專利名稱：一種仿刺參AjE101微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及海洋經(jīng)濟(jì)種仿刺參 (Apostichopus japonicus)的EST (Express Sequence Tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)微衛(wèi)星標(biāo)記 篩選開發(fā)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
仿刺參為刺參科仿刺參屬的動物，俗名刺參。分布于北太平洋區(qū)、包括俄羅斯、日 本、朝鮮半島沿岸以及中國，常見于波流靜穩(wěn)、海草繁茂和無淡水注入的港灣內(nèi)底質(zhì)為巖礁 或硬底。仿刺參是食用海參中品質(zhì)最好，分布最廣，產(chǎn)量最大的一種。在我國，仿刺參養(yǎng)殖 業(yè)主要分布于遼寧、河北、山東、江蘇等地等沿海地區(qū)。目前，仿刺參的研究大多是關(guān)于仿 刺參常規(guī)育種、增養(yǎng)殖等領(lǐng)域，關(guān)于分子標(biāo)記方面的研究比較少。開發(fā)遺傳標(biāo)記并用于遺 傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性等方面的研究無疑是解決仿刺參養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)問題 的一個有效途徑之一。隨著仿刺參在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究工作不斷深入，對仿刺參分子標(biāo)記的需求也 越來越多。遺傳改良或品種培育是仿刺參養(yǎng)殖穩(wěn)定發(fā)展的動力，許多研究表明，遺傳變異水 平與生物的生長速度、抗病能力等生產(chǎn)性狀密切相關(guān)，因此，開發(fā)仿刺參的分子遺傳標(biāo)記， 檢測仿刺參遺傳多樣性、研究其遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)施分子標(biāo)記輔助選育，對于仿刺參的育種 和增養(yǎng)殖都具有十分重要的意義。EST是指通過從cDNA文庫中隨機(jī)挑取的克隆，進(jìn)行大規(guī)模測序所獲得的cDNA的 5’或3’端序列，長度一般為150-500 bp。近年來大量快速增長的EST數(shù)據(jù)已成為SSR的重 要來源，約有- 5%的EST含有SSR。與gSSR (基因組微衛(wèi)星)標(biāo)記相比，從EST序列中 中獲得EST-SSR標(biāo)記更經(jīng)濟(jì)，更有特點(diǎn)；由于EST是功能基因的表達(dá)片段，在其中發(fā)現(xiàn)的微 衛(wèi)星標(biāo)記會直接和功能基因相關(guān)，并有可能和一些生產(chǎn)性狀相關(guān)聯(lián)，這些特點(diǎn)對遺傳圖譜 構(gòu)建以及標(biāo)記輔助選育都有很高的應(yīng)用價值；同時，由于不同物種間基因共顯性和保守性， 從一種物種中開發(fā)的EST-SSR可能同時用于近緣的其他物種研究，從而為比較基因組學(xué)、 同源基因克隆提供新的途徑。因此，EST-SSR已被用于構(gòu)建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、 基因表達(dá)差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記，可能把 仿刺參重要經(jīng)濟(jì)性狀與之關(guān)聯(lián)起來，達(dá)到分子標(biāo)記輔助育種的目的，并可進(jìn)一步進(jìn)行仿刺 參功能基因的研究。目前關(guān)于仿刺參EST微衛(wèi)星標(biāo)記的研究還很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了簡便快速的鑒定仿刺參AjElOl遺傳標(biāo)記基因座位的遺傳變 異圖譜，豐富現(xiàn)有的仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記，尋找更多的多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的微衛(wèi)星標(biāo)記，提 供了一種仿刺參AjElOl微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法。本發(fā)明是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的
一種仿刺參AjElOl微衛(wèi)星特異性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分別如SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO 2 所示。一種利用仿刺參AjElOl微衛(wèi)星特異性DNA引物的PCR反應(yīng)體系，其特征在于所 述的 PCR 體系為10XPCR 緩沖液2. Ομ ;10mM 的 SEQ ID N0:1 禾Π SEQ ID NO :2 引物對 各:0. 2-0. 5 μ 1 ； IOmM dNTP :0. 4-5 μ 1 ；ddH20 :14. 6-15. 9 μ 1 ；5U/y 1 Taq酶:0. 2-0. 3 μ 1 ； IOng 仿刺參 DNA :1-1. 5 μ 1。一種仿刺參AjElOl微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，其特征在于包括以下步驟先 提取仿刺參基因組并稀釋備用，再利用仿刺參AjElOl微衛(wèi)星DNA核心序列(AT) η其中 η=22-24，在其序列兩端設(shè)計特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1_2所示；然后使用 該引物對仿刺參不同群體或者群體內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變 性聚丙烯酰胺凝膠檢測。利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶銀染顯色后進(jìn)行分析，確定每個個體的基因 型，從而獲得仿刺參在AjElOl遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性遺傳變異圖譜(如圖1所示)。AjElOl微衛(wèi)星DNA序列的特異性引物核苷酸序列分別為正鏈SEQ ID NO 1 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，負(fù)鏈 SEQ ID NO 2 5，-ATGACAAGAAACGGGAGA-3，，退火溫度 為 49-55 0C ο其PCR反應(yīng)加樣參數(shù)正反向引物各為0. 2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 1.5-2.5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足到20ul ；使用該引物 的時設(shè)置PCR程序參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘；然后94°C變性30-40秒，45°C _60°C退火30 秒，72°C延伸30秒-1分鐘，重復(fù)此反應(yīng)35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物的檢測基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電 泳，利用長度差異為50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker (上海生工)作為分子量標(biāo)記， 擴(kuò)增產(chǎn)物用6%-8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳統(tǒng)進(jìn)行檢測，電壓是8V/cm PCR產(chǎn)物中加上變 性Buffer之后95°C變性5分鐘，之后立刻置于冰上降溫，使用微量進(jìn)樣器上樣5ul，85 W 恒功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，約120分鐘，電泳完畢之后用EB(終濃度是0. 5μ g/ ml)染色30分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)果，分析多態(tài)性，確定各個個體的基因 型，并進(jìn)一步得到AjElOl遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性圖譜。本發(fā)明適用于仿刺參種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，家系鑒定，分子群體遺傳學(xué)，遺 傳圖譜的構(gòu)建，重要經(jīng)濟(jì)性狀的定位，功能基因的研究，進(jìn)一步用于輔助仿刺參分子遺傳育 種和養(yǎng)殖?，F(xiàn)有的仿刺參微衛(wèi)星標(biāo)記還不夠豐富，建立仿刺參遺傳連鎖圖譜，物理圖譜，以及 QTL定位需要更多的多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的微衛(wèi)星標(biāo)記。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下 優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明可以簡便快速的鑒定仿刺參AjElOl微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記基因座位的遺傳變異 圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀的檢測出仿刺參每個個體的基因型。(2)本發(fā)明的核心是AjElOl微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的特異性引物，其核苷酸序列為正 鏈 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，負(fù)鏈 5，-ATGACAAGAAACGGGAGA-3，，退火溫度為 49°C，可在 仿刺參總?cè)簷z測中呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性。(3)本發(fā)明主要應(yīng)用于仿刺參種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，家系鑒定，分子群體遺 傳學(xué)，遺傳圖譜的構(gòu)建，重要經(jīng)濟(jì)性狀的定位，功能基因的研究。


圖1本發(fā)明的AjElOl微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在M尾仿刺參個體中的基因型圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1. 提取仿刺參的DNA
本實(shí)驗(yàn)所取的仿刺參材料是隨機(jī)提取M個DNA樣品，從冷凍的肌肉組織中提取DNA。剪 取IOOmg肌肉組織，剪碎后置于0. 7 ml的抽提緩沖液(6 M toea (尿素)，10 mM Tris-HCI. 125 mM NaCI (氯化鈉)，1% SDS (十二烷基肌硫酸鈉)，10 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，pH=7. 5) 中，加入終濃度為0.1 mg/ml的蛋白酶K (20 mg/ml)，37°C消化一夜。用苯酚氯仿(1 1)抽提反應(yīng)物三次，提取上清液用等體積的氯仿抽提一次。取上清液用異丙醇進(jìn)行沉淀， 然后溶解于 500 1 μ IXTE (10 mM Tris. HCI, 1 mM EDTA, pH =8.0)中。用 RNase (20 μ g/ml) 37°C處理DNA樣品1小時，然后用苯酚/氯仿提取液進(jìn)行DNA純化用苯酚/氯仿抽 提一次、氯仿抽提一次。然后提取上清液加入兩倍體積的無水乙醇和十分之一倍體積的3M NaAc (醋酸鈉)，搖勻之后12000rpm離心收集DNA，再用70%乙醇洗滌兩次，待乙醇完全 蒸發(fā)之后，加入50 μ 1 IXTE于一 20°C保存待用。2. PCR 擴(kuò)增
PCR的反應(yīng)條件是50ng仿刺參基因組DNA，引物SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2各 1μ M、0. 2mMdNTP、lXPCR buffer、1. 5mM 的 Mg2 +、0· 5UTaq 酶。PCR 的反應(yīng)程序是 94°C變 性10分鐘之后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30秒，Tm50°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，反應(yīng)進(jìn)行35 個循環(huán)。4°C保存PCR產(chǎn)物。3. 電泳檢測
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓是8V/cm，電泳完畢之后用EB (終濃 度是0. 5 μ g/ml)染色30分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)果(如圖1所示)。該試驗(yàn)結(jié)果說明AjElOl是一個多態(tài)性豐富的標(biāo)記可以用于群體遺傳學(xué)的分析， 并且特異性很好。實(shí)施例2
微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選及其多態(tài)標(biāo)記的確定 1. 微衛(wèi)星位點(diǎn)的來源和微衛(wèi)星序列的篩選
從NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)數(shù)據(jù)庫搜集并下載(以FASTA格式)已有的 EST序列，利用SSmumter軟件逐一查找分析所得的5736個序列，對2 — 6個堿基重復(fù)單 元、重復(fù)次數(shù)大于5的微衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行分離。采用軟件DNAstar中的kqMan對含有微 衛(wèi)星的ESTs進(jìn)行聚類分析，選取聚類在不同contig中的ESTs設(shè)計引物。2. 微衛(wèi)星標(biāo)記引物的設(shè)計
在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用引物設(shè)計軟件I^rimer Premier 5. 0和DNAstar中的 Primerselect設(shè)計引物；引物要求滿足以下條件(1)引物長度為17 — 25bp ;(2)GC含量 要求大于40%; (3)退火溫度大于40°C; (4)預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為100 — 300bp。設(shè)計的 引物為正鏈 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，負(fù)鏈 5' -ATGACAAGAAACGGGAGA-3，。3. 引物的優(yōu)化對AjElOl Tm值進(jìn)行優(yōu)化(50°C)。擴(kuò)增反應(yīng)分別用MJ-100 PCR儀，PCR程序?yàn)?4°C 變性2分鐘之后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30或者40秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒到1分 鐘不等，反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μ 1 其中含有正反向引物0.2 μ M、0. 2mMdNTP (四種脫氧核苷酸的混合物)、1 XPCR buffer、1.5 mM的Mg2 +、0. 6UTaq酶，模板量分別是 50ng。模板是隨機(jī)的5個仿刺參樣本。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳一銀 染檢測，選取無或雜帶少、特異性產(chǎn)物較高的PCR對應(yīng)的溫度作為最佳的退火溫度，對應(yīng)的 最佳Mg2+的濃度是2. OmM。10XPCR buffer 含有 100 mM Tris-HCL (三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸 pH9. 0)，500 mM KCL (氯化鉀 ρΗ9· 0)，1% Triton X-100 (曲拉通 X-100)
4. 微衛(wèi)星位點(diǎn)的確定
AjElOl用50°C和Mg2+ 2. OmM選取20個個體檢測這些微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性。PCR的反 應(yīng)程序是94°C變性10分鐘之后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒， 反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μ 1 其中含有正反向引物0. 2 μ Μ、0· 2mMdNTP、1 XPCR buffer、1. 5mM的Mg2 +、Taq酶，模板量分別是lOOng。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺電 泳，電壓是1 一 8V/cm，電泳完畢之后用EB (溴化乙錠，終濃度0. 5 μ g/ml)染色30分鐘， 然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)果，分析確定多態(tài)性，最后篩選出1個位點(diǎn)作為仿 刺參微衛(wèi)星標(biāo)記，標(biāo)記的具體信息如表一。表一.開發(fā)獲得的1個仿刺參(Apostichopus japonicus)的EST-SSR標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種仿刺參AjElOl微衛(wèi)星特異性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分別如SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 2 所示。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述DNA引物的PCR反應(yīng)體系，其特征在于所述的PCR體系 為10 XPCR 緩沖液2. Ομ ； IOmM 的 SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 引物對各0. 2-0. 5μ1 ； IOmM dNTP :0. 4_5μ1 ；ddH20 :14. 6-15. 9μ1 ；5υ/μ1 Taq 酶0. 2-0. 3μ1 ；IOng 仿刺參 DNA 1-1. 5μ1。
3.一種仿刺參AjElOl微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，其特征在于包括以下步驟先 提取仿刺參基因組并稀釋備用，再利用仿刺參AjElOl微衛(wèi)星DNA核心序列(AT) η其中 η=22-24，在其序列兩端設(shè)計特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1_2所示；然后使用 該引物對仿刺參不同群體或者群體內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變 性聚丙烯酰胺凝膠檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于其PCR反應(yīng)加樣參數(shù)為正反向引物SEQ ID NO :1-2各為0.2 uM, 0. 2 mM dNTP, IXPCR 緩沖液，1. 5-2. 5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶， 50-100 ng DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足到20ul ；使用該引物的時設(shè)置PCR程序參數(shù)為94°C預(yù) 變性2分鐘；然后94°C變性30-40秒，45°C -60°C退火30秒，72°C延伸30秒-1分鐘，重復(fù) 此反應(yīng)35個循環(huán)。
5.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于對PCR產(chǎn)物的檢測基因組DNA模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物在69Γ8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，干燥后在掃描保存圖片，分析多態(tài)性， 得到各個個體的基因型，并進(jìn)一步確定AjElOl遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性遺傳變異圖譜。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于在PCR產(chǎn)物的檢測中利用長度差異為50 bp的DNA梯型及PBR322標(biāo)記作為電泳的分子量標(biāo)記；電泳的電壓為1 一 8V/cm。
7.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳-銀染系統(tǒng)進(jìn)行檢測PCR產(chǎn)物中加上變性緩沖液之后95°C變性5分鐘，之后立刻置于 冰上降溫，使用微量進(jìn)樣器上樣5ul，85 W恒功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，120分鐘 后，用終濃度0. 5μ g/ml的溴化乙錠染色30分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及仿刺參的EST微衛(wèi)星標(biāo)記篩選開發(fā)和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種仿刺參AjE101微衛(wèi)星特異性DNA引物，一種利用上述引物的PCR反應(yīng)體系以及一種仿刺參AjE101微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，包括先提取凡納濱對蝦基因組并稀釋備用，再利用仿刺參AjE101微衛(wèi)星DNA核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物，然后使用該引物對凡納濱對蝦不同群體或者群體內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物進(jìn)行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得仿刺參多態(tài)性遺傳變異圖譜。本發(fā)明主要應(yīng)用于仿刺參種質(zhì)資源和遺傳多樣性分析，分子群體遺傳學(xué)，遺傳圖譜的構(gòu)建，功能基因的研究。
文檔編號C12Q1/68GK102140522SQ20111002833
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者任春華, 夏建軍, 王艷紅, 胡超群 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所