專利名稱：一種土鱉蟲藥材及活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥復(fù)方制劑鑒定領(lǐng)域，涉及一種土鱉蟲藥材及活血止痛膠囊中土鱉 蟲的分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
目前市售的中成藥中，有許多含有中藥粉末原料。由于粉末類中藥的組成成分復(fù) 雜，干擾因素多，用粉末鑒別和化學(xué)分析，有些中藥極難檢出。近年來超微粉碎制成的中藥 制劑，由于破壞了細(xì)胞組織的特征，增加了檢驗(yàn)的難度，傳統(tǒng)鑒別技術(shù)更是束手無策，不利 于中藥鑒別和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。而傳統(tǒng)劑型如散劑、丸劑及現(xiàn)代劑型袋泡茶、片劑、膠囊等中成 藥仍含部分或微量生藥，由于中成藥的組成及成分復(fù)雜性，干擾因素多，用傳統(tǒng)生藥學(xué)方法 鑒定上述含生藥中藥制劑或鑒定全原生藥制劑的真?zhèn)渭凹兌却嬗休^大的難度。活血止痛膠囊是活血止痛散改劑型的原國家四類新藥，該處方最早見報(bào)道于《趙 炳南臨床經(jīng)驗(yàn)集》，是當(dāng)代中醫(yī)學(xué)治療跌打損傷、瘀血腫痛的經(jīng)典方劑之一。其處方由當(dāng)歸、 土鱉蟲、自然銅(煅)、三七、乳香(醋)、冰片6味藥組成。土鱉蟲，又名地鱉蟲、土元等，在 我國有悠久的藥用歷史。土鱉蟲含多種氨基酸，揮發(fā)油，脂肪醛和芳香醛，生物堿，谷甾 醇，鯊肝醇，尿嘧啶和尿囊素，尚含多種微量元素。方中土鱉蟲為臣藥，現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用顯 微鑒定的方法鑒定其剛毛。該方法的鑒定標(biāo)識在生物學(xué)上為物種的遺傳表現(xiàn)型，不僅受到 遺傳因素的影響，而且與生物體的生長發(fā)育階段、環(huán)境條件等有著密切的關(guān)系，具有很大的 變異性和可塑性，且受鑒定者主觀判斷影響較大，在復(fù)方藥味復(fù)雜、藥材顯微形態(tài)多被破壞 的情況下，顯微鑒定多受限制。因此，需要探索一種更客觀的檢測方法。中藥分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，為中成藥鑒定提供了一種新的方法。DNA分子作為遺傳 信息的直接載體，不受外界因素、生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，每個(gè)個(gè)體的任一 體細(xì)胞均含有相同的遺傳信息，因此，用分子生物學(xué)遺傳標(biāo)記對中藥材進(jìn)行鑒別更為準(zhǔn)確 可靠。目前隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)已成功應(yīng)用于多種中藥鑒定中。發(fā)明人也曾嘗試采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)技術(shù)對活血止痛膠囊中的土鱉蟲進(jìn) 行鑒定，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于不同廠家、不同批號的活血止痛膠囊，無法獲得與其對應(yīng)的缺土鱉 蟲的陰性對照品，因?yàn)椴煌a(chǎn)地的同種藥材基因組各有差異，表現(xiàn)在RAPD圖譜中為擴(kuò)增條 帶的區(qū)別，難以獲得土鱉蟲的特有條帶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種土鱉蟲藥材的分子鑒定方法。本發(fā)明的另一目的是提供活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種土鱉蟲藥材的分子鑒定方法，包括(1) 土鱉蟲藥材中基因組DNA的提取純化 步驟；(2) PCR擴(kuò)增土鱉蟲16S rRNA步驟；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定和/或測序鑒定步驟；其中(1) 土鱉蟲藥材中基因組DNA的提取純化步驟采用改良蛋白酶K結(jié)合吸附柱法 先利用傳統(tǒng)的蛋白酶K法初步提取土鱉蟲藥材中基因組DNA，然后加等體積的飽和酚三 氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積的三氯甲烷異戊醇抽 提，所得上清轉(zhuǎn)移至膠回收試劑盒的吸附柱中按照傳統(tǒng)的吸附柱法純化DNA ；(2)所述的PCR擴(kuò)增土鱉蟲16S rRNA步驟是利用引物16Sra =SEQ ID NO. 1和 16Srb =SEQID NO. 2對步驟(1)提取純化的土鱉蟲藥材中基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；(3)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定步驟是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 如果能擴(kuò)增出420bp左右的條帶則表示土鱉蟲藥材含有土鱉蟲成分；或者對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行測序鑒定，通過序列比對，鑒定土鱉蟲藥材的真?zhèn)?、土鱉蟲的種類或產(chǎn)地。所述的土鱉蟲藥材中基因組DNA的提取純化具體步驟為取粉碎至80目目的土鱉 蟲藥材粉末加勻漿緩沖液，50 60°C水浴4 他，水浴結(jié)束后，冷至室溫，加等體積的體積 比為25 M 1的飽和酚三氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加 等體積的體積比為M 1的三氯甲烷異戊醇抽提一次，上清轉(zhuǎn)移至常規(guī)膠回收試劑盒的 吸附柱中，按照說明書記載的方法獲得純化的土鱉蟲藥材基因組DNA溶液。所述的勻漿緩沖液組成由8份A液，1份B液，1份C液組成，其中A液pH8. 0的 Tris 0. 05mol 'T1jNaCl 0. Imol · ΛρΗ8· 0 的 EDTA 0. Imol .171 ；B 液5% SDS ；C 液:2mg/ mL蛋白酶K。所述的PCR 擴(kuò)增體系為總體積 25 μ L, 10mmol/L dNTPs 2 μ L, IOXTaq buffer 2. 5 μ L，Taq酶0. 6U, 5 μ mol/L引物16Sra和16Srb各1 μ L，步驟(1)提取純化的土鱉蟲藥 材基因組DNA溶液1 μ L，雙蒸水補(bǔ)足體積至25 μ L，最后加10 μ L礦物油；反應(yīng)程序?yàn)?4°C 預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 50°C復(fù)性lmin, 72°C延伸90s, 35個(gè)循環(huán)后再72°C延伸IOmin0土鱉蟲藥材是經(jīng)以95%乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干。一種活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法，包括(1)活血止痛膠囊中土鱉蟲基 因組DNA的提取純化步驟；(2) PCR擴(kuò)增土鱉蟲16S rRNA步驟；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定和/ 或測序鑒定步驟；其中(1)所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA的提取步驟采用改良蛋白酶K結(jié)合 吸附柱法先利用傳統(tǒng)的蛋白酶K法初步提取活血止痛膠囊基因組DNA，然后加等體積的飽 和酚三氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積的三氯甲烷異 戊醇抽提，所得上清轉(zhuǎn)移至膠回收試劑盒的吸附柱中按照傳統(tǒng)的吸附柱法純化DNA ；(2)所述的PCR擴(kuò)增土鱉蟲16S rRNA步驟是利用引物16Sra =SEQ ID NO. 1和 16Srb =SEQID NO. 2對步驟(1)提取純化的活血止痛膠囊基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；(3)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定步驟是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 如果能擴(kuò)增出420bp左右的條帶則表示活血止痛膠囊中含有土鱉蟲組分。所述的活血止痛膠囊制備方法見中國藥典2005版第一部，其中的土鱉蟲是經(jīng) 95%乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干后入藥。DNA質(zhì)量優(yōu)劣是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，發(fā) 明人曾提取市售三個(gè)廠家的活血止痛膠囊基因組DNA，結(jié)果均不能獲得完整的高質(zhì)量DNA， 無法進(jìn)行下一步擴(kuò)增。目前市售的活血止痛膠囊中所用土鱉蟲多為熱水燙死后曬干或烘 干處理，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)該法處理后土鱉蟲放置半年DNA已嚴(yán)重降解，無法進(jìn)行后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明中所述的活血止痛膠囊中的土鱉蟲是經(jīng)95%乙醇處理放置半年后入藥，實(shí)驗(yàn) 顯示，本發(fā)明中所述的活血止痛膠囊基因組DNA保存完整，無降解，可以滿足分子實(shí)驗(yàn)的要 求。所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA的提取具體步驟為取活血止痛膠囊內(nèi) 容物加勻漿緩沖液，50 60°C水浴4 6h，水浴結(jié)束后，冷至室溫，加等體積的體積比為 25 24 1的飽和酚三氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積 的體積比為24 1的三氯甲烷異戊醇抽提一次，上清轉(zhuǎn)移至常規(guī)膠回收試劑盒的吸附柱 中，按照說明書記載的方法獲得純化的活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA溶液。所述的勻漿緩沖液組成由8份A液，1份B液，1份C液組成，其中A液pH8. 0的 TrisO. 05mol · Λ NaCl 0. Imol · Λ ρΗ8. 0 的 EDTAO. Imol · L-1 ；B 液5% SDS ；C 液2mg/ mL蛋白酶K。發(fā)明人曾考察采用傳統(tǒng)蛋白酶K法[1]、蛋白酶K[1]結(jié)合吸附柱法[2]與改良蛋白酶 K結(jié)合吸附柱法提取活血止痛膠囊基因組DNA，結(jié)果表明，傳統(tǒng)蛋白酶K法可以提取土鱉蟲 單味藥材中的基因組DNA，但對活血止痛膠囊基因組DNA提取不成功；蛋白酶K結(jié)合吸附柱 法為采用蛋白酶K勻漿緩沖液釋放核酸后直接用吸附柱對DNA純化，未抽提蛋白，結(jié)果無法 提取出DNA，電泳檢測沒有DNA條帶；采用本發(fā)明改良蛋白酶K結(jié)合吸附柱法可獲得清晰明 亮的DNA條帶(圖5)。所述的PCR 擴(kuò)增體系為總體積 25 μ L, 10mmol/L dNTPs 2 μ L, IOXTaq buffer (含 Mg2+) 2· 5 μ L，Taq 酶 0. 6U,5ymol/L 引物 16Sra 和 16Srb 各 1 μ L，步驟(1)提取 純化的活血止痛膠囊基因組DNA溶液1 μ L，雙蒸水補(bǔ)足25 μ L，最后加10 μ L礦物油；反應(yīng) 程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸90s，35個(gè)循環(huán)后再72°C 延伸lOmin。有益效果(1)本發(fā)明自創(chuàng)的改良蛋白酶K結(jié)合吸附柱法能夠從活血止痛膠囊中提取出完整 性好，純度高的土鱉蟲基因組DNA，有利于后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)而傳統(tǒng)的蛋白酶K法提取活血止 痛膠囊基因組DNA，所得DNA片段降解嚴(yán)重，且為褐色凍膠狀，含有大量的多糖等雜質(zhì)，無法 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用多種方法去除雜質(zhì)，效果不佳。采用本實(shí)驗(yàn)所創(chuàng)方法，除雜效果好， DNA提取完整性好，純度高，易于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)本發(fā)明通過檢測土鱉蟲16SrRNA進(jìn)行活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定，本 方法能微量、快速、準(zhǔn)確地鑒別活血止痛膠囊中的土鱉蟲成分，具有專屬性強(qiáng)、特異性高、靈 敏度高的優(yōu)點(diǎn)，更好地解決粉末中藥(中成藥)鑒定的技術(shù)難題，以確保中成藥質(zhì)量，防止 摻偽與摻假。C3) RAPD技術(shù)受許多因素影響，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性差。RAPD對反應(yīng)條件相當(dāng)敏 感，包括模板的質(zhì)量與濃度、Mg2+濃度，短的引物序列，儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等均可能造成 實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。且對于不同廠家、不同批號的活血止痛膠囊，無法獲得與其對應(yīng)的缺土 鱉蟲的陰性對照品，因?yàn)椴煌a(chǎn)地的同種藥材基因組各有差異，導(dǎo)致無法做出其標(biāo)準(zhǔn)的遺 傳圖譜，難以確定土鱉蟲的特有遺傳標(biāo)記?；?6SrRNA測序技術(shù)的土鱉蟲分子鑒定方法， 在昆蟲進(jìn)化及分類學(xué)中應(yīng)用較多。由于土鱉蟲隸屬于昆蟲綱鱉蠊科地鱉屬，應(yīng)用16SrRNA 測序技術(shù)，可以獲得其16SrRNA序列，由其序列可得知其種屬，因此，利用16SrRNA進(jìn)行鑒定具有專屬性，且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好。(4) 土鱉蟲的傳統(tǒng)鑒定方法有性狀鑒定、顯微鑒定和薄層色譜鑒定，這些方法雖然 簡便、快速，但對破碎藥材、粉末藥材的鑒定有一定的局限性?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中 藥材(不含礦物藥)物種的多樣性是由于其基因多態(tài)性的結(jié)果，而基因多態(tài)性可在分子水 平上檢測，它比在形態(tài)、組織和化學(xué)水平上檢測更能代表其變異類型的遺傳標(biāo)記。由于DNA 分子標(biāo)記直接分析的是生物的基因型而非表現(xiàn)型，鑒別結(jié)果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)(原 品、粉狀或片狀)和材料來源的影響，因此可為中藥品種鑒別提供更加準(zhǔn)確可靠的手段。采 用分子生物學(xué)方法對土鱉蟲16SrRNA進(jìn)行鑒定，可以直觀清楚的由其序列得出所需鑒定的 土鱉蟲種類。如若構(gòu)建出土鱉蟲的各個(gè)產(chǎn)地的序列圖譜，則可以根據(jù)鑒定的樣本16SrRNA 序列得出其產(chǎn)地。(5)現(xiàn)有的土鱉蟲處理方法如下1、凈制法取原藥材，揀去雜質(zhì)，用清水洗凈或篩去灰屑，干燥即得。2、烘焙法置沸水中燙死，除去雜質(zhì)，曬干或烘干。(中國藥典)或取凈土鱉蟲在鐵篩或新瓦上慢火焙至干脆，研粉即可。3、酒制法3. 1取凈土鱉蟲，用白酒浸洗潔凈，置炒鍋內(nèi)按清炒法用文火微炒至焦脆，取出，篩 去脫落的頭皮及灰屑，達(dá)到潔凈無污染，即得。每土鱉蟲100kg，用白酒10kg。3. 2取土鱉蟲，用酒洗凈，文火焙干。如系活土鱉蟲，置沸水中燙死，或用酒燜死，取 出，文火焙干。4、鹽水燙制法用50%鹽開水燙，快速翻動數(shù)次，讓鹽水充分吸收，燙后不宜曝 曬，最好放于陰涼通風(fēng)處陰干。5、酥油制法取酥油，置鍋內(nèi)，用文火加熱化開，將凈土鱉蟲倒入，拌勻，用文火加 熱，炒至表面色澤加深時(shí)，出鍋，篩去屑，放涼。每凈土鱉蟲100kg，用酥油^g。6、炒制法將凈土鱉蟲置鍋內(nèi)，文火炒至色澤加深時(shí)，取出，放涼。7、土制法取原藥材，用細(xì)土拌勻加文火慢炒至微黃為度，篩去土及雜質(zhì)即可。以上處理方法凡是用到炒制的，全部需用到熱水燙死后曬干的土鱉蟲原藥材；另 有酒制法，因?qū)频囊笪醋⒚?，故酒精濃度不確定，且后期依舊用炒制法，故不可取。而本 發(fā)明土鱉蟲以95%乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干即可。高濃度的乙醇可以快速固定 DNA,且使藥材干燥變迅速，故該種處理方法能夠確保DNA保存完整，無降解，可以滿足分子 實(shí)驗(yàn)的要求。


圖1、土鱉蟲基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，M:15kb DNAMarker ；1 土鱉蟲；2 活血止痛膠囊；3 缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰 性對照。圖2、實(shí)施例1中各樣品16SrRNA擴(kuò)增PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M :2kb DNAMarker ；1 土鱉蟲；2 活血止痛膠囊；3 缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰 性對照。圖3、實(shí)施例2各樣品16SrRNA擴(kuò)增PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，
M :2kb DNAMarker ；1 野生土鱉蟲藥材；2 養(yǎng)殖土鱉蟲藥材；3 野生土鱉蟲制活 血止痛膠囊；4 養(yǎng)殖土鱉蟲制活血止痛膠囊；4 缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰性對照；5 空白對照。圖4、實(shí)施例2中野生(PY)和養(yǎng)殖(DY) 土鱉蟲16SrRNA與GENBANK中的土鱉蟲 (GB) 16SrRNA序列的比對結(jié)果圖，GB :GENBANK收錄土鱉蟲；DY 江蘇丹陽養(yǎng)殖土鱉蟲；PY 山東平邑野生土鱉蟲。圖5、三種方法提取基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，al 傳統(tǒng)蛋白酶K法提取土鱉蟲基因組DNA ；a2 傳統(tǒng)蛋白酶K法提取活血止痛膠 囊中土鱉蟲基因組DNA ;bl 蛋白酶K結(jié)合吸附柱法提取土鱉蟲基因組DNA ;b2 蛋白酶K結(jié) 合吸附柱法提取活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA ；cl 改良蛋白酶K結(jié)合吸附柱法提取土 鱉蟲基因組DNA;c2 改良蛋白酶K結(jié)合吸附柱法提取活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1土鱉蟲藥材中土鱉蟲基因組DNA提取方法活體土鱉蟲是以95%乙醇浸泡3-5min 致死，曬干或烘干后粉碎至80目。取適量(約0. lg，研磨移入2mL離心管中不超過0. 5刻 度)土鱉蟲藥材粉末，放入研缽，加勻漿緩沖液研磨至成糊狀，轉(zhuǎn)入2mL離心管，補(bǔ)加勻漿 緩沖液至lmL，混勻。58°C水浴證，期間每隔半小時(shí)輕輕顛倒混勻。水浴結(jié)束后，冷至室 溫。加等體積的飽和酚三氯甲烷異戊醇05 24 1)，緩慢顛倒混勻，8000r/min離 心lOmin，上清轉(zhuǎn)移至新離心管中。重復(fù)該步抽提至水層與酚層中間無蛋白層。上清加等 體積的三氯甲烷異戊醇04 1)，緩慢顛倒混勻，8000r/min離心lOmin。上清轉(zhuǎn)移至膠 回收試劑盒(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)的吸附柱 中，靜置:3min使充分吸附，12000r/min離心lmin，棄濾液。按試劑盒說明書，依次用buffer Wl、W2洗滌DNA。將吸附柱置37 °C烘箱揮干乙醇，置1. 5mL離心管中，加20 μ L無菌水，靜 置lmin，充分洗脫DNA，12000r/min離心lmin，棄吸附柱，即得純化的土鱉蟲藥材基因組DNA 溶液。-20°C保存。活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA提取方法取活血止痛膠囊內(nèi)容物適量(約 0. Ig,研磨移入2mL離心管中不超過0. 5刻度)，放入研缽，加勻漿緩沖液研磨至成糊狀， 轉(zhuǎn)入2mL離心管，補(bǔ)加勻漿緩沖液至lmL，混勻。58°C水浴5h，期間每隔半小時(shí)輕輕顛倒混 勻。水浴結(jié)束后，冷至室溫。加等體積的飽和酚三氯甲烷異戊醇05 24 1)，緩慢 顛倒混勻，8000r/min離心lOmin，上清轉(zhuǎn)移至新離心管中。重復(fù)該步抽提至水層與酚層中 間無蛋白層。上清加等體積的三氯甲烷異戊醇04 1)，緩慢顛倒混勻，8000r/min離心 IOmin0上清轉(zhuǎn)移至膠回收試劑盒(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州) 有限公司)的吸附柱中，靜置:3min使充分吸附，12000r/min離心lmin，棄濾液。按試劑盒 說明書，依次用buffer Wl、W2洗滌DNA。將吸附柱置37°C烘箱揮干乙醇，置1. 5mL離心管 中，加20 μ L無菌水，靜置lmin,充分洗脫DNA, 12000r/min離心lmin,棄吸附柱，即得純化 的活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA溶液。-20°C保存。上述活血止痛膠囊的制備方法見中國藥典2005版第一部，其中土鱉蟲是以95% 乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干后入藥。
勻漿緩沖液組成由8份A液，1份B液，1份C液組成(用時(shí)新鮮配制)。A液 Tris (pH8. 0)0. 05mol 'T1jNaCl 0. Imol ·Γ1，EDTA(pH8. 0)0. Imol .171 ；B 液5% SDS ；C 液 ang/mL蛋白酶K。取土鱉蟲藥材、活血止痛膠囊及缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰性對照按照上述方法 提取土鱉蟲基因組DNA，所得土鱉蟲基因組DNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。 由圖1可見本發(fā)明基因組DNA提取方法可從土鱉蟲藥材與活血止痛膠囊中成功提取到土 鱉蟲基因組DNA。以16Sra(SEQ ID NO. 1)和16Srb (SEQ ID NO. 2)為引物，分別以上述從土鱉蟲藥 材、活血止痛膠囊及缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰性對照中提取的土鱉蟲基因組DNA為模 板，PCR擴(kuò)增土鱉蟲的16S rRNAo PCR擴(kuò)增體系為總體積25 μ L, dNTPs (10mmol/L) 2 μ L, IO^aqbuffer (含 Mg2+) 2· 5 μ LJaq 酶 0. 6U，引物(5ymol/L)各 1 μ L，DNA 模板 1 μ L，雙蒸 水補(bǔ)足體積，最后加IOyL礦物油。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C復(fù)性 lmin, 72°C延伸90s, 35個(gè)循環(huán)后再72°C延伸IOmin0PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。圖2顯示從土鱉蟲藥材及活 血止痛膠囊中均能成功獲得420bp左右的目的條帶，而缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰性對照 則不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。可見本發(fā)明方法不僅可用于土鱉蟲藥材的鑒定，還可用于活血止 痛膠囊中土鱉蟲的鑒定。實(shí)施例2取野生(PY)和養(yǎng)殖(DY) 土鱉蟲以95%乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干，分別 得到野生(PY)和養(yǎng)殖(DY) 土鱉蟲藥材；取土鱉蟲藥材按照藥典方法制成活血止痛膠囊，取 按照實(shí)施例1方法分別提取土鱉蟲基因組DNA。其中；野生土鱉蟲(活體)，采集于山東平 邑；養(yǎng)殖土鱉蟲(活體)，購自江蘇丹陽。以16Sra(SEQ ID NO. 1)和16Srb (SEQ ID NO. 2)為引物，以提取的土鱉蟲基因組 DNA為模板，PCR擴(kuò)增土鱉蟲的16S rRNA。PCR擴(kuò)增體系為總體積25 μ L，dNTPs (lOmmol/ L)2y L, 10*Taq buffer (含 Mg2+) 2· 5 μ L，Taq 酶 0· 6U，引物(5ymol/L)各 1 μ L，DNA 模板 1 μ L，雙蒸水補(bǔ)足體積，最后加10 μ L礦物油。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s， 50°C復(fù)性lmin，72°C延伸90s，;35個(gè)循環(huán)后再72°C延伸IOmin0PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可見，野生(PY)和養(yǎng) 殖(DY) 土鱉蟲、野生(PY)和養(yǎng)殖(DY) 土鱉蟲制成的活血止痛膠囊，均能成功獲得420bp左 右的目的條帶，而缺土鱉蟲的活血止痛膠囊陰性對照和空白對照均不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。對目的條帶切膠回收，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，回收產(chǎn)物送交金斯瑞 生物科技有限公司測序，得到野生(PY)和養(yǎng)殖(DY) 土鱉蟲的16S rRNA序列總長度分別為 374bp、378bp。所測序列已被GENBANK收錄，登錄號見表1，與GENBANK中的土鱉蟲(GB)序 列的比對結(jié)果見圖4。比對結(jié)果顯示各堿基頻率差異較大，其中A+T含量為67.5%，G+C 含量為32. 5%，土鱉蟲的16SrRNA序列富含AT堿基，這與昆蟲的16S序列富含AT堿基的報(bào) 道一致。且變異位點(diǎn)全部為堿基的轉(zhuǎn)換。三種土鱉蟲的相似度為98. 9% 99.2%，平均相 似度為99. 1%。種內(nèi)相似度高，野生與養(yǎng)殖差異不大。可見本發(fā)明提供的分子鑒定方法能夠適用于活血止痛膠囊中土鱉蟲的鑒定與檢 測。并且該鑒定方法不受土鱉蟲產(chǎn)地的影響，因此本方法可用于鑒定不同產(chǎn)地的土鱉蟲制備的活血止痛膠囊。表1序列登錄號
權(quán)利要求
1.一種土鱉蟲藥材的分子鑒定方法，包括(1) 土鱉蟲藥材中基因組DNA的提取純化步 驟；(2) PCR擴(kuò)增土鱉蟲16SrRNA步驟；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定和/或測序鑒定步驟；其特征 在于(1)土鱉蟲藥材中基因組DNA的提取純化步驟采用改良蛋白酶K結(jié)合吸附柱法先利 用傳統(tǒng)的蛋白酶K法初步提取土鱉蟲藥材中基因組DNA，然后加等體積的飽和酚三氯甲 烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積的三氯甲烷異戊醇抽提，所 得上清轉(zhuǎn)移至膠回收試劑盒的吸附柱中按照傳統(tǒng)的吸附柱法純化DNA ；(2)所述的PCR擴(kuò)增土鱉蟲16SrRNA步驟是利用引物16Sra=SEQ ID NO. 1和16Srb SEQID NO. 2對步驟(1)提取純化的土鱉蟲藥材中基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；(3)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定步驟是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果 能擴(kuò)增出420bp左右的條帶則表示土鱉蟲藥材含有土鱉蟲成分；或者對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 測序鑒定，通過序列比對，鑒定土鱉蟲藥材真?zhèn)?、土鱉蟲的種類或產(chǎn)地。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土鱉蟲藥材的分子鑒定方法，其特征在于所述的土鱉蟲藥材 是經(jīng)以95%乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土鱉蟲藥材的分子鑒定方法，其特征在于所述的土鱉蟲藥材 中基因組DNA的提取純化具體步驟為取粉碎至80 100目的土鱉蟲藥材粉末加勻漿緩沖 液，50 60°C水浴4 他，水浴結(jié)束后，冷至室溫，加等體積的體積比為25 24 1的飽和 酚三氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積的體積比為M 1 的三氯甲烷異戊醇抽提一次，上清轉(zhuǎn)移至常規(guī)膠回收試劑盒的吸附柱中，按照說明書記 載的方法獲得純化的土鱉蟲藥材基因組DNA溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的土鱉蟲藥材的分子鑒定方法，其特征在于所述的勻漿緩沖液 組成由8份A液，1份B液，1份C液組成，其中A液pH8. 0的Tris 0. 05mol · Γ1，NaCl 0. Imol · ΙΛ ρΗ8· 0 的 EDTA 0. Imol · Γ1 ；B 液5% SDS ；C 液2mg/mL 蛋白酶 K。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土鱉蟲藥材的分子鑒定方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增 體系為總體積 25yL，10mmol/L dNTPs 2 μ L, IOXTaq buffer 2· 5 μ L，，Taq 酶 0. 6U， 5^11101/1引物1651^和16Srb各lyL，步驟(1)提取純化的土鱉蟲藥材基因組DNA溶液 1 μ L，雙蒸水補(bǔ)足體積至25 μ L，最后加10 μ L礦物油；反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C 變性30s，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸90s，35個(gè)循環(huán)后再72°C延伸IOmin0
6.一種活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法，包括(1)活血止痛膠囊中土鱉蟲基因 組DNA的提取純化步驟；(2) PCR擴(kuò)增土鱉蟲16SrRNA步驟；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定和/或測 序鑒定步驟；其特征在于(1)所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA的提取純化步驟采用改良蛋白酶K結(jié)合 吸附柱法先利用傳統(tǒng)的蛋白酶K法初步提取活血止痛膠囊基因組DNA，然后加等體積的飽 和酚三氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積的三氯甲烷異 戊醇抽提，所得上清轉(zhuǎn)移至膠回收試劑盒的吸附柱中按照傳統(tǒng)的吸附柱法純化DNA ；(2)所述的PCR擴(kuò)增土鱉蟲16SrRNA步驟是利用引物16Sra=SEQ ID NO. 1和16Srb SEQID NO. 2對步驟(1)提取純化的活血止痛膠囊基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；(3)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定步驟是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果 能擴(kuò)增出420bp左右的條帶則表示活血止痛膠囊中含有土鱉蟲組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法，其特征在于所述的 活血止痛膠囊中的土鱉蟲是經(jīng)以95%乙醇浸泡3-5min致死，曬干或烘干后入藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法，其特征在于所述的 活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA的提取具體步驟為取活血止痛膠囊內(nèi)容物加勻漿緩沖 液，50 60°C水浴4 他，水浴結(jié)束后，冷至室溫，加等體積的體積比為25 24 1的飽和 酚三氯甲烷異戊醇抽提至水層與酚層中間無蛋白層，上清加等體積的體積比為M 1 的三氯甲烷異戊醇抽提一次，上清轉(zhuǎn)移至常規(guī)膠回收試劑盒的吸附柱中，按照說明書記 載的方法獲得純化的活血止痛膠囊中土鱉蟲基因組DNA溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法，其特征在于所 述的勻漿緩沖液組成由8份A液，1份B液，1份C液組成，其中A液pH8. 0的Tris 0. 05mol · ΙΛ NaCl 0. Imol · Λ ρΗ8· 0 的 EDTA 0. Imol · L-1 ；B 液5% SDS ；C 液2mg/mL 蛋白酶K。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法，其特征在于所述 的 PCR 擴(kuò)增體系為總體積 25μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L, IOXTaq buffer 2.5yL，Taq 酶 0. 6U，5 μ mol/L引物16Sra和16Srb各1 μ L，步驟(1)提取純化的活血止痛膠囊基因組DNA 溶液ι μ L，雙蒸水補(bǔ)足體積至25 μ L，最后加10 μ L礦物油；反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min， 94°C變性30s，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸90s，35個(gè)循環(huán)后再72°C延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥復(fù)方制劑鑒定領(lǐng)域，公開了一種土鱉蟲藥材及活血止痛膠囊中土鱉蟲的分子鑒定方法。該方法包括(1)土鱉蟲基因組DNA的提取純化步驟；(2)PCR擴(kuò)增土鱉蟲16S rRNA步驟；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定步驟。通過該方法能夠成功提取土鱉蟲基因組DNA，并擴(kuò)增出土鱉蟲線粒體16S rRNA片段，從而準(zhǔn)確鑒定土鱉蟲的真?zhèn)?、種類、產(chǎn)地以及膠囊中是否含有土鱉蟲。
文檔編號C12Q1/68GK102140521SQ20111002811
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者濮存海, 王云靈 申請人:南京中山制藥有限公司