲卵囊批量制備方法，其特征在于本發(fā)明的方法為a、糞樣處理取感染雞新鮮糞便，加入其重量3倍的水稀釋混勻，加入胃蛋白酶充分混合后，靜置10分鐘后再加入7倍糞重量的水，混勻使成糞液，其中胃蛋白酶的加入量為 0. 05mg/克糞便；b、連續(xù)篩分處理糞液經(jīng)多層式振動(dòng)篩分過濾機(jī)處理，即從加料口勻速加入糞液，由第 1層至第4層連續(xù)分篩過濾，同時(shí)加水沖洗，后取下第4層篩網(wǎng)，用水將所有截留物洗出，至具刻度的容器中備用；多層式振動(dòng)篩分過濾機(jī)或稱多層式振動(dòng)篩分機(jī)，共設(shè)4層，第1層60目，第2層200 目，第3層325目，第4層1250目；C、飽和鹽水漂浮離心截留物加5倍體積的飽和鹽水充分混勻漂浮，2500rpmX IOmin 離心；d、卵囊離心沉淀吸出離心管表面的漂浮物加至少于其體積10倍水混勻， 2500rpmX IOmin 離心；e、卵囊凈化去上清液，加水至離心管充滿混勻，2500rpmXIOmin離心，沉淀物即為卵^ ο
全文摘要
一種雞艾美耳球蟲卵囊批量制備方法，涉及生產(chǎn)雞艾美耳球蟲疫苗的卵囊(抗原)的分離純化方法。本方法是通過糞樣處理、連續(xù)篩分處理、飽和鹽水漂浮離心、卵囊離心沉淀、卵囊凈化的工序來制備雞艾美耳球蟲卵囊的。使用本方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)雞艾美耳球蟲卵囊制備的產(chǎn)業(yè)化，提高生產(chǎn)效率，降低成本。
文檔編號(hào)C12N1/10GK102174408SQ20111002927
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者徐勇, 鄭潤寬, 郝文華 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古神元生物工程股份有限公司