專(zhuān)利名稱(chēng)：一種穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
亞心型扁藻(Platymonas subcordiformis)，又名亞心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)，是一種海洋單細(xì)胞綠藻，在分類(lèi)學(xué)上屬于綠藻門(mén)(Chlorophyta)，青綠藻綱(I^asinophyceae)，扁藻屬(Platymonas)。亞心型扁藻具有重要的應(yīng)用價(jià)值，是應(yīng)用于魚(yú)、對(duì)蝦、貝類(lèi)等養(yǎng)殖中的重要餌料微藻，其多糖含量非常高，具有抗腫瘤活性，還可作為油脂代謝調(diào)控的貯藏物質(zhì)來(lái)源。另外，亞心型扁藻還可進(jìn)行光合產(chǎn)氫，在解偶聯(lián)劑CCCP的誘導(dǎo)下，其產(chǎn)氫效率可達(dá)50士;3ml/l。在亞心型扁藻中建立遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可以為其遺傳改造提供有力的工具，工程藻株有望在構(gòu)建高效微藻反應(yīng)器(生產(chǎn)高值蛋白、油脂或氫氣)、開(kāi)發(fā)口服型漁藥等方面發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其核心是建立穩(wěn)定表達(dá)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)外源基因在基因組中的整合與穩(wěn)定表達(dá)。但現(xiàn)有技術(shù)僅僅實(shí)現(xiàn)了報(bào)告基因在亞心型扁藻當(dāng)代細(xì)胞中的瞬間表達(dá)，僅能證明基因槍法以及珠磨法可有效將外源基因?qū)爰?xì)胞，未廣泛驗(yàn)證啟動(dòng)子在扁藻中的通用性，特別是，缺乏對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株的篩選技術(shù)，因此尚無(wú)法獲得可穩(wěn)定傳代的工程藻株，這距離藻種改造的最終目標(biāo)有很大距離。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是內(nèi)科常見(jiàn)急癥，死亡率高。 近二十年來(lái)，溶栓劑的研究經(jīng)歷了三代產(chǎn)品的研發(fā)歷程。第一代溶栓藥物以鏈激酶和尿激酶為代表，主要特征是無(wú)纖維蛋白特異性，副作用大。第二代溶栓藥物以t-PA和阿替普酶 (alteplase)為代表，特征是有一定程度的纖維蛋白特異性，但半衰期較短，臨床應(yīng)用時(shí)需大劑量(50 IOOmg)連續(xù)滴注，價(jià)格也比較昂貴。為了克服野生型t-PA的缺點(diǎn)，世界各國(guó)的科研人員利用了分子設(shè)計(jì)、基因工程和蛋白質(zhì)工程等技術(shù)致力于第三代溶栓劑的開(kāi)發(fā)和研究，對(duì)人組織型纖溶酶原激活劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能研究，發(fā)現(xiàn)了大量的突變體。其中的瑞替普酶以其較長(zhǎng)的半衰期(16 20分鐘)、能夠更快速開(kāi)通冠狀動(dòng)脈、恢復(fù)血液循環(huán)的功能， 治愈率達(dá)到73-83%，成為新一代安全、有效的能夠替代鏈激酶，t-PA的溶解血栓藥物。瑞替普酶分子結(jié)構(gòu)中含有9對(duì)二硫鍵。含有二硫鍵的真核生物蛋白，通常在真核生物體系中表現(xiàn)出天然活性的結(jié)構(gòu)，而在原核生物體系中表達(dá)，常常因組蛋白分子內(nèi)及分子間的二硫鍵結(jié)構(gòu)錯(cuò)配，產(chǎn)生無(wú)活性的蛋白質(zhì)。目前瑞替普酶主要由大腸桿菌工程菌株非融合表達(dá)發(fā)酵生產(chǎn)，表達(dá)以包涵體的形式存在，然后要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的復(fù)性，分離純化流程。而這樣生產(chǎn)的瑞替普酶復(fù)性率低，下游工藝成本非常昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將功能性外源基因一瑞替普酶
3(rPA)重組于通用型啟動(dòng)子下游，然后插入含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化用的載體，通過(guò)基因槍法或玻璃珠研磨法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到亞心型扁藻細(xì)胞中，經(jīng)除草劑篩選，獲得轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻。此轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻能夠作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)瑞替普酶。其中所述通用型啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子；所述除草劑為草丁膦；所述選擇標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因；所述的瑞替普酶基因?yàn)閞PA基因。本發(fā)明方法成功構(gòu)建了亞心型扁藻的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)本發(fā)明能夠有效的將瑞替普酶重組到亞心型扁藻的基因組中，并通過(guò)篩選獲得轉(zhuǎn)基因突變?cè)逯?。與現(xiàn)有技術(shù)相比， 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了亞心型扁藻基因工程技術(shù)的重點(diǎn)突破，具有如下有益效果1、本發(fā)明在載體元件上，試驗(yàn)了動(dòng)物病毒來(lái)源的啟動(dòng)子SV40啟動(dòng)子和植物病毒來(lái)源的啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子在亞心型扁藻中的有效性，拓展了亞心型扁藻中可應(yīng)用啟動(dòng)子的范圍。2、在篩選標(biāo)記方面，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明亞心型扁藻對(duì)除草劑草丁膦非常敏感，采用一種可行的選擇標(biāo)記基因-選擇壓力組合(bar基因-草丁膦)是本發(fā)明的又一技術(shù)特
點(diǎn)ο3、本發(fā)明能將外源基因整合到亞心型扁藻基因組上，并能實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。4、本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻，可以用做生物反應(yīng)器，生產(chǎn)無(wú)需通過(guò)變性、復(fù)性等處理就具有生物活性的瑞替普酶。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的質(zhì)粒pSVbar物理圖譜。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻(轉(zhuǎn)bar基因)基因組PCR產(chǎn)物電泳圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻Southern雜交圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的質(zhì)粒CaMV35S-bar-nos/SV40_rPA物理圖譜。圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻(轉(zhuǎn)bar和rPA基因)基因組PCR 產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法及該方法所達(dá)到的效果作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 通過(guò)導(dǎo)入選擇標(biāo)記基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株的篩選采用含有草丁膦抗性基因(bar)的質(zhì)粒pSVbar (SV40啟動(dòng)子-bar_SV40終止子) (參見(jiàn)圖1)。用基因槍法和珠磨法分別導(dǎo)入亞心型扁藻細(xì)胞中，經(jīng)草丁膦篩選，獲得抗性藻落；在抗性單藻落中，檢測(cè)到bar基因已經(jīng)整合到基因組中。一、通過(guò)敏感性實(shí)驗(yàn)，確定選擇標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)化載體首先，將亞心型扁藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，藻細(xì)胞濃度約為5. 0 X IO5細(xì)胞每毫升。濃度測(cè)定方法是先將1 %碘液加入亞心型扁藻培養(yǎng)液中固定藻細(xì)胞并染色，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)三次取其平均值，作為結(jié)果，用于計(jì)算藻液濃度。藻液濃度=計(jì)數(shù)結(jié)果/觀察的中格數(shù)父25(或16)父104。
然后將四種抗生素卡那霉素、鏈霉素、壯觀霉素、氯霉素和除草劑草丁膦分別配成一定濃度的母液。在液體培養(yǎng)條件下，將藻液分裝到試管中(試管經(jīng)高壓滅菌處理)，每支試管5ml 藻液。最后將四種抗生素和除草劑分別加到藻液中。四種抗生素濃度梯度是200，400，800， 和1600 μ g ml—1 ；除草劑的濃度梯度是5，10，15，20，25，30 μ g ml—1。每種處理重復(fù)三次，并同時(shí)都設(shè)置對(duì)照組(對(duì)照組即為不添加抗生素或草丁膦且起始藻液濃度與處理組相同的藻液)。培養(yǎng)條件如下溫度23°C，光照強(qiáng)度4000勒克斯，每天光照時(shí)間12h，黑暗時(shí)間12h。 每M小時(shí)計(jì)數(shù)一次，共計(jì)數(shù)7次(即共培養(yǎng)7天)。四種抗生素即使在最高濃度1600 μ g πιΓ1也不能抑制亞心型扁藻的生長(zhǎng)；草丁膦在25、30 μ g πιΓ1濃度時(shí)可在7天內(nèi)完全殺死細(xì)胞。在固體培養(yǎng)條件下，每個(gè)處理組的固體培養(yǎng)基中抗生素或草丁膦的濃度梯度與液體培養(yǎng)條件下相同。每個(gè)固體培養(yǎng)板上涂布6. OX IO5藻細(xì)胞。每種處理重復(fù)三次，并同時(shí)都設(shè)置對(duì)照組(對(duì)照組即為不添加抗生素或草丁膦且起始藻量與處理組相同的固體平板)。 培養(yǎng)條件如下溫度23°C，光照強(qiáng)度4000勒克斯，每天光照時(shí)間12h，黑暗時(shí)間12h。共培養(yǎng)15天，觀察藻落的生長(zhǎng)情況。添加抗生素的固體平板上，藻落生長(zhǎng)情況(藻落的數(shù)量和大小)與對(duì)照組相似；添加草丁膦的固體平板上，藻落數(shù)量比對(duì)照組要少，草丁膦濃度20、 25,30 yg πιΓ1的固體平板上，沒(méi)有藻落長(zhǎng)出。根據(jù)亞心型扁藻對(duì)四種抗生素和除草劑草定膦的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定草丁膦作為亞心型扁藻遺傳轉(zhuǎn)化的篩選壓力。同時(shí)，選定草丁膦抗性基因bar基因作為亞心型扁藻遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因。因此，含有bar基因的質(zhì)粒pSVbar作為亞心型扁藻的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 (pSVbar的質(zhì)粒圖譜參見(jiàn)圖1所示)。二、用基因槍法將質(zhì)粒導(dǎo)入亞心型扁藻在轉(zhuǎn)化前l(fā)h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的亞心型扁藻藻液(濃度約為5. OX IO5ceIlmr1),離心力6000g離心5min，棄上清，用f/2培養(yǎng)液調(diào)整濃度到IXlO8Cellmr10然后取0. 2ml藻液涂在f/2固體培養(yǎng)平板的中央，呈直徑約3cm的圓形。涂好的平板置于超凈工作臺(tái)中備用。微粒子彈的制備取50 μ L金粉懸浮液(約含3mg金粉)邊渦旋邊加入5 μ L質(zhì)粒 (質(zhì)粒濃度>=Iyg μ Γ1), 50 μ L 2. 5Μ CaCl2, 20 μ L 0. IM 亞精胺。然后繼續(xù)渦旋!3min。 離心5-6seC，棄上清。然后用250 μ L無(wú)水乙醇洗兩次，最后用60 μ L無(wú)水乙醇重懸。這樣一管包被了質(zhì)粒的微粒子彈可用于5-6次轟擊。在無(wú)菌條件下(超凈工作臺(tái)中)，用高壓氦氣式基因槍進(jìn)行轟擊。轟擊后，藻細(xì)胞先在固體培養(yǎng)平板上黑暗條件下培養(yǎng)他，然后再轉(zhuǎn)到f/2培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)40h，使細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)得以恢復(fù)。三、用珠磨法將質(zhì)粒導(dǎo)入亞心型扁藻細(xì)胞珠磨法轉(zhuǎn)化前，需要先制備亞心型扁藻的原生質(zhì)體。亞心型扁藻的原生質(zhì)體制備的方法如下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的亞心型扁藻(濃度5. OX IO5ceIlmr1)，6000g離心5min，棄上清，用f/2培養(yǎng)液將藻細(xì)胞濃度調(diào)整到2X IO7Cell πιΓ1。取0. 5ml藻液與0. 5ml 2%的鮑魚(yú)酶酶解液混合，25°C震蕩QOOrpm mirT1)濁，去除細(xì)胞壁。酶解后的細(xì)胞立即進(jìn)行珠磨法轉(zhuǎn)化。將0. 5ml藻細(xì)胞(約含IO7個(gè)藻細(xì)胞)和300mg玻璃珠(產(chǎn)自Sigma公司，直徑425nm)，以及5 μ L質(zhì)粒(> =1 μ g)混合，渦旋震蕩 30seco然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到含有0. 5M甘露醇的f/2培養(yǎng)液(此溶液為亞心型扁藻原生質(zhì)體的等滲液)中，黑暗條件培養(yǎng)他，使細(xì)胞壁再生。然后再轉(zhuǎn)到f/2培養(yǎng)液中，培養(yǎng)40h，使細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)得以恢復(fù)。四、轉(zhuǎn)基因藻株的篩選經(jīng)過(guò)恢復(fù)培養(yǎng)的亞心型扁藻細(xì)胞，轉(zhuǎn)到選擇性培養(yǎng)液中，以殺死未轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞。 選擇性培養(yǎng)液即為含有15 μ g πιΓ1草丁膦的f/2培養(yǎng)液。15d后，對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，實(shí)驗(yàn)組仍有活的藻細(xì)胞。將培養(yǎng)液離心(6000g離心5min)，棄上清。收集到的藻體涂布到含有15μ g πιΓ1草丁膦的f/2固體培養(yǎng)平板上，使抗性的藻細(xì)胞分散生長(zhǎng)，得到抗性單藻落。 約培養(yǎng)20d后，平板上長(zhǎng)出單藻落。再將單藻落挑出，并劃線到含有5yg ml—1草丁膦的f/2 固體培養(yǎng)平板上，使抗性藻落進(jìn)一步純化并增強(qiáng)抗性。20d后，挑取單藻落至f/2培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)約20d，6000g離心5min，收集藻體(每個(gè)樣品的藻體濕重>=IOOmg)，然后置于液氮中冷凍備用。五、轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻藻株的鑒定提取轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻的基因組，用以進(jìn)行分子鑒定。首先用PCR方法來(lái)鑒定質(zhì)粒的整合情況。PCR中使用的上游引物為5 ’ -AGTCAGCAACCATAGTCC-3 ’ ；下游引物為 5，-CAGAAACCCACGTCATGC-3，。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?MV 5min 預(yù)變性；94°C lmin，55°C 40sec, 72°C 50sec，共30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin延伸。PCR產(chǎn)物是一段包括SV40啟動(dòng)子-bar的片段，約為700bp(參見(jiàn)圖2~)。在一部分抗性亞心型扁藻基因組中擴(kuò)增到了這個(gè)片段，在未轉(zhuǎn)化的亞心型扁藻中均未發(fā)現(xiàn)該片段。PCR有陽(yáng)性結(jié)果的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻樣品，要繼續(xù)進(jìn)行Southern雜交鑒定。每個(gè)樣品的基因組至少4 μ g。Southern雜交的探針是來(lái)源于質(zhì)粒pSVbar上bar基因內(nèi)部的一段序列。雜交結(jié)果顯示，一部分轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻的基因組，雜交后出現(xiàn)了一條約550bp的條帶，與質(zhì)粒酶切后的條帶大小一致，而未轉(zhuǎn)化的亞心型扁藻基因組沒(méi)有這個(gè)條帶(參見(jiàn)圖3)。這表明在一些轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻單藻落中，質(zhì)粒pSVbar已經(jīng)整合到其基因組中。實(shí)施例2 構(gòu)建重組表達(dá)瑞替普酶的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻采用含有片段CaMV35S啟動(dòng)子-bar選擇標(biāo)記基因-nos終止子-SV40啟動(dòng)子-His tag-rPA基因-SV40終止子的質(zhì)粒，用基因槍法和珠磨法轉(zhuǎn)化亞心型扁藻，經(jīng)草丁膦篩選， 在抗性單藻落中檢測(cè)到rPA基因的穩(wěn)定整合。一、構(gòu)建載體以載體CaMV35S-bar/SV40-HiS-rPA載體為出發(fā)質(zhì)粒，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體。首先，設(shè)計(jì)并合成如下引物Primer nos fwd GAAGATCTGATCGTTCAAACATTTGG(BrI II )Primer nos rev :CTAGATCTGATCTAGTAACATAGATGACACCG(Bgl II )以質(zhì)粒 pBI221 為模板，經(jīng)引物 Primer nos fwd 和 Primer nos rev 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min 預(yù)變性；94°C 20sec，56°C 15sec，72°C 20sec,共 30 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為230bp。經(jīng)膠回收(天根公司試劑盒)純化的PCR 產(chǎn)物用Bgl II酶切，與經(jīng)過(guò)同樣酶切的CaMV35S-bar/SV40-rPA載體連接，獲得重組質(zhì)粒 CaMV35S-bar-nos/SV40-rPA(參見(jiàn)圖 4)。
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其他步驟，包括基因槍轉(zhuǎn)化操作、珠磨法轉(zhuǎn)化操作、轉(zhuǎn)基因藻株的篩選和 Soutehern鑒定同實(shí)施例1。五、rPA基因的整合檢測(cè)在rPA基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物，并合成。引物序列如下Primer rPA for GTCTTACCAAGGAAACAGTGACPrimer rPA rev :TTATCACGGTCGCATGTTGT以轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻的基因組為模板，經(jīng)引物I^rimer rPA for和I^rimerrPA rev 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?4°C IOmin 預(yù)變性；94°C lmin,56°C 50sec，72°C 70sec，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為llOObp。(參見(jiàn)圖5)說(shuō)明瑞替普酶基因已經(jīng)整合到亞心型扁藻基因組中。六、轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻的培養(yǎng)將進(jìn)過(guò)檢測(cè)為陽(yáng)性的亞心型扁藻進(jìn)行繼代培養(yǎng)。首先，部分轉(zhuǎn)基因藻株涂布在含有草丁膦的固體f/2平板上篩選培養(yǎng)，用來(lái)保種。其余部分藻夜，用液體f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后然后轉(zhuǎn)到2. 5L鼓泡式生物反應(yīng)器中，迅速擴(kuò)增培養(yǎng)。然后收集藻液，用來(lái)提取瑞替普酶。七、轉(zhuǎn)基因瑞替普酶的活性檢測(cè)離心收集上述反應(yīng)器培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻和野生型亞心型扁藻。采用凍融法破壁以后，加入0. Iml的PBS和適量石英砂，冰浴快速研磨lmin，而后12000rpm離心lOmin， 上清液為總蛋白液。采用體外纖維蛋白平板溶圈法來(lái)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物瑞替普酶的生物學(xué)活性。首先制備纖維蛋白平板，其中實(shí)驗(yàn)試劑纖溶酶原激活劑活性測(cè)定套裝購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，包括纖維蛋白原(F)，凝血酶(T)以及纖維蛋白溶酶原(P)尿激酶(U)，配置方法如下1)分別用適量PBS溶解安瓶中的F，T，P和U ；2)稱(chēng)取0. 25g瓊脂糖投入盛有30ml PBS的三角瓶中煮沸融化，用試管取約15ml 融化的瓊脂糖溶液，兩者共同在50-60°C水浴中平衡IOmin ；3)在三角瓶中加入125 μ 1的Τ，混勻；4)在試管中加入750 μ 1的F ；5)分別混勻后，將試管中的溶液到入三角瓶迅速輕輕搖動(dòng)混勻，盡量避免氣泡產(chǎn)生；6)迅速倒平板；7)冷卻lOmin，待瓊脂糖凝固。置于80°C烘箱30分鐘，使F中殘留的P失活(本實(shí)驗(yàn)采用后加入P的方法，來(lái)提高靈敏性)；8)冷卻至室溫打孔備用。然后每孔中加入30 μ 1的蛋白液，內(nèi)含0. 002IU的PG。24h后溶圈情況為轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻蛋白液能夠產(chǎn)生溶圈，野生型亞心型扁藻、空白對(duì)照(PBS)和系統(tǒng)空白(未加樣品)組均未產(chǎn)生溶圈。該結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻中重組表達(dá)的瑞替普酶具有生物學(xué)活性。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用，其特征在于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)瑞替普酶 (rPA)的亞心型扁藻用于生產(chǎn)溶栓藥瑞替普酶。
2.按權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用，其特征在于所述構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)瑞替普酶(rPA)的亞心型扁藻為將功能性外源基因一瑞替普酶(rPA)基因重組于通用型啟動(dòng)子下游，然后插入含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化用的載體，通過(guò)基因槍法或玻璃珠研磨法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到亞心型扁藻細(xì)胞中，經(jīng)除草劑篩選，獲得轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻。
3.按權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用，其特征在于所述通用型啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子。
4.按權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用，其特征在于選擇標(biāo)記基因?yàn)椴荻§⒖剐曰騜ar基因。
5.按權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用，其特征在于轉(zhuǎn)化后的亞心型扁藻用除草劑草丁膦進(jìn)行篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種穩(wěn)定表達(dá)功能基因的亞心型扁藻的應(yīng)用，即構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)瑞替普酶(rPA)的亞心型扁藻用于生產(chǎn)溶栓藥瑞替普酶。采用本發(fā)明的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)外源基因在亞心型扁藻中的穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)其藻種的品種改良以及基因工程產(chǎn)品開(kāi)發(fā)都具有重要意義。同時(shí)本發(fā)明生產(chǎn)的重組表達(dá)瑞替普酶的轉(zhuǎn)基因亞心型扁藻能夠作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)瑞替普酶。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102181417SQ20111002842
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月23日
發(fā)明者姜鵬, 崔玉琳, 李富超, 秦松, 陳華新, 陳英杰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所